用於變態反應的預防和/或治療的化合物和方法

2023-05-15 17:30:36 1

專利名稱：用於變態反應的預防和/或治療的化合物和方法
技術領域：
本發明涉及用於變態反應和/或變應性源疾病，特別是速髮型超敏反應變態反應的預防和/或治療的新的化合物和新的方法。
速髮型超敏反應由主要屬於但是不專屬於IgE同種型的抗體介導。IgE抗體結合例如嗜鹼性粒細胞，肥大細胞或朗氏細胞這樣的細胞上的特異性受體。接觸變應原時，表面結合的IgE將信號轉導到細胞中，其後是細胞激活，在嗜鹼性粒細胞和肥大細胞情況下，伴隨有預先形成的介體的釋放和花生四烯酸的代謝產物的合成，所述介體是例如組胺和酶。這些介體負責變應反應信號和症狀的發生，例如支氣管痙攣，血管舒張，粘液的分泌過多和導致瘙癢症的感覺神經末梢的刺激。
IgE抗體由接受了合適的激活信號的B淋巴細胞產生。在合適的綜述文章中可以看到有關產生IgE抗體的機理的詳細描述(參見，例如，Vercelli D.,Allergy Proc.14,pp.413-416(1993))。
當前的變應反應症狀的治療包括避免變應原，藥物治療和免疫治療。完全避免變應原接觸是最符合邏輯的方法，但是這樣做非常困難，或者在大多數情況下不可能實現。藥物治療是有用的，減輕症狀但不影響其起因。另外，藥物治療通常受到不期望的副作用的限制。
當前的免疫治療的方法是1)常規的脫敏作用，其是對已經產生敏感性的患者施與逐漸加大劑量的變應原的一種方法；
2)以降低特異性抗體特別是IgE的識別為目的的變應原改變；3)用來幹擾特異性B細胞和T細胞或者包含IgE-結合B細胞表位之間的關聯相互作用的變應原-衍生的肽。
在專利申請WO93/08279中描述了試圖抑制特異性T細胞激活和誘導T細胞不反應狀態的對試驗動物和人使用的包含一個或幾個T細胞表位的這樣的變應原-衍生的肽。
該概念對於人的一個應用是通過對貓敏感個體皮下注射施用FeldⅠ變應原上存在的T細胞表位的序列衍生的一種肽(WallnerB.P.,Gefter M.L.，變應反應(Allergy)49,pp.302-308(1994))。或者，在動物試驗中也使用該概念的互補方法。以這樣一種方法修飾所述的肽使得其保持與特異性B細胞上的Ⅱ類-MHC抗原決定簇結合的能力，但是其喪失了它們激活相應的T細胞的能力(O』Hehir R.E.等，國際免疫學(International Immunology)3,pp.819-826(1991))。
已知變應反應是介體從IgE抗體佔據的具有對於IgE高親和性表面受體的象嗜鹼性粒細胞或肥大細胞這樣的靶細胞釋放時產生的。介體釋放發生的最低要求是識別相同變應原的兩個IgE分子是交聯的，其接著與受體交聯，導致細胞內激活信號的轉導。如果只有一個IgE分子能結合該變應原，沒有接著發生細胞激活，但是該IgE的結合位點被佔據，防止當接觸天然變應原時細胞激活。因此權利要求要求了單個IgE-結合表位是治療變應性疾病的一個合適的途徑的用途(Ball T等，生物化學雜誌(J.Biol.Chem.)269,pp.28323-28328(1994),EP-A-0714662)。本領域狀況美國專利4946945描述了一種在免疫治療中使用的由一種生物反應修飾劑(BRM)和一種變應原組成的蛋白質偶聯物。所述偶聯物可以與藥學可接受載體混合。公開了作為在所述文獻中使用的合適的BRMs的細胞因子，細菌，真菌和病毒免疫增強劑和胸腺激素。
專利申請WO95/31480描述了由具有各種胺基酸特定排列的兩個α-螺旋製備的合成的化合物的製備和應用。所述化合物被用作功能單位尤其是表位B和/或T的結合的載體。定義「特應性」指具有對暴露給變應原反應產生過量屬於IgE同種型免疫系統個體的部分遺傳源的一個誘因。因此存在這樣的特徵的個體稱之為「特應性個體」。
「變應原」定義為一種物質，其通常是蛋白質組分的大分子，其誘發了敏感的優選遺傳上傾向的個體(特應性個體)IgE抗體的產生。
下面的參考文獻給出了類似的定義臨床實驗變態反應(Clin.Exp.Allergy),No.26,pp.494-516(1996)；變態反應和免疫反應的分子生物學(Mol.Biol.of Allergy and Immunology),R.Bush編著，臨床免疫反應和變態反應北美叢書(Immunology and AllergyClinics)(1996年8月)。
這些變應原優選是選自下面的主要變應原-存在於花生，鱈魚，蛋白，大豆，蝦，牛奶和小麥中的食物變應原，-從表皮蟎屬特嗜皮蟎，美洲家刺皮蟎和microceras,Euroglyphus或無爪蟎屬獲得的室內塵埃蟎變應原，-來自存在於蟑螂或膜翅目中的昆蟲的變應原，-來自花粉尤其是樹，草和雜草的花粉的變應原，-存在於動物，尤其是貓，狗，馬和齧齒目的變應原，-存在於真菌，尤其是麴黴屬，鏈格孢屬或枝孢屬的變應原，和-存在於象乳膠，澱粉酶等這樣的產物中的佔領性變應原。
所述變應原也可以是黴菌或各種藥物例如激素，抗生素，酶等中存在的主要變應原。
「變態反應」是特異性個體在遇到其曾經致敏的變應原時發現的信號和症狀的總稱，其可能導致產生各種疾病和症狀，例如變應性鼻炎，支氣管哮喘，特異性皮炎等。
「超敏反應」是指當接觸其變得致敏的抗原時易感個體產生的反應；速髮型超敏反應依賴於IgE抗體的產生，因此等於變態反應。
術語「表位」或「抗原決定簇」指抗原(大分子結構，包括變應原，優選由蛋白質成分組成，但是也可以由藥物活性化合物的一種或幾種半抗原或部分組成)的一部分或幾部分(其可以定義構象表位)，其被B或T淋巴細胞的細胞表面的抗體或受體特異性識別和結合。
本發明涉及一種化合物，包括下面之一-至少一種由非特應性(對所述變應原)個體的B細胞或B細胞分泌的抗體識別的(包括不被特應性個體識別的和被非特應性個體最小識別的隱藏決定簇)並且優選不被T細胞識別的變應原抗原決定簇，和至少一個不同於所述變應原的抗原的抗原決定簇，所述抗原決定簇引發T細胞激活，或者-一個編碼所述兩種抗原決定簇的核苷酸序列，所述序列可能連接到在患者細胞中的活性一個或多個調節序列。
本領域技術人員容易鑑定已知主要變應原中存在的特異性變應原抗原決定簇，其可以選擇被非特應性個體(對所述變應原的非特應性個體)識別的所述變應原的所述表位或抗原決定簇並且其可以是不同於如上所述特應性個體產生抗體的其它表位。類似地，本領域技術人員可以選擇已知引發T細胞激活的任何抗原(不同於所述變應原)的特異性抗原決定簇。優選地，所述抗原不是一種變應原。在下面的實施例中描述了該表位的優選選擇。
根據本發明的化合物會在特應性患者中產生針對不被特應性患者的抗體自發地或者至少最小識別的表位或抗原決定簇的抗-變應原免疫應答的轉變。
在根據本發明的化合物中，所述變應原抗原決定簇和非變應原抗原的抗原決定簇優選是優選通過肽鍵化學鍵合在一起的肽序列(線性串聯形式或支鏈形式)，其優選由至少兩個胺基酸組成。根據本發明的化合物是線性或環形式，有或沒有例如用來阻斷肽-肽相互作用的另外的部分。
有利地，所述變應原選自室內塵埃蟎特嗜皮蟎的Der pⅠ和Der pⅡ,煙麴黴的主要抗原，葡萄球菌B腸毒素(SEB)和牛β-乳球蛋白或下面文獻中描述的變應原臨床實驗變態反應(Clin.Exp.Allergy),No.26,pp.494-516(1996)；變態反應和免疫反應的分子生物學(Mol.Biol.of Allergy and Immunology),R.Bush編著，臨床免疫反應和變態反應北美叢書(Immunology and Allergy Clinicsof North American Series)(1996年8月)。
有利地，根據本發明的化合物中，引發T細胞激活的抗原的抗原決定簇是破傷風類毒素，白喉，分枝桿菌，流感或麻疹病毒抗原的T細胞表位(優選輔助T細胞表位)(文獻WO95/26365的表Ⅱ中描述了所述T細胞表位的其它實施例)。
優選地，根據本發明的化合物選自具有下面胺基酸序列的肽SEO ID NO.1:
QYIKANSKFIGITELGGHEIKKVLVPGCHGSSEO ID NO.2:
HEIKKVLVPGCHGSSEO ID NO.3:
DQYIKANSKFIGITELGGQYIKANSKFIGITELSSCHGSEPCIIHRGKPFGGCHGSEPCIIHRGKPFSSCHGSEPCIIHRGKPFGGCHGSEPCIIHRGKPFSSCHGSEPCIIHRGKPFGGCHGSEPCIIHRGKPFSRSEO ID NO.4:
PKYVKQNTLKLATGKKGPKYVKQNTLKLATGKKGVIIGIKSEO ID NO.5:
QYIKANSKFIGITELGGCHGSEPCNIHRGKPF或者編碼至少一個所述胺基酸序列的核苷酸序列，優選核苷酸序列SEQ ID NO.6:
GAATTCCCACCATGGATCAGTATATAAAAGCAAATTCTAAATTTATAGGTATAACTGAACTAGGAGGTTGCCATGGTTCAGAACCATGTATCATTCATCGTGGTAAACCATTCGGCGGTTGTCACGGAAGTGAGCCTTGCATTATACACAGAGGAAAGCCGTTCTAAGCGGCCGC.
本發明的另一個方面涉及包括根據本發明化合物和藥學，美容，食品和/或飼料可接受載體的藥物，美容，食品和/或飼料組合物。
優選地，所述藥物組合物是一種疫苗，其可以含有一種藥學可接受載體，其可以是適合對患者施用根據本發明的組合物(疫苗)並且獲得期望的治療或預防性質的任何可相容的無毒性物質。適合口服給藥的根據本發明的藥學可接受載體是本領域技術人員公知的那些，例如片劑，包衣或不包衣的丸劑，膠囊，溶液或糖漿。其它合適的藥物載體或賦形劑可以根據給藥方式而不同(皮，表皮，皮下，皮內，吸入，貼，靜脈內，肌內，非經腸的，口服等等)。
當根據本發明的化合物是核苷酸序列時，根據本發明的化合物可以裸施用或者在合適的藥學載體例如用於通過患者細胞將所述序列轉染，轉導和表達的「載體」(包括表達和胞外分泌所述核苷酸序列編碼的肽序列)上。所述「載體」優選選自質粒，病毒(逆轉錄病毒，腺病毒等，)，脂質載體(例如陽離子小泡，脂質體等)，導致轉染細胞的化學或物理修飾的分子或裝置(磷酸葡聚糖，磷酸鈣，微注射裝置，電穿孔裝置等等)或者例如從沙門氏菌或分枝桿菌菌株產生的包含根據本發明化合物的修飾的重組生物體，微型或毫微型顆粒(nanoparticles)形式的製成膠囊的核酸，例如Roy等，自然藥物(Nature Medicine)5,pp.387-391(1999)描述的chirosan等。
本領域技術人員根據基因治療領域公知的方法可以獲得用於來自體內的或體內治療的患者細胞的基因修飾(例如參見文獻WO91/02805,WO/18088,WO91/15501中描述的)。
根據本發明的藥物組合物或疫苗還可以包括本領域技術人員公知的佐劑(包括輔助病毒)，其可以調節患者免疫系統的體液，局部，黏膜和/或細胞應答並且改善根據本發明化合物的應用。
佐劑可以是不同形式，前提是它們適合對人施用。這樣的佐劑的例子是礦物或植物來源的油乳液；無機化合物，例如磷酸鋁或氫氧化鋁，或磷酸鈣；細菌產物和衍生物，例如P40(由粒狀棒狀桿菌的細胞壁產生)，一磷醯脂質A(MPL,LPS的衍生物)和胞壁醯肽衍生物及其綴合物(從分枝桿菌成分衍生)，明礬，不完全弗氏佐劑，liposyn，皂甙，角鯊烯等等。最近GuptaR.K.等(疫苗(Vaccine)11,pp.293-306(1993))和JohnsonA.G.(臨床微生物學綜述(Clin.Microbiol.Rev.)7,pp.277-289(1994))描述了有關用於對人施用的佐劑的綜述。
通過本領域技術人員一般使用的方法，例如用於製備各種藥物組合物，尤其是疫苗的方法，製備根據本發明的藥物組合物，其中活性化合物/藥學可接受載體的百分含量可以在非常寬的範圍內變化(一般一個合適的劑量單位形式包含大約0.005微克至大約1毫克化合物/千克患者體重)，只是受患者對該化合物的耐受性和accointance水平的限制。這些限制由給藥頻率和要治療的具體疾病或症狀具體確定。
優選地，藥物組合物中存在的化合物的濃度使至少減輕或抑制變態反應或變應性源的疾病的信號和症狀(優選速髮型超敏反應變態反應的信號和症狀)。
根據本發明的美容組合物可以含有根據施用的具體方式選擇的任何美容可接受載體。例如，用於皮膚衛生，所述美容組合物可以是膏，軟膏或香膏形式的產品。
根據本發明的食品或飼料組合物可以是包括其中包括根據本發明化合物的常規液體食品或飼料成分的任何食品，飼料或飲料可接受載體。
本發明的另一方面涉及根據本發明的化合物作為藥物的應用。
本發明還涉及根據本發明的化合物或根據本發明的藥物組合物製備預防和/或治療變態反應或變應性源疾病，特別是速髮型超敏反應變態反應的藥物的應用。
本發明的另一方面涉及變態反應或變應性源疾病，特別是速髮型超敏反應變態反應的預防和/或治療方法，包括下面步驟為了有利地誘發或提高對不被特應性個體免疫系統自發識別的或者只是最小識別的變應原的抗原決定簇的抗體的產生，對患者，優選人患者，尤其是對於變應原有特應性的個體施用根據本發明的化合物或藥物組合物。
這些疾病包括變應性源的鼻炎和竇炎，支氣管哮喘，特應性皮炎，一些形式的急性和慢性蕁麻疹，與食物變應原例如β-乳球蛋白攝入相關的腸胃綜合症，相同源的稱之為口咽的綜合症，與藥物超敏反應相關的過敏反應。
參照公開的附圖在下面的實施例中描述本發明。這些實施例是非限制性的對本發明的各種實施方案的舉例說明。
本發明的詳細描述特應性以及非特應性受試者對環境變應原產生抗體。這些抗體屬於迄今為止所述的所有同種型，包括IgE(Saint-Remy J.M.R.等，免疫學雜誌(J.Immunol.)43,pp.338-347(1988))。通常發現特應性個體比非特應性個體多產生10至100-倍的IgE，這可以至少部分解釋當遇到其致敏的變應原時特應性個體會出現症狀。
出人意料地發現特應性個體的抗體識別的例如Der pⅠ和Der pⅡ-室內塵埃蟎特嗜皮蟎的兩個主要變應原-這樣的變應原的抗原決定簇與非特應性個體識別的那些不同。通過使用一系列小鼠產生的抗純化的Der pⅠ或Der pⅡ分子的單克隆抗體得出該結論。在一個競爭免疫測定中，本發明人確定了來自特應性個體的抗變應原抗體識別一些抗原決定簇，同時非特應性個體產生的抗變應原抗體識別其他決定簇。此外，他們證明自發性地或者作為治療的結果改善變應性症狀的特應性患者開始產生對非特應性個體識別的那些決定簇的抗體，同時減少初始抗體的產生。
本發明涉及從非特應性個體產生的抗體識別的變應原分子的區域或者可能地從不誘發自發抗體應答的區域衍生的肽的用途。對特應性個體施用所述肽導致特異性抗體的產生。不管什麼時候患者自然接觸變應原時這樣的抗體將結合變應原，作為結果將限制患者自發產生的抗體的機會。一些特應性患者另外產生一小部分抗非特應性個體識別的抗原決定簇的抗體。在這種情況下，施用所述肽將提高這樣的抗體的比例以使得他們在抗變應原免疫應答中佔優勢。
因此本發明的目的是提供一種方法，通過該方法所述抗變應原免疫應答改向針對特應性患者產生的抗體不自發識別或者只是最小識別的表位。
作為本發明目的的免疫方法提供了比其他方法好的幾個優點。
首先，根據本發明的免疫方法是安全的，因為使用的肽不帶有IgE抗體可以識別的決定簇，因此不具有誘導過敏反應的能力。該性質與使用其天然或改變形式的全變應原分子的免疫方法相反。
其次，根據本發明需要的免疫材料的量和注射次數與可替代的免疫治療策略相比大大降低，因為以下原因(1)因為本發明製備的肽不含有IgE結合決定簇，立刻可以給予免疫原性劑量的肽，這因此顯著縮短治療的期限長度。混合或相伴施用一種佐劑可以提高肽的免疫原性，可能進一步將注射次數(和需要的材料的量)減少至一次。
(2)因為特應性個體事實上可以產生少量指向非特應性個體識別的表位的抗體，注射本發明獲得的肽因而加強再次免疫應答(再次免疫應答將導致比初次免疫應答高得多的抗體滴度的產生)；(3)因為肽的施用在早期階段改變對變應原的免疫反應，即變應原識別，通過抗原呈遞的細胞處理並且呈遞給T細胞，有限量的材料即是實現本發明目的的全部。
上述特徵代表比常規脫敏作用好的確定的優點，所述常規脫敏作用得施藥幾個月或幾年並且使用大量的變應原。在可替代的治療中，例如使用肽使T細胞無反應，治療需要大得多的量的游離的肽來補償肽分解代謝的高速度，需要反覆給藥來保持無反應狀態。
第三，通過本發明治療的患者連續接觸自然環境中存在的變應原足以保持對相應於用來免疫的肽的抗原決定簇的免疫應答。實際上獲得了實驗證據證明用從一種抗原衍生的肽免疫的小鼠基於整個抗原的隨後攻擊時保持它們對該肽的反應性(克隆優勢現象(clonaldominance phenomenon))(Benjamini E.等，免疫學雜誌(J.Immunol.)141,pp.55-63(1988)和SchutzeM.P.等，免疫學雜誌(J.Immunol.)142,pp.2635-2640(1989)及公開的

圖1)。
根據本發明的方法也代表比其他治療方法好的明確的優點，通過該其它方法尋求對新的抗原決定簇的變應原的耐受性而不是免疫。在前一種情況下，需要反覆施用耐受原來保持不反應狀態。
本發明作用的精確方式還沒有完全闡明。
可以被抗體識別的變應原上的可能的抗原決定簇的數目很大。但是，變應原通常是小分子，這限制可以同時結合變應原的抗體分子的數目。以最高濃度存在和/或表現出最高親和性的抗體優先與變應原結合。對特異性B細胞也是如此，其在其表面膜上表達與它們分泌的相同的免疫球蛋白分子。因此抗原被具有最高親和性和/或最高頻率的B細胞捕獲。這將防止識別相同分子上其他表位的B細胞的激活，這稱為「克隆優勢現象」(Schutze M.P.等，免疫學雜誌(J.Immunol.)142,pp.2635-2640(1989)。
如果對特應性個體誘導了針對自發形成的抗體不識別或者只是弱識別的表位的優先免疫反應，則該克隆優勢現象表明抗變應原免疫反應現在針對這些新的決定簇並且將降低至最初識別的抗原決定簇。兩套實驗證據支持該概念。首先，去除抗原上的優勢免疫B細胞表位暴露完整抗原上沒有被識別並且現在抗體反應針對的表位(ScheerlinckJ.P.Y.等，分子免疫學(Mol.Immunol.)30,pp.733-739(1993))。其次，用抗原免疫的小鼠只使用它們潛在的B細胞全部組成成分的一部分來發動特異性免疫應答；用一種肽免疫激活選擇的B細胞全部組成成分，即使後來用天然抗原攻擊動物也會保持它們的反應性(Benjamini E.等，J.Immunol.141,pp.55-63(1988))。
這兩套實驗說明施用根據本發明化合物給藥後發生的結果。在對克隆優勢概念及其對變態反應的應用的進一步支持中，用重組(r)變應原，Der pⅡ對Balb/c小鼠注射。通過與帶有5胺基酸重疊序列的覆蓋整個Der pⅡ序列的一組15個鏈節的肽反應確定這樣的小鼠產生的抗體的精確特異性。
在圖1給出的實施例中，小鼠產生抗rDer pⅡ和抗肽11-25的抗體。進一步用肽21-35免疫誘導抗肽21-35的免疫應答並且顯著減弱與肽11-25的結合。因此對Der pⅡ的免疫應答改向到最先沒有被識別的決定簇。此外，該實驗證明這種誘導的「改向」的免疫應答抵抗用整個rDer pⅡ變應原的進一步的免疫。
但是，為了完全有效，攜帶B細胞表位的肽只得與可以被T細胞識別的表位一起施用，這將提供具有必需信號的B細胞，使得完全分化成成熟的產生抗體的漿細胞。所述T細胞表位不一定要從和B細胞相同的分子衍生。因此，包含從給定的變應原衍生的B細胞表位和另一個來源的T細胞表位的雜合肽將保持B細胞水平的要求的特異性，同時保證存在T細胞提供的必要信號。這樣的信號包括關聯的B-T細胞識別和抗原非特異性信號，例如白細胞介素的產生，CD40與其配體的相互作用，B7(CD80)與CD28的相互作用(AustynWood，細胞和分子免疫學的原理(Principles of Cellullar and Molecular Immunology)，牛津大學出版社(1993))。
根據其激活大多數患者的T細胞的能力選擇用於本發明的T細胞表位。優選地，其從通常用於常規免疫的抗原衍生，例如破傷風類毒素或白喉抗原。這帶來兩個主要好處。首先，描述過這樣的分子中的大量的普遍的即大多數患者識別的公共的T細胞表位(Reece J.C.等，免疫學雜誌(J.Immunol.)151,pp.6175-6184(1993))。其次，由於基本上所有個體都接種了破傷風類毒素或白喉疫苗，提供用於本發明的T細胞表位已經實現，其應該提高該接種的效力，可能減少劑量和注射次數。
在本發明說明書中用於免疫的肽優選通過應用430A或431型生物系統肽合成儀合成或者通過其編碼核酸序列的重組DNA技術製備(參見，例如，Grant Editions，合成肽)。
含有肽的組合物是適合通過皮下，肌內或皮內途徑注射的形式。但是用於吸入，下咽或者直接在皮膚或黏膜上施用的形式是可能的。
所述肽可以是線狀或環狀形式，有或沒有使用另外的部分例如阻斷肽-肽的相互作用。肽也可以整合到短的肽結構中，這使得形成特定的三維構象，例如α-螺旋。
所述組合物除了含有所述肽外還可以含有其它材料，例如佐劑。
本發明描述的方法可以用來治療其中證明並認為IgE抗體在引發症狀中起著一定作用的人或動物疾病。
本發明還可以應用於對動物或植物源的變應原或者對化學和藥物化合物例如抗生素(青黴素)敏感的患者。
實施例實施例1通過合成獲得由破傷風類毒素的T細胞表位的代表性15個胺基酸(重鏈的胺基酸830-844)和包含Der pⅡ的B細胞表位的14個胺基酸組成的31個胺基酸的肽，其中所述兩個表位通過兩個甘氨酸殘基的一段序列區分。該序列是SEQ ID NO1:QYIKANSKFIGITELGGHEIKKVLVPGCHGS。
肽的表徵1．IgE抗體不識別該B細胞表位對天然蛋白質敏感的個體產生的IgE抗體不識別所述肽。這通過如下進行的免疫測定證明。所述肽在聚苯乙烯微量滴定板上固定並且加入平行一組對Der pⅡ敏感的特應性個體的血清樣品；通過加入同種型特異性試劑檢測特異性IgE抗體的結合。
這樣，通過使用本領域技術人員公知的方法用固相合成獲得相應於Der pⅡ的11-24位胺基酸的序列HEIKKVLVPGCHGS的肽(SEQ IDNO.2)，在其氨基末端加上生物素部分。所述肽在中性抗生物素蛋白-包被平板上固定並且使與特應性個體的血清反應。圖2給出了這樣一個實驗的結果。因此，向中性抗生物素蛋白-包被平板加入攜帶抗DerpⅡ的IgE抗體的特應性個體的血清，其中所述中性抗生物素蛋白-包被平板事先與帶有11個胺基酸重疊序列覆蓋Der pⅡ7-39序列的12-鏈節肽溫育過。對於所有的22個肽沒有發現高於背景值的結合，表明不存在能結合這樣的序列的IgE抗體。
2．非特應性個體的IgG抗體識別的該B細胞表位這通過使用和上文對於IgE抗體描述的類似測定方法進行，除了使用山羊抗人IgG抗體檢測IgG抗體和使用1/100的血清稀釋液。圖3給出了這樣一個實驗的代表性結果，從該圖可以看出胺基酸11和24之間以及胺基酸22和34之間發生顯著結合。因此Der pⅡ的7-39區包含兩個對於非特應性個體的IgG的結合位點。
3．不被特應性個體的IgG抗體識別的B細胞表位使用和對於非特應性受試者的上述測定相同的測定方法進行，除了現在從Der pⅡ-超敏患者獲得血清。圖4給出的結果表明特應性個體的IgG不結合11-24Der pⅡ區。少數患者具有與8-19肽反應的抗體。
4．11-24Der pⅡ區不包含T細胞表位使用本領域技術人員公知的方法通過T細胞增殖測定證明(參見，例如，免疫學常用方法(Current Protocols in Immunology),ColiganJE,Kruisbeek AM,Margulies DH,Shevach EM和Strober W.編著，第3章，Greene Publishing Associates John Wiley Sons,1992-1998)。通過密度梯度離心從全血分離外周血單核細胞(PBMC)。然後將該PBMC懸浮液與rDer pⅡ或者與Der pⅡ的7-39區中包括的12-鏈節肽一起溫育4-6天。圖5所示結果表明向PBMC懸浮液加入肽11-22不導致T細胞的增殖，而用肽22-33和用PHA發現顯著增殖，後者作為正對照。
雜合肽的使用為了提高其免疫原性，肽(SEQ ID NO.1)與適合對人施用的佐劑混合。因此，使用胞壁醯二肽(MDP)並且根據公開方法共價偶聯於肽(Matsumoto K.等.，免疫刺激劑今天和明天(Immunostimulants:Nowand Tomorrow),I.Azuma和G.Jolles編著，pp.79-97(1987)，日本科學學會出版社，東京/Springer-Verlag，柏林)。
然後對對Der pⅡ敏感的患者施用含有所述肽和MDP的混合物。因此，在含有0.3％人血清白蛋白和0.4％苯酚的鹽水中製備含有100微克/毫升肽的懸浮液。通過皮下途徑對臂注射一毫升的該溶液。
實施例2通過產生由一系列包含T和B細胞表位肽的重複單元組成的多肽的重組cDNA技術製備本發明的化合物。通過DNA技術製備由從TT衍生的重複T細胞表位(重鏈的830-844位胺基酸)和從Der pⅡ衍生的6個重複B細胞表位組成的多肽。兩個胺基酸殘基的序列插入在各表位之間。該序列是D-(QYIKANSKFIGITELX)2-(CHGSEPCIIHRGKPFX)5-CHGSEPCIIHRGKPFSR,其中X是GG或SS。
如下獲得這樣的多肽。推導出相應於QYIKANSKFIGITEL(SEQ IDNO.13)的TT表位的核苷酸序列和相應於CHGSEPCIIHRGKPF(SEQ IDNO.14)的Der pⅡ表位21-35的核苷酸序列。由一方面相應於序列TT表位-GG-TT表位(T亞單位)和另一方面通過GG序列分離的Der pⅡ表位的兩個拷貝(B亞單位)的核苷酸進行理論組裝。合成覆蓋每個亞單位(一個T亞單位和一個B亞單位)的全部序列的寡核苷酸。通過PCR獲得編碼兩個亞單位的完全DNA序列。
對於兩個TT亞單位，有義引物是GTATCTCTCGAGAAGAGATCAATACATTAAGGCTAACAGTAAGTTCATTGG (SEQID NO.7)；反義引物是AAACAGCCTCTAGAGAGTTCGGTAATGCCGATAAACTTTGAATTGGCTTTGATGTACTGACCGCCAAGCTCTGTGATTCCAATGAACTTACTGTTAGCC(SEQ ID NO.8).
對於兩個B亞單位，有義引物是GTATCTACTAGTTGCCATGGTTCAGAACCATGTATCATTCATCGTGGTAAACCATTCGGCGGTTGTCACGGAAGTGAGCCTTGCATTATACACAGAGGAAAGC(SEQ ID NO.
9)；反義引物是CGTATGTGTCGACCCGCTATCTAGAGAACGGCTTTCCTCTGTGTATAATGC(SEQ IDNO.10).
使用帶有產生相容末端的限制性酶切位點側翼序列的序列，通過亞單位的定向多聚化獲得相應於該多肽的全長DNA序列。
最後的137個胺基酸多肽的序列是DQYIKANSKFIGITELGGQYIKANSKFIGITELSSCHGSEPCIIHRGKPFGGCHGSEPCIIHRGKPFSSCHGSEPCIIHRGKPFGGCHGSEPCIIHRGKPFSSCHGSEPCIIHRGKPFGGCHGSEPCIIHRGKPFSR(SEQ ID NO.3)相應於Der pⅡ的21-35胺基酸序列的肽CHGSEPCIIHRGKPF(SEQ IDNO.14)不包含IgE-結合位點，這在圖2中描述的類似測定中證實。但是其確實包含非特應性個體的IgG抗體識別而不被特應性受試者的IgG抗體識別的表位，這一點使用分別與圖3和圖4中描述的測定系統相似的測定系統證明。
使用本領域技術人員公知的方法在酵母培養中製備137個胺基酸的多肽，該方法可以從參考文獻中得到，例如分子生物學常用方法(Current Protocols in Molecular Biology),Ausubel FM,BrentR,Kingston,Moore DD,Seidman JG,Smith JA和Struhl K.編著，第16.13章，John Wiley Sons,1994-1997。該多肽吸附在氫氧化鋁上並且通過以100微克的劑量皮下注射施用。以三星期的間隔給予兩次注射。
實施例3編碼本發明化合物的核苷酸序列可以用於直接基因免疫。通過不同途徑(即肌內，皮內，皮下，口服)使用「裸」DNA，製成膠囊的DNA或微米型或納米型顆粒例如脫乙醯殼多糖形式的DNA可以施用以DNA-為基礎的疫苗(K.Roy等，自然藥物(Nature Medicine)1999；5:387-391)。
對於直接的肌內注射免疫，使用根據實施例2製備的但是包含編碼一個從TT衍生的一個T細胞表位和從Der pⅡ衍生的2個B細胞表位的DNA序列的核苷酸構建體，每個表位通過編碼2個甘氨酸殘基的序列GGAGGT或GGCGGT分開。該核苷酸序列在5』端側翼有包含一個EcoRⅠ限制性酶切位點的一個序列和一個KOZAK序列(即GAATTCCCACCATGG(SEQ ID NO.16))和在3，端側翼有一個終止密碼子和一個NotⅠ限制性酶切位點(即TAGGCGGCCGC(SEQ ID NO.17))，並且插入到合適的載體中。
該有義引物是CCGGAATTCCCACCATGGATCAGTATATAAAAGCAAATTCTAAATTTATAGGTATAACTGAACTAGGAGGTTGCCATGGTTCAGAACCATGTATCATTCATCG(SEQ ID NO.
11)；反義引物是TCGAGCGGCCGCTTAGAACGGCTTTCCTCTGTGTATAATGCAAGGCTCACTTCCGTGACAACCGCCGAATGGTTTACCACGATGAATGATACATGGTTCTGAACC(SEQ ID NO.
12)下面的序列構建體用於小鼠免疫GAATTCCCACCATGGATCAGTATATAAAAGCAAATTCTAAATTTATAGGTATAACTGAACTAGGAGGTTGCCATGGTTCAGAACCATGTATCATTCATCGTGGTAAACCATTCGGCGGTTGTCACGGAAGTGAGCCTTGCATTATACACAGAGGAAAGCCGTTCTAAGCGGCCGC(SEQ ID NO.6)在第-7天時，用TT引發6隻Balb/c小鼠。在第0天，麻醉小鼠，並且以2星期間隔肌內注射100微克DNA。注射三次後對小鼠抽血並且對小鼠評價是否存在抗從該DNA構建體產生的B細胞表位和對全長天然Der pⅡ分子的抗體。
實施例4通過合成獲得由代表流感A病毒的T細胞表位的13個胺基酸，相應於規範蛋白酶敏感位點的GKKG序列，一個重複的相同的T細胞表位，第二個GKKG，和包含Der pⅠ的B細胞表位的6個胺基酸組成的40個胺基酸肽。該序列是PKYVKQNTLKLATGKKGPKYVKQNTLKLATGKKGVIIGIK(SEQ ID NO.4).
使用類似測定系統證明和實施例1相同的特徵。
實施例5可以以這樣一種方式改變包含B細胞表位部分的野生型序列使得去除內在T細胞表位同時由於免疫肽中存在另一個功能T細胞表位而保持B決定簇的全部免疫原性。
這樣，通過和實施例1一樣的合成製備32個胺基酸長的肽序列QYIKANSKFIGITELGGCHGSEPCNIHRGKPF(SEQ ID NO.5)。該肽相應於由GG一個片段分開的從TT(胺基酸830-844)衍生的T細胞表位和Der pⅡ衍生的B細胞表位。所述B細胞表位序列在位置28有一個點取代，即Ⅰ取代為N，這通過圖5描述的測定系統表明去除了一個主要的T細胞表位。
該肽用於小鼠免疫。這樣，對6隻Balb/c小鼠每一隻足底用完全弗氏佐劑中含有50微克的該肽的乳液50微升注射。以14天間隔，兩次使用相同的注射程序，除了使用不完全弗氏佐劑。最後注射後2星期，對小鼠抽血並且該血清表明含有抗用於免疫的合成肽中包括的DerpⅡ B細胞表位的，和抗全長Der pⅡ蛋白質的特異性抗體。獲得區域引流的淋巴結來製備T細胞懸浮液。證明後者在TT存在但是不在存在Der pⅡ或相應於用於免疫的B細胞部分的肽時增殖。
實施例6多抗原肽可以用於免疫，優點在於提高的免疫原性和使用包含從不同的可能的不相關的變應原分子衍生的B表位的免疫原的可能性。根據本領域技術人員公知的方法合成多抗原肽，或者有支鏈的肽。該方法的適當的描述可以例如參見Tam J.P.，美國國家科學院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci USA)1988；85:5409-5413。
合成製備由8個賴氨酸(K)殘基組成的核心肽。每個kε-胺基團可以被通過肽鍵連接K骨架的特定肽取代。這樣，頭兩個殘基被相應於TT(胺基酸830-844)的T細胞表位的序列QYIKANSKFIGITEL(SEQ IDNO.13)取代。殘基3和4被相應於帶有一個I28N點取代的Der pⅡ-衍生的B細胞表位的序列CHGSEPCNIHRGKPF(SEQ ID NO.14)取代。殘基5和6被包含如實施例4所示的Der pⅠ衍生的B細胞表位的序列VIIGIK取代。殘基7和8被相應於流感A病毒的主要T細胞表位的序列PKYVKQNTLKLAT(SEQ ID NO.15)取代。
通過和實施例5中描述的相同方法使用所述被取代的有支鏈的肽免疫Balb/c小鼠。證明該血清含有抗全長Der pⅡ和Der pⅠ蛋白質和抗從這兩種變應原衍生的兩個B細胞表位的抗體。T細胞增殖測定證明對TT和對包含T細胞表位序列的流感A病毒蛋白質有正反應。
實施例7通過基因轉移技術，使用重組病毒或非病毒載體(例如合成的脂質雙層)，分子偶聯物或者例如從沙門氏菌屬或分枝桿菌屬產生的修飾的重組生物體，可以施用編碼本發明化合物的核苷酸序列。
因此，基因工程製備了包含和實施例3一樣的DNA序列的腺病毒載體。從兩個成分製備該載體腺病毒DNA載體(Ad5 E1-E3-)和包裝細胞系。首先將編碼一個T細胞表位和兩個B細胞表位的序列插入到pAd質粒中。然後使用常規DNA轉移技術用限制性的Ad基因組(genoma)將線性化的嵌合質粒共轉染到用於體內同源重組的E1反式互補293包裝細胞中。
在293細胞中製備的病毒原液的滴定度在每毫升3×1010至2×1011噬斑形成單位(pfu/ml)範圍。
通過吸入法對Balb/c小鼠施用107pfu。三星期後對小鼠抽血並且通過直接結合ELISA來評價抗免疫構建體中包含的Der pⅡ，和B細胞部分的抗體的水平，如圖3所示。
實施例8可以在人源化動物中評價本發明化合物的對人的免疫原性。因此，用人源免疫活性細胞重建重度聯合免疫缺損(SCID)小鼠。對每一隻SCID小鼠的腹膜注射從對Der pⅡ敏感的特應性供者獲得的外周血單核細胞(PBMC；15×106/小鼠)。在第1,15和30天對以該方法重建的6隻小鼠注射50微克實施例2描述的重組多肽。在開始免疫程序之前和免疫之後6星期對小鼠抽血。使用和圖4描述的相似直接結合測定對血清評價抗重組多肽的抗體的存在並且發現免疫之前是陰性的免疫之後是陽性的。
實施例9用於皮膚衛生的美容組合物
根據本發明的美容組合物可以以直接施與患者皮膚上的乳膏的形式使用。根據本發明的化合物也可以摻入到油相中來代替溶解於水相中。
實施例10食品組合物(酸化的乳清奶)從在水中以12.5％重配製的乳清粉獲得常規用於生產酸乳酪的含有乳桿菌菌株和兩種鏈球菌菌株的乳清奶。將40升該乳清在大約92℃低熱滅菌6分鐘，在大約75℃和150巴(兩個水平)下勻漿化並且在大約42℃溫度下冷卻。
將摻入根據本發明化合物(實施例1-3的肽)的含乳清奶在42℃和大約5的pH下溫育之後在大約5℃溫度下冷卻。
通過口服，患者直接使用根據本發明的所述食品組合物。
序列表110U.C.B.S.A.120用於預防和/或治療變態反應的化合物和方法130P.UCB.09/WO14014116017170PatentIn Ver.2.1210121131212PRT213人工序列220223人工序列的描述合成肽400 1Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu Gly1 5 10 15Gly His Glu Ile Lys Lys Val Leu Val Pro Gly Cys His Gly Ser20 25 30210221114212PRT213人工序列220223人工序列的描述合成肽400 2His Glu Ile Lys Lys Val Leu Val Pro Gly Cys His Gly Ser1 5 102l03211137212PRT213人工序列220223人工序列的描述合成肽4003Asp Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu1 5 10 15Gly Gly Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu20 25 30Leu Ser Ser Cys His Gly Ser Glu Pro Cys Ile Ile His Arg Gly Lys35 40 45Pro Phe Gly Gly Cys His Gly Ser Glu Pro Cys Ile Ile His Arg Gly50 55 60Lys Pro Phe Ser Ser Cys His Gly Ser Glu Pro Cys Ile Ile His Arg65 70 75 80Gly Lys Pro Phe Gly Gly Cys His Gly Ser Glu Pro Cys Ile Ile His85 90 95Arg Gly Lys Pro Phe Ser Ser Cys His Gly Ser Glu Pro Cys Ile Ile100 105 110His Arg Gly Lys Pro Phe Gly Gly Cys His Gly Ser Glu Pro Cys Ile115 120 125Ile His Arg Gly Lys Pro Phe Ser Arg130 135210421140212PRT213人工序列220223人工序列的描述合成肽4004Pro Lys Tyr Val Lys Gln Asn Thr Leu Lys Leu Ala Thr Gly Lys Lys1 5 10 15Gly Pro Lys Tyr Val Lys Gln Asn Thr Leu Lys Leu Ala Thr Gly Lys20 25 30Lys Gly Val Ile Ile Gly Ile Lys35 40210521132212PRT213人工序列220223人工序列的描述合成肽4005Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu Gly1 5 10 15Gly Cys His Gly Ser Glu Pro Cys Asn Ile His Arg Gly Lys Pro Phe20 25 302106211175212DNA213人工序列220223人工序列的描述合成的核苷酸序列4006gaattcccac catggatcag tatataaaag caaattctaa atttataggt ataactgaac 60taggaggttg ccatggttca gaaccatgta tcattcatcg tggtaaacca ttcggcggtt 120gtcacggaag tgagccttgc attatacaca gaggaaagcc gttctaagcg gccgc 175210721153212DNA213人工序列220223人工序列的描述引物4007gtatctctcg agaaaagaga tcaatacatt aaggctaaca gtaagttcat tgg 53210821199212DNA213人工序列220223人工序列的描述引物4008aaacagcctc tagagagttc ggtaatgccg ataaactttg aattggcttt gatgtactga 60ccgccaagct ctgtgattcc aatgaactta ctgttagcc992109211103212DNA213人工序列220223人工序列的描述引物4009gtatctacta gttgccatgg ttcagaacca tgtatcattc atcgtggtaa accattcggc 60ggttgtcacg gaagtgagcc ttgcattata cacagaggaa agc 1032101021151212DNA213人工序列220223人工序列的描述引物40010cgtatgtgtc gacccgctat ctagagaacg gctttcctct gtgtataatg c 5121011211103212DNA213人工序列220223人工序列的描述引物40011ccggaattcc caccatggat cagtatataa aagcaaattc taaatttata ggtataactg 60aactaggagg ttgccatggt tcagaaccat gtatcattca tcg 10321012211105212DNA213人工序列220223人工序列的描述引物400 12tcgagcggcc gcttagaacg gctttcctct gtgtataatg caaggctcac ttccgtgaca 60accgccgaat ggtttaccac gatgaatgat acatggttct gaacc1052101321115212PRT213人工序列220223人工序列的描述合成肽40013Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu1 5 10 152101421115212PRT213人工序列220223人工序列的描述合成肽40014Cys His Gly Ser Glu Pro Cys Ile Ile His Arg Gly Lys Pro Phe1 5 10 152101521111212PRT213人工序列220223人工序列的描述合成肽40015Thr Ala Gly Gly Cys Gly Gly Cys cys Gly Cys1 5 102101621115212DNA213人工序列220223人工序列的描述KOZAK序列40016gaattcccac catgg2101721111212DNA213人工序列220223人工序列的描述包含終止密碼子和NotⅠ限制性酶切位點的序列。40017taggcggccg c 1權利要求
1．由至少一個被對所述變應原非特應性個體的B細胞或B細胞分泌的抗體識別的變應原抗原決定簇和至少一個與引發T細胞激活的所述變應原不同的抗原的抗原決定簇組成的用於預防和/或治療變態反應的化合物。
2．包括編碼根據權利要求1的兩個抗原決定簇的核苷酸序列的用於預防和/或治療變態反應的化合物，所述序列可能連接在患者細胞中有活性的一個或多個調控序列。
3．根據權利要求1或2的化合物，其中所述變應原抗原決定簇不被T細胞識別。
4．根據權利要求1-3任一項的化合物，其中所述變應原選擇下面的主要變應原室內塵埃蟎特嗜皮蟎的Der pⅠ和Der pⅡ，煙麴黴的主要抗原，葡萄球菌B腸毒素(SEB)和牛β-乳球蛋白。
5．根據權利要求1-4任一項的化合物，其中引發T細胞激活的抗原的抗原決定簇是破傷風類毒素，白喉，分枝桿菌，流感或麻疹病毒抗原的T細胞表位。
6．根據前面權利要求任一項的化合物，其中所述變應原抗原決定簇和抗原的抗原決定簇是肽序列，優選是通過肽接頭結合在一起的。
7．根據權利要求6的化合物，其中所述接頭由至少兩個胺基酸組成。
8．根據前面權利要求任一項的化合物，其特徵在於所述化合物選自具有下面胺基酸序列的肽SEO ID NO.1:QYIKANSKFIGITELGGHEIKKVLVPGCHGSSEO ID NO.2:HEIKKVLVPGCHGSSEO ID NO.3:DQYIKANSKFIGITELGGQYIKANSKFIGITELSSCHGSEPCIIHRGKPFGGCHGSEPCIIHRGKPFSSCHGSEPCIIHRGKPFGGCHGSEPCIIHRGKPFSSCHGSEPCIIHRGKPFGGCHGSEPCIIHRGKPFSRSEO ID NO.4:PKYVKQNTLKLATGKKGPKYVKQNTLKLATGKKGVIIGIKSEO ID NO.5:QYIKANSKFIGITELGGCHGSEPCNIHRGKPF或者編碼至少一種所述胺基酸序列的核苷酸序列，優選序列SEQ IDNO.6GAATTCCCACCATGGATCAGTATATAAAAGCAAATTCTAAATTTATAGGTATAACTGAACTAGGAGGTTGCCATGGTTCAGAACCATGTATCATTCATCGTGGTAAACCATTCGGCGGTTGTCACGGAAGTGAGCCTTGCATTATACACAGAAAAGCCGTTCTAAGCGGCCGC.
9．含有根據前面權利要求任一項的化合物和藥學可接受載體的藥物組合物。
10．含有根據權利要求1-8任一項的化合物和美容可接受載體的美容組合物。
11．含有根據權利要求1-8任一項的化合物和一種液體，食品和/或飼料可接受載體的飲料，食品和/或飼料組合物。
12．根據權利要求1-8任一項的化合物，用作藥物。
13．根據權利要求1-8任一項的化合物或根據權利要求9的藥物組合物用於製備預防和/或治療變態反應或預防和/或治療變應性源疾病，特別是速髮型超敏反應變態反應的藥物的用途。
14．根據權利要求13的用途，其中所述疾病選自變應性源的鼻炎和竇炎，支氣管哮喘，特應性皮炎，一些形式的急性和慢性蕁麻疹，與食物變應原攝入相關的腸胃綜合症，相同源的所謂口咽綜合症，與藥物超敏反應相關的過敏反應和/或它們的組合。
全文摘要
本發明涉及由至少一個被對所述變應原非特應性個體的B細胞或B細胞分泌的抗體識別的變應原抗原決定簇和至少一個與引發T細胞激活的所述變應原不同的抗原的抗原決定簇組成的預防和/或治療變態反應的化合物。
文檔編號C07K14/44GK1313903SQ99810025
公開日2001年9月19日 申請日期1999年7月20日 優先權日1998年7月30日
發明者J－M·聖－萊米, M·傑克奎敏 申請人:勒芬研究與發展公司