一個在植物中高效表達的載體的製作方法

2023-04-25 07:47:56

專利名稱：一個在植物中高效表達的載體的製作方法
技術領域：
本發明屬於植物基因工程領域，具體地說，本發明涉及調控目的基因在植物中高效表達的DNA序列，包含所述的DNA序列與報告基因的融合構建體，攜帶該構建體的重組表達載體，以及由所述的表達載體轉化植物外植體所產生的表達外源基因的轉基因植物。
在細胞中，一個基因的轉錄水平主要受其上遊的調控序列(即啟動子)所控制，所以在分子生物學及生物技術研究與應用中，對啟動子的結構和功能的研究一直是一個熱門。但轉錄後mRNA的穩定性及翻譯效率對基因的最終產物-蛋白質的產率，有著非常重要的影響，在翻譯水平上的調控重要程度並不亞於在轉錄水平上。
許多真核生物(包括病毒)的mRNA的非翻譯區序列(UTR)可以通過影響mRNA的穩定性和翻譯效率對調節蛋白表達水平起著重要的作用。本發明中所述的兩段UTR序列來自菸草花葉病毒(TMV)，分別為TMV-RNA的5』端(簡稱Ω片段，為67bp)和3』端(簡稱TMV 3』UTR，為204bp的cDNA)。
TMV的Ω片段能夠提高外源基因的表達[1,2]。這種增強表達的作用不依賴於任何病毒基因的產物，並且在雙子葉植物細胞中的作用比在單子葉中強[3]。Sleat等人認為Ω片段減少了mRNA的二級結構，使得40S核糖體亞基更容易在5』端運動尋找轉錄起始位點，並且使得5』末端與起始因子的相互作用加強了，因而TMV的Ω片段對翻譯有增強作用[4]。這方面的技術已有專利發表(WO87/07644；WILSON；Enhancing translationof mRNA by attaching leader sequence-from--RNA--virus,opt.in form ofcomplementary DNA-,e.g.for improving protein expression in transformedcells.)。
而其RNA的3』端UTR可以形成具有複雜高級結構的五個假結(pseudoknot)。在3』最末端的2個假結形成一個在二級結構上類似tRNA的尾巴，這是病毒複製必需的。緊接這個區的上遊是另外3個假結(UPD)。Gallie等[3、5、11]用原生質體體系研究表明，TMV 3』UTR中UPD的主要作用是提高翻譯效率，其機理與真核生物mRNA的poly A的作用機理相似。
但以上有關TMV UTR區對外源基因表達影響的研究結果都是在離體細胞表達體系中，報導基因在非整合狀態下得到的。本發明中首次用TMV5』UTR和3』UTR構建了植物表達載體，並在植株整體水平上，報導基因在整合狀態下證明TMV 5』UTR與TMV 3』UTR序列能夠增強外源基因的表達，而且證明兩個序列共同作用較單獨使用5』UTR更能增強外源基因的表達。所以，本發明所構建的表達載體pBin440對於研究嵌合基因在整體植物中表達的影響能夠更準確地反映TMV UTR在體內的真實作用，它應該是一個新的在植物中高效表達的載體。
TMV-外殼蛋白(CP)基因的克隆pGT114含有外殼蛋白編碼區及其3』端非翻譯區[6]。以PCR方法獲得TMV 3』UTRDNA序列(兩端分別有SalⅠ及SacⅠ的酶切位點)，經SalⅠ及SacⅠ酶解，將其插入質粒pD513，而構建成pD515；最後經HindⅢ及EcoRⅠ酶解插入pBin438[7]，得到植物高效表達載體pBin440。
下文所要敘述的實施例揭示本發明人獲得的植物表達載體(


圖1A)能夠在植物中高效表達報告基因以及其他目的基因。
本發明將首次構建的植物表達載體pBin440與β-glucuronidase(GUS)報告基因的編碼區核苷酸序列相融合產生了在植物表達中的重組質粒pBG440，並將這兩種重組質粒分別轉化入埃西氏大腸桿菌(Escherichia coli DH5α)和土壤農桿菌(Agrobacterium tumefaciensLBA4404)產生了重組微生物。含有pBin440的埃西氏大腸桿菌(Escherichia coli DH5α)轉化子已保藏到中國微生物菌種保藏保藏管理委員會普通微生物中心，保藏菌種號為CGMCC No.0444。
為了證明新的植物表達載體pBin440中TMV 3』UTR對提高外源基因在植物中表達水平的作用，本發明利用GUS基因及TMV-RNA非翻譯區序列構建了另三種GUS基因的植物表達載體，pBG437(不含TMV 5』UTR和3』UTR),pBG438(僅含TMV 5』UTR)和pBG440 ΔNOS(除不含NOS終止子，其他與pBG440相同)，將重組質粒分別轉化入埃西氏大腸桿菌(Escherichia coli DH5α)和土壤農桿菌(Agrobacterium tumefaciensLBA4404)產生了重組微生物。用葉盤轉化法在含有重組質粒pBG440等的土壤農桿菌的介導下將上述各嵌合GUS基因分別導入植物染色體產生了轉基因植物。
本發明涉及調控目的基因編碼區的核苷酸序列在植物細胞內高效表達的載體。所述的「植物細胞內高效表達」指在植物細胞的表達水平顯著高於無TMV UTR序列的植物表達載體，如pBin437、pBin438(缺3』UTR)等等。
本發明所構建的植物表達載體利用TMV 5』UTR與3』UTR共同作用以增強插入在這兩個序列之間的外源基因在植物體內的表達水平，並第一次在整體植株水平上證明該片段具有增強基因表達的功能。所以本發明中的植物表達載體pBin440應是一個新的植物高效表達載體。
結合下列附圖對本發明予以詳細說明
圖1A:pBin440的結構圖。 204bp TMV 3』UTR DNA 來自pBR322的BamHⅠ-SalⅠ277bp片段 TMV 5』UTR箭頭指基因的轉錄方向LB-T-DNA左邊界序列Knr-在細菌中表達的卡那黴素抗性基因RB-T-DNA右邊界序列NPTⅡ-新黴素磷酸轉移酶基因，在植物Sc-SacⅠ 中表達對卡那黴素的抗性。
SL-SalⅠBm-BamHⅠHd-HindⅢRI-EcoRⅠRK2-RK2複製起點DE35S-帶雙增強子的CaMV 35S啟動子*該圖各部分未按比例畫出，僅為示意圖。
圖1B植物表達載體pBG437、pBG438、pBG440和pBG440ΔNOS的構建。
圖2四種不同結構的GUS基因瞬間表達的平均活性(單位pmolMU/min/ug提取總蛋白)。
圖3轉基因菸草GUS活性的分布。
圖4轉基因菸草的GUS平均比活性。
圖5部分再生植株的PCR結果。
實施例1．完整TMV 3』UTR序列的獲得TMV外殼蛋白(CP)基因克隆pGT114含有CP基因編碼區和3』非編碼區[6]。根據3』非編碼區序列，設計合成了以下PCR引物UT5:5』CGGTCGACGGTAGTCAAGATGCATAATAAAT 3』31merUT3:5』CTGAGCTCTGGGCCCCTACCGGGGGTAA3』28merPCR反應混合物總體積50ul，含有pGT114DNA～10ng，引物UT5和UT3各5ul，使最終濃度達1umol/L，緩衝液(500mM KCl,100mM Tris-HCl,pH8.8,15mM MgCl2,30mM DTT,1mg/ml BSA)5ul,2mM dNTP 5ul,2U Tag DNA Polymerase。反應在94℃預變性3分鐘，然後以94℃變性30秒，56℃復性1分鐘，72℃延伸30秒，共30個循環。反應混合物經酚/氯仿抽提一次後，用兩倍體積的乙醇在-20℃沉澱一小時以上，離心回收PCR產物。從而得到全長204bp的TMV 3』UTR片段，其序列為
GGTAGTCAAGATGCATAATAAATAACGGATTGTGTCCGTAATCACACGTGGTGCGTACGATAACGCATAGTGTTTTTCCCTCCACTTAAATCGAAGGGTTGTGTCTTGGATCGCGCGGGTCAAATGTATATGGTTCATATACATCCGCAGGCACGTAATAAAGCGAGGGGTTCGAATCCCCCCGTTACCCCCGGTAGGGGCCCA2．植物表達載體pBin440及pBG440等的構建DNA的酶解、片段分離純化及連接反應按Ausubel等人的「CurrentProtocols in Molecular Biology」一書所述的方法進行。為了將3』UTR片段插入到pBin438的表達框架中，首先用HindⅢ和EcoRⅠ將pBin438中由雙增強子的CaMV 35S啟動子-TMV「Ω」片段-來自pBR322的BamHⅠ-SalⅠ的一段DNA填充物-Nos 3』終止序列組成的表達框切下後，與用BamHⅠ和EcoRⅠ酶解的pUC19連接，即得到重組質粒pD513。上述pGT114的PCR產物經SacⅠ和SalⅠ酶解後，與用同樣酶解的pD513連接可構建成pD515,pD515與pD513不同之處僅在於pD515在Nos終止序列的5』端插入了TMV UTR序列。以Nos 3』端序列為負鏈引物、用Pharmacia公司的T7DNA Sequencing Kit進行序列分析的結果證明，pD515中所插入的UTR序列是正確的。用HindⅢ和BamHⅠ酶解PCR產生的UTR DNA片段與同樣酶解的pBin438[7]所得的載體DNA連接，即得到重組質粒pBin440，一個新的二元表達載體，或稱之為一個新的植物表達載體。pBin440的結構見
圖1。任何外源基因經適當酶切插入到該表達載體的上述表達框中，在植物中都可能實現高效表達。在pBin440中，我們用了CaMV 35S啟動子及Nos 3』端終止序列來調控由TMV 5』和3』端UTR序列所連接的外源基因(GUS)的表達。但並不排斥用其他植物強啟動子和其他轉錄終止序列來取代上述啟動子及轉錄終止序列以實現TMV UTR序列提高外源基因表達水平的作用。
為了證實TMV UTR在整體植物中可提高外源基因表達效率的可能性，本發明還用從p35SGUSINT分離的、帶有一個內含子的GUS基因，分別與pBin440、pBin438和pBin437構建了GUS嵌合基因表達載體pBG440、pBG438、pBG437以及將pBin440中的Nos 3』端序列切除後構建成的pBG440ΔNOS。這些表達載體的構建過程參見
圖1B。
3．轉基因植物的產生
1．轉化土壤農桿菌以鹼變性法(J.Sambrook et al.,Molecular cloning,A LaboratoryManual,2nd ed,Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989)製備pBG437,pBG438,pBG440和pBG440ΔNOS質粒，用液氮凍融轉化法(賈盤興，蔡金科等微生物遺傳學實驗技術北京科學出版社1992 108-109)將上述質粒轉入土壤農桿菌LBA4404，然後以PCR和酶切篩選克隆。
2．植物轉化用葉盤法(Horsch,R.B.et al.,Science 227,1229-1231,1985)將pBG437,pBG438,pBG440和pBG440ΔNOS的土壤農桿菌克隆分別轉化菸草(NC89)。通過卡那黴素抗性篩選獲得菸草再生植株。
3．農桿菌介導的嵌合GUS基因的瞬間表達(1)瞬間表達用溫室培養的長到10-12片葉的本名煙(Nicotianabenthamiana)。
(2)從新劃的平板上挑取農桿菌單菌落，接種到5mL LB培養基中(含Kn 50ug/mL),28℃,300r.p.m，搖床培養過夜，取1mL加到50mL同樣(含Kn50ug/ul)培養基中，28℃300r.p.m搖過夜。然後以4000r.p.m,4℃離心收集菌體，再將菌體懸浮，使最終濃度為O.D600至1.5，靜止放置在室溫下3hr。在同一植株的不同葉片上分別注射4種農桿菌溶液，使農桿菌液浸潤整個葉片，以LBA4404菌懸液為空白對照。3-5天內按Jefferson的方法檢測注射過的葉片的GUS比活性。
4．轉基因菸草的PCR檢測取1ul小規模提取的菸草DNA為模板，在20μl PCR反應體系(dNTP最終濃度為每種0.2mmol/l，用NOS正鏈引物和GUS負鏈引物，濃度為0.5μmol/l)中94℃變性4分鐘，然後以94℃1分鐘，55℃1分鐘，72℃1分鐘進行30個循環反應，反應產物於1％瓊脂糖凝膠電泳觀察、照相。
引物序列如下GUS負鏈引物5』ATCGAAACGCAGCACGATAC 3』NOS正鏈引物5』CGCGGTGTCATCTATGTTAC 3』
PCR結果請參見圖-5。
結果顯示所有GUS反應為陽性的植株在PCR反應中都可擴增出一條GUS基因特異的DNA片段，表明pBG440中的GUS基因表達框已與T-DNA一起整和到菸草的基因組上。
5．轉基因菸草的GUS活性分析(1)菸草總可溶性蛋白的提取參照Jefferson等[9、13](Jefferson R A,Kavanagh T A,Beven M W.EMBO Journal,1987,6:3901-3907.Jefferson R A,Plant Molecular BiologyReporter,1987,5:387～405)和Promega公司的螢光素酶分析系統(Luciferage Assay System,E1500,Promega Technical Bulletin)的方法提取菸草葉片或葉脈的總可溶性蛋白取50mg菸草葉片或葉脈組織，經液氮冷凍研磨後，加入200ul蛋白提取液(25mmol/L Tris-phosphate,pH7.8,2mmol/L DTT,2mmol/L 1,2-diamino cyclohexane-N,N,N′,N′-tetraaceticacid,10％glycerol和1％Triton X-100)，混勻，4℃離心(12,000rm,2min.)，取上清液即為菸草總可溶性蛋白提取液。蛋白濃度的測定採用Bio-Rad ProteinⅡ測定液，按廠家提供的方法進行。
2．GUS活性檢測參照顧紅雅等所述[10]，取10ul步驟1中製備的菸草葉片或葉脈的總可溶性蛋白提取液與90ul GUS反應液(在步驟1所述蛋白提取液中加入1mmol/L 4-甲基傘形酮醯-葡萄糖醛酸苷，即4-MUG和10mmol/Lβ-巰基乙醇即為GUS反應液)混勻，在37℃保溫反應。每一種樣品設置2個反應時間，即分別在20′和30′時各加入900ul 0.2mol/L的Na2CO3溶液終止反應。以0.2mol/L的Na2CO3溶液製備0.2umol/L的4-甲基傘形酮(4-MU)作為螢光標準物，使用Hoefer Pharmacia生物技術公司生產的螢光計(DyNA QuantTM200 Fluorometer)在激發光365nm，發射光455nm條件下測螢光。在正式測量之前，先用系列稀釋濃度的標準物4-MU測量螢光值，作出標準曲線，確定螢光值與4-MU濃度的線性範圍。測量轉基因植物時，用每個樣品的測量螢光值從標準曲線查出生成的4-MU的含量，作出不同時間對應於4-MU的函數曲線，求出每分鐘生成的4-MU的含量，再除以每個樣品的總可溶性蛋白量，即為GUS活性，最後單位為「4-MU pmol./min.ug total protein」。
6．結果與討論(1)瞬間表達結果表明轉化pBG440(35S-Ω-GUS-UTR-NOS)的葉片GUS活性最高，GUS平均比活性是pBG437(35S-GUS-NOS)的6.6倍，是pBG438的(35S-Ω-GUS-NOS)1.4倍；轉化pBG438的葉片的平均比活性是pBG437的4.7倍；pBG440ΔNOS沒有檢測到GUS活性。(圖-2)(2)經農桿菌法轉化菸草獲得了一批轉化再生植株。經PCR分析，GUS組織化學染色及GUS比活定量測定表明這四種類型的嵌合基因已經整合到菸草染色體上，除轉pBG440ΔNOS的菸草植株外其它轉基因植物都有GUS的表達。GUS平均比活性轉pBG440植株的是轉pBG437的5倍，是轉pBG438的1.6倍，轉pBG438的是轉pBG437的3.2倍。(圖-3)因為GUS基因在菸草基因組中插入位置的不同，對其表達水平有很大的影響，造成個體之間表達水平差異很大。通過儘量擴大樣本量，可使得系統中單個樣本對結果的影響減小，取得更為準確可信的結果。本發明研究了所獲得的pBG437轉化再生菸草50株，pBG438的95株，pBG440的116株，pBG440ΔNOS的80株。對每一植株進行GUS比活性定量測定後，獲得GUS有表達的pBG437為33株，佔總再生植株的66％；pBG438為50株，佔53％,pBG440為81株，佔70％,pBG440表達GUS活性的植株比例稍高於其它類型的比例，可能是這一類型的GUS基因的表達水平高造成的。但總的看表達GUS活性的植株佔總再生植株的百分比差別不大，表明四個構建的轉化條件較一致，轉化效率相似。轉pBG440ΔNOS的植株雖PCR為陽性但沒有檢測到GUS表達。從表1的顯著性分析[11]可得知，pBG437,pBG438,pBG440之間GUS活性的差異是顯著的，反映了四種不同結構對GUS表達水平的真實影響，而並非實驗中誤差所至。從圖3可見轉pBG440的菸草表達GUS活性高的(＞30pmolMU/min/ug總蛋白)所佔的比例最大，轉pBG438的GUS活性高的植株佔的比例高於轉pBG437的菸草，相應的GUS低水平表達的植株(1-10pmol MU/min/ug總蛋白)中，轉pBG437的比例最高，轉pBG440的最低。從圖4也可看出轉pBG440的平均GUS比活性最高，是轉pBG438的1.6倍，是轉pBG437的5倍，轉pBG438的平均GUS比活性明顯高於轉pBG437的，是轉pBG437的3.2倍。
表1
GUS活性單位pmol MU/min/ug total protein.
*差異顯著；--不顯著；本發明從瞬間表達和轉基因植物兩個方面，第一次對TMV-RNA的非翻譯區對嵌合GUS基因在整體植物中表達的影響作了較系統的研究，證明在整合狀態下，TMV-RNA的3』UTR區可以與5』端的UTR序列(即Ω片段)共同作用，從而明顯地提高插在這兩個UTR序列之間的外源基因的表達水平。在pBin440中，發明人使用了CaMV35S啟動子和NOS 3』終止序列來調控外源基因的轉錄，這裡不排除用其他轉錄調控序列也可取得類似的效果。以上結果證明本發明構建的植物表達載體pBin440確實為一個高效表達載體，它在植物基因工程研究以及轉基因植物的開發運用方面具有重要的運用價值。
總之，本發明所構建的植物表達載體pBin440與報告基因融合構建成植物表達載體pBG440，通過農桿菌介導轉化雙子葉植物，能夠高效表達目的基因，該植物表達載體對於植物的抗蟲、抗病等基因工程的開發利用，有著廣泛的應用前景。
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1．一種植物表達載體，其特徵在於啟動子下遊含有TMV 5』UTR(Ω)和轉錄終止序列上遊含有如下式所述的TMV 3』UTR-RNA3』非翻譯區的204bp核苷酸的序列。GGTAGTCAAGATGCATAATAAATAACGGATTGTGTCCGTAATCACACGTGGTGCGTACGATAACGCATAGTGTTTTTCCCTCCACTTAAATCGAAGGGTTGTGTCTTGGATCGCGCGGGTCAAATGTATATGGTTCATATACATCCGCAGGCACGTAATAAAGCGAGGGGTTCGAATCCCCCCGTTACCCCCGGTAGGGGCCCA。
2．根據權利要求1中所述的一種植物表達載體，它是在pBin438的基礎上構建的。
3．一種重組微生物，含有權利要求1、2所述特徵的植物表達載體。
4．根據權利要求3所述的重組微生物，是一種大腸桿菌(Escherichia coli)DH5α。
5．根據權利要求4所述的重組微生物，其保藏登記號為CGMCCNo.0444。
6．根據權利要求3所述的重組微生物是根癌土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)LBA4404。
全文摘要
利用菸草花葉病毒(TMV)RNA的非翻譯區序列(UTR)構建植物高效表達載體pBin440,包含所述的UTR序列與GUS報告基因的融合基因構建體,用所說的構建體轉化植物外植體所產生的高效表達外源基因(GUS)的轉基因植株。
文檔編號C12N15/74GK1315582SQ0010356
公開日2001年10月3日 申請日期2000年3月24日 優先權日2000年3月24日
發明者田穎川, 秦紅梅, 郭洪年 申請人:中國科學院微生物研究所