用寇氏隱甲藻工業化發酵生產二十二碳六烯酸的方法
2023-05-15 07:58:26
專利名稱：：用寇氏隱甲藻工業化發酵生產二十二碳六烯酸的方法
技術領域：
：本發明涉及微生物發酵生產方法，具體涉及利用寇氏隱甲藻菌株發酵生產含二十二碳六烯酸混合油脂。
背景技術：
：二十二碳六烯酸(cis-4，7,10,13,16，19-docosahexaenoicacid,簡稱DHA)是歐米嘎3系列長鏈多不飽和脂肪酸，是大腦、視網膜的重要結構物質，還能夠調節中樞神經系統功能、預防和治療心血管疾病、消除炎症、抑制癌症。DHA的商業來源目前主要是魚油和微藻。魚油的產量和DHA含量都不穩定，提取物夾雜魚腥味，而且從魚油中提取的含DHA混合油脂中還含有二十碳五烯酸(EPA)，據研究，EPA對嬰幼兒的發育具有不利的影響。目前的海洋漁業資源接近枯竭，從魚油中提取DHA造成極大的浪費。微澡的培養需要光照和二氧化碳，生產工藝繁雜，成本較高。隨著人口的增加，以及人們對健康的迫切需求，全世界對DHA的需求量相應增加，需要尋求大量的DHA新來源，而且最好是此來源的DHA不含有EPA。申請(專利)號200710025079.3的專利公開了一種從隱甲藻中提取並精製DHA的方法，側重於從隱甲藻中提取並精製DHA，對隱甲藻的發酵製備DHA涉及較少，並且其所公開的提取物中DHA含量為40—50%。申請(專利)號200610125476.3的專利公開了一種從寇氏隱甲藻中發酵提取DHA的方法。其所公開的產量為海藻細胞中DHA含量在30%-50%，獲得的海藻細胞為20-40g/L，海藻細胞含油量為20-50%，其生產率不超過3.5克/升.天。
發明內容本發明所要解決的問題是提供一種用寇氏隱甲藻(Crypthecodiniumcohnii)原始菌株為菌種，工業化發酵生產二十二碳六烯酸油脂的方法，該方法能夠低成本、大量生產高含量的甘油三酯型DHA油脂。本發明提供的技術方案是用寇氏隱甲藻(C/yp"ecoG^/"/H工業化發酵生產二十二碳六烯酸(DHA)油脂的方法，包括以寇氏隱甲藻為菌種，採用包含碳源、氮源和無機鹽的培養基，經發酵製得二十二碳六烯酸油脂；所述氮源中含有緩效氮源豆粕粉水解汁。經發酵製得DHA含量高於50X的油脂，其中二十碳五烯酸(EPA)含量在1%以下。上述緩效氮源由下法得到:將豆粕粉溶解在水中，調節pH至9.0—10.0，並升溫至70—8(TC，保溫8—10h，過濾取清液得到緩效氮源；其中豆粕粉和水的用量重量比為1:3—1:10;緩效氮源的用量為培養基總重量的4.0-8.0%。上述培養基中還含有生長因子豆芽汁，生長因子的用量為培養基總重量的2.0—4.0%;生長因子由下法得到將黃豆芽洗淨，瀝乾，用壓榨機壓榨取豆芽汁液得到生長因子。所述發酵用菌種為經斜面活化培養、然後轉接入搖瓶擴大培養、再經一級擴大培養得到的寇氏隱甲藻；或為經斜面活化培養、然後轉接入搖瓶擴大培養、再經一級擴大培養和二級擴大培養後得到的寇氏隱甲藻。上述搖瓶擴大培養所用的培養基中含有蘇木糖醇和精氨酸，蘇木糖醇和精氨酸的用量分別為培養基總重量的0.05—0.15%和0.05—0.15%。本發明可在發酵培養48—60h時補充菌種，菌種的補入量為發酵液體積的8—10%。本發明還可在發酵過程中，當發酵液的還原糖含量在2—3wtX時補充碳源。本發明在發酵培養過程中可逐漸增加溶氧初始通氣量為0.5VVM，以後每次補充碳源後提高通氣量0.02VVM。通過溶氧遞增的方式既增加溶氧，又穩定代謝平衡。在發酵全過程中維持pH自然。優選地，本發明在發酵進入穩定期(本發明所用菌種進入穩定期的時間為66-72h)前控制溫度為29—31'C，在進入穩定期後控制溫度為22—24。C。本發明利用寇氏隱甲藻發酵生產DHA的方法，其提取物中DHA含量為51—55%，且其中的EPA含量不超過1X，DHA生產率可以達到4.6克/升.天，大大降低了DHA的發酵成本。本發明的技術指標均明顯高於現有技術的技術指標，所製得的DHA質量更優，成本更低，有利於大規模的工業化生產製造，並降低DHA的消費門檻，以利於DHA的推廣應用。具體實施例方式本發明通過優化培養基和培養條件採用傳統的發酵方法生產二十二碳六烯酸油脂。優化的搖瓶培養基配方如下表優化的搖瓶培養基配方(以克/100ffll培養基計)項目含量項目含量豆粕粉水解汁2.0-4.0豆芽汁2.0-4.0酵母膏0.3-0.6穀氨酸鈉0.8-1.2葡萄糖2.0-5.0糖蜜0.8-1.2磷酸二氫鉀0.2-0.6七水硫酸鎂0.2-0.8海鹽0.3-1.2精氨酸0.05—0.15蘇木糖醇0.05—0.15優化的一級、二級及發酵培養基配方如下:表優化的一級、二級及發酵培養基配方(以克/100ml培養基計)項目含量項目含量豆粕粉水解汁4.0-8.0豆芽汁2.0-4.0酵母膏0.4-0.8穀氨酸鈉1.0-3.0葡萄糖4.0-8.0玉米漿0.2-0.7磷酸二氫鉀0.2-0.6七水硫酸鎂0.2-0.8海鹽0.3-1.2取活化好的斜面菌種經搖瓶、一級和二級種子罐擴大培養後，按照8—10%的接種量接入發酵罐中，PH自然，初始控制罐溫29—3rC，發酵66—72h後調節發酵溫度至22—24'C，初始空氣流量為0.5VVM，發酵全程控制發酵液中還原糖濃度在2.0%以上，當發酵液的還原糖含量在2—3wtX時補糖(補充碳源)；每次補糖後增加空氣流量0.02VVM，在發酵至48—60h時在發酵液中補充8—10%的菌種。由此發酵工藝生產DHA,幹菌體中含油量為60—80%,油脂中DHA含量為51—55%，而且其中EPA含量不超過1.0X，DHA生產率達到4.6克/(升.天)5在本發明方法中，在適合於生產含DHA油的條件下培養寇氏隱甲藻。一般，真菌培養技術是本領域技術人員所熟知的，這些技術可以用於本發明方法。通常採用斜面菌種接種搖瓶，搖瓶接種一級種子罐，一級種子罐接種二級種子罐，二級種子罐接種發酵罐的工藝流程進行發酵培養寇氏隱甲藻生產含甘油三酯型DHA的混合油脂。發酵培養基的組成可以不相同，但都含有碳源和氮源。較好的碳源是葡萄糖，其含量為每升發酵培養基中約40-80克。用量可以隨最終培養物密度而不同。可以使用的碳源包括葡萄糖，糖蜜，玉米糖漿或其他用於發酵的低成本常規碳源。本領域熟練技術人員很容易確定這些碳源的合適用量。通常，在培養過程中需要分批另外補充碳源，以滿足微生物對碳源的消耗，而一次性加入全部碳源則會抑制微生物的生長。氮源通常選擇有機和無機氮源。有機氮源包括酵母膏、酵母提取物、蛋白腖等，無機氮源包括硝酸鈉、硝酸氨、硫酸銨等。但在本發酵研究生產DHA油脂中發現使用水解處理的緩效有機氮源豆粕粉水解汁不僅能夠滿足菌體生長繁殖的需求，並能夠有效提高產油量，並提高油脂中的DHA含量。所使用的豆粕粉水解汁可在配製培養基時一次性的加入。其中豆粕粉水解汁製備方法是將豆粕粉和水按照1:3—1:10的比例配製溶解後，調節pH至9.0—10.0，並升溫至70—80。C，並保溫8—10h，過濾取清液備用。本發明在培養基中添加促生長因子，以促進菌體的生長，並提高DHA含量和產率。本研究發現，在發酵培養基中添加2—4%豆芽汁作為寇氏隱甲藻發酵的生長因子，不僅能夠有效促進菌體的生長，並可以較高的提高DHA的含量和產率。本發明的培養基中是否添加微量元素對本發明的結果沒有實質性影響。所述微量元素為維生素Bi、維生素B6和維生素Bu中的一種或幾種，當為其中一種時，添加量為培養基重量的0.002—0.01%;當為其中幾種時，任意一種組分的添加量為培養基重量的O.002—0.01%。通常，在搖瓶中按照優化的培養基配方配製搖瓶培養基。例如，可以按照每升培養基中添加40克豆粕水解汁，40克豆芽汁，5克酵母膏，IO克穀氨酸鈉，50克葡萄糖，IO克糖蜜，4克磷酸二氫鉀，3克七水硫酸鎂，IO克海鹽，l克蘇木糖醇，l克精氨酸，並加水至所需體積，維持pH自然。將配製好的培養基經高溫滅菌(12rC，30min,0.1—0.12Mpa)，並冷卻至約306°c後接入培養好的寇氏隱甲藻菌種進行培養。通常，按照優化的一級、二級及發酵培養基配方在發酵罐中配製種子和發酵培養基。例如，可以按照每升培養基中添加60克豆粕水解汁，40克豆芽汁，5克酵母膏，20克穀氨酸鈉，60克葡萄糖，5克玉米漿，5克磷酸二氫鉀，6克七水硫酸鎂，10克海鹽，，並加水至所需體積，維持pH自然。將配製好的培養基經高溫滅菌(121°C，30min，0.1—O.12Mpa),並冷卻至約30'C後接入培養好的寇氏隱甲藻菌種進行培養。在發酵液中通入空氣進行氣體交換，供給菌體生長所需要的氧氣，在發酵培養過程中逐漸增加溶氧，通過溶氧遞增的方式既增加溶氧，又穩定代謝平衡。通常在發酵初始空氣流量為0.5VVM，後每次補糖後增加空氣流量0.02VVM。接種量以8—10%為好，最好使用約10%體積的接種量。發酵過程中需要監測營養物消耗水平。發酵液中還原糖含量最好不低於2.0%;建議當發酵液的還原糖含量在2—3wtX時補充葡萄糖。在一個優選的實施例中，一個發酵周期消耗每升培養基150克葡萄糖。發酵溫度一般控制在22至3rC。在發酵的不同階段控制不同的溫度，一般在發酵的初始階段控制在稍高的溫度，較好的是控制在29-3rc，以利於菌體的生長和繁殖，而在油脂積累的階段將溫度控制在誘導DHA優先產生積累的值，優選的是控制在22-24。C。在發酵至48—60h時補充發酵液體積10%的菌種。在發酵的全過程中維持pH自然，無需進行控制。發酵結束後通過離心或過濾的方法收穫藻體細胞，通過擠壓或酶解的方法破壁後加入有機溶劑正己烷進行萃取，再經脫除溶劑後得到毛油，毛油經鹼煉、脫色、脫臭後得到精煉DHA油脂。進行一項或多項的改進，可以發酵得到含有高於50%DHA殘基的甘油三酯類油脂，最佳條件下可以得到含有55%的DHA殘基的甘油三酯類油脂。在最佳的實施方式中，發酵培養基中豆粕粉水解汁濃度為60g/l，酵母膏濃度約6g/l，豆芽汁濃度為40g/1，穀氨酸鈉濃度為20g/l，葡萄糖濃度約80g/1，玉米漿濃度為5g/1，磷酸二氫鉀濃度為5g/1，七水硫酸鎂濃度為4g/1，海鹽添加量為10g/1，並加水至所需體積，維持pH自然。初始空氣流量為0.5VVM,當發酵液中還原糖含量在2—3wtX時即補入葡萄糖，每次補糖後增加空氣流量0.02VVM,在發酵至48小時時補入發酵液體積10%的菌種，整個發酵過程中維持pH自然。當發酵液中氨基氮含量低於0.035%時結束髮酵，如此可以獲得DHA含量為55%的混合油脂，並且其中EPA含量不超過0.5%。通過以上發酵過程優化，能夠獲得較高的生物量，其中含有60%至80%的油脂，其中甘油三酯形式的DHA殘基佔51%至55%,並且其中的EPA含量小於1%。以上對本發明進行了全面的描述，以下非限定性實施例用於進一步說明本發明。實施例l.搖瓶培養基篩選配方a強化緩釋氮源一豆粕粉水解汁(g/100ml培養基)tableseeoriginaldocumentpage8配方d綜合實驗(g/100ml培養基)項目含量項目含量豆粕粉水解汁4.0豆芽汁3.0酵母膏0.6穀氨酸鈉0.8葡萄糖5.0糖蜜1.0磷酸二氫鉀0.6七水硫酸鎂0.3海鹽1.0精氨酸0.1蘇木糖醇0.1配方e空白對照實驗(g/100ml培養基)項目含量項目含量酵母膏0.6穀氨酸鈉0.8葡萄糖5.0糖蜜1.0磷酸二氫鉀0.6七水硫酸鎂0.3海鹽1.0維生素B,0.005維生素B120.005配方f普通發酵培養基配方(g/100ml培養基)項目含量項目含量酵母膏0.5穀氨酸鈉1.0葡萄糖6.0玉米漿0.5磷酸二氫鉀0.4七水硫酸鎂0.3海鹽1.0維生素B10.005維生素B120.005上述豆粕粉水解汁由下法製得:將豆粕粉溶解在水中，調節pH至9.O—IO.0，並升溫至75t:，保溫9h，過濾取清液得到豆粕粉水解汁；其中豆粕粉和水的用量重量比為1:6。豆芽汁由下法得到將新鮮黃豆芽洗淨，瀝乾，用壓榨機壓榨取豆芽汁液得到豆芽汁。按照上述培養基a/b/c/d/e配方，在500ml搖瓶中配製100ml培養基，pH自然，9經高溫滅菌，冷卻備用。將活化好的寇氏隱甲藻斜面菌種接入上述a/b/c/d/e搖瓶培養基中，維持溫度30°C，轉速180rpm，培養48h，製得寇氏隱甲藻種子液。按照培養基f的配方，製備一級和發酵培養基，將製得的種子液接入一級種子罐中，通入0.25VVM的空氣，維持溫度為30。C，維持pH自然，發酵培養48h。將上述擴培種子液按照10%的接種量加入50升發酵罐，通入0.5VVM的空氣，維持溫度為3(TC，維持pH自然，發酵過程中維持發酵液中還原糖濃度為3%以上，當還原糖量低於3%時補充葡萄糖，隨即增加空氣流量0.02VVM，發酵至48h時補充10X的新鮮菌種，發酵至70h調整發酵溫度為23-C，發酵至100小時，發酵液中氨基氮濃度為0.03%，終止發酵。發酵結束後通過離心的方法收穫藻體細胞，通過酶解的方法破壁後加入有機溶劑正己烷進行萃取，再經脫除溶劑後得到毛油，毛油經鹼煉、脫色、脫臭後得到精煉DHA油脂。發酵結果見下表:tableseeoriginaldocumentpage10由上表可以看出，強化各因素的實驗在指標上均優於空白對照，且綜合因素的配方各項技術指標最高，均優於其他，優選作為搖瓶培養基配方。實施例250升罐發酵培養寇氏隱甲藻生產DHA培養基配方(g/100ml培養基)tableseeoriginaldocumentpage10上述豆粕粉水解汁由下法得到:將豆粕粉溶解在水中，調節pH至9.0，並升溫至80°C，保溫8，過濾取清液得到豆粕粉水解汁；其中豆粕粉和水的用量重量比為1:3。豆芽汁的製備同實施例l。加水至所需體積，pH自然，高溫滅菌，冷卻至30。C備用。將實施例1配方d製備得到的搖瓶菌種按照10%的接種量接入含30升培養基的50升發酵罐中，通入0.5VVM的空氣，維持溫度為3(TC，維持pH自然，發酵過程中維持發酵液中還原糖濃度為3%以上，當還原糖量低於3%時補充葡萄糖，隨即增加空氣流量0.02VVM，共計補入4%葡萄糖，發酵至48h時補充10X的新鮮菌種，發酵至68h調整發酵溫度為23。C，發酵至96小時，發酵液中氨基氮濃度為0.03%，終止發酵。發酵結束後通過離心的方法收穫藻體細胞，通過酶解的方法破壁後加入有機溶劑正己垸進行萃取，再經脫除溶劑後得到毛油，毛油經鹼煉、脫色、脫臭後得到精煉DHA油脂。進行相關指標分析獲得生物量為41g/1，油脂含量為60%，氣相色譜檢測DHA含量為53.鄉，EPA含量為0.6tDHA生產率為4.2g/升.天。以下為發酵後所得混合油脂的組成成分C12:00.1023C14:04.4136C16:018.9548C16:l1.1578C18:00.6745C18:l0.3457C18:20.3173C18:30.1084C20:41.6938C20:50.4124C22:518.374711C22:653.2673實施例3500升罐發酵培養寇氏隱甲藻生產DHA培養基配方(g/100ml培養基)項目含量項目含量豆粕粉水解汁8.0豆芽汁3.0酵母膏0.5穀氨酸鈉1.0葡萄糖6.0玉米漿0.5磷酸二氫鉀0.4七水硫酸鎂0.3海鹽1.0上述豆粕粉水解汁由下法得到:將豆粕粉溶解在水中，調節pH至lO.O，並升溫至70°C，保溫10h，過濾取清液得到緩效氮源；其中豆粕粉和水的用量重量比為1:10。豆芽汁的製備同實施例l。加水至所需體積，pH自然，高溫滅菌，冷卻至30。C備用。將實施例1配方d製備得到的搖瓶菌種按照10%的接種量接入含30升培養基的50升發酵罐中，通入0.25VVM的空氣，維持溫度為29°C，維持pH自然，發酵培養48h，得到擴培種子液。將上述擴培種子液按照10%的接種量接入含300升培養基的500升發酵罐，通入0.5VVM的空氣，維持溫度為3rC，維持pH自然，發酵過程中維持發酵液中還原糖濃度為3%以上，當還原糖量低於3%時補充葡萄糖，隨即增加空氣流量0.02VVM，共計補入4.5%葡萄糖，發酵至48h時補充10%的新鮮菌種，發酵至70h調整發酵溫度為23'C，發酵至100小時，發酵液中氨基氮濃度為0.03%，終止發酵。發酵結束後通過離心的方法收穫藻體細胞，通過酶解的方法破壁後加入有機溶劑正己垸進行萃取，再經脫除溶劑後得到毛油，毛油經鹼煉、脫色、脫臭後得到精煉DHA油脂。進行相關指標分析獲得生物量為51g/1，油脂含量為72%，氣相色譜檢測DHA含量為55.3%，EPA含量為0.2%，DHA生產率為4.6g/升.天。以下為發酵後所得混合油脂的組成成分C12:00.101512C14:04.4264C16:017.2475C16:l1.1723C18:00.6612C18:l0.3245C18:20.3194C18:30.1218C20:41.6836C20:50.2144C22:518.3592C22:655.3345實施例45噸罐發酵培養寇氏隱甲藻生產DHA培養基配方(g/100ml培養基)tableseeoriginaldocumentpage13豆粕粉水解汁和豆芽汁的製備同實施例1。加水至所需體積，pH自然，高溫滅菌，冷卻至30'C備用。將實施例1配方d製備得到的搖瓶菌種按照10%的接種量接入含30升培養基的50升發酵罐中，通入0.25VVM的空氣，維持溫度為3(TC，維持pH自然，發酵培養48h，得到一級擴培種子液。將上述一級擴培種子液按照10%的接種量接入含300升培養基的500升發酵罐，通入0.25VVM的空氣，維持溫度為30。C，維持pH自然，發酵培養48h，得到二級擴培種子液。將上述二級擴培種子液按照10%的接種量接入含3噸培養基的5噸發酵罐，通入0.5VVM的空氣，維持溫度為3(TC，維持pH自然，發酵過程中維持發酵液中還原糖濃度為3%以上，當還原糖量低於3%時補充葡萄糖，隨即增加空氣流量0.02VVM，共計補入4.0%葡萄糖，發酵至55h時補充10%的新鮮菌種，發酵至70h調整發酵溫度為22°C，發酵至115小時，發酵液中氨基氮濃度為0.03%，終止發酵。發酵結束後通過離心的方法收穫藻體細胞，通過酶解的方法破壁後加入有機溶劑正己垸進行萃取，再經脫除溶劑後得到毛油，毛油經鹼煉、脫色、脫臭後得到精煉DHA油脂。進行相關指標分析獲得生物量為53g/1，油脂含量為68%，氣相色譜檢測DHA含量為54.7%，EPA含量為0.3呢，DHA生產率為4.5g/升.天。以下為發酵後所得混合油脂的組成成分C12:00.1426C14:04.4482C16:017.5257C16:l1.1246C18:00.6857C18:l0.3572C18:20.3146C18:3O.簡C20:41.6367C20:50.3163C22:518.6045C22:654.725權利要求1.用寇氏隱甲藻(Crypthecodiniumcohnii)工業化發酵生產二十二碳六烯酸油脂的方法，包括以寇氏隱甲藻為菌種，採用包含碳源、氮源和無機鹽的培養基，經發酵製得二十二碳六烯酸油脂；其特徵在於所述氮源中含有緩效氮源豆粕粉水解汁。2.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於緩效氮源由下法得到:將豆粕粉溶解在水中，調節pH至9.0—10.0，並升溫至70—80'C，保溫8—10h，過濾取清液得到緩效氮源；其中豆粕粉和水的用量重量比為1:3—1:10;緩效氮源的用量為培養基總重量的4.0-8.0%。3.根據權利要求1或2所述的方法，其特徵在於培養基中還含有生長因子豆芽汁，生長因子的用量為培養基總重量的2.0_4.0%;生長因子由下法得到將黃豆芽洗淨，瀝乾，用壓榨機壓榨取黃豆芽汁液得到生長因子。4.根據權利要求1或2所述的方法，其特徵在於所述發酵用菌種為經斜面活化培養、然後轉接入搖瓶擴大培養、再經一級擴大培養得到的寇氏隱甲藻；或為經斜面活化培養、然後轉接入搖瓶擴大培養、再經一級擴大培養和二級擴大培養後得到的寇氏隱甲藻。5.根據權利要求4所述的方法，其特徵在於搖瓶擴大培養所用的培養基中含有蘇木糖醇和精氨酸，蘇木糖醇和精氨酸的用量分別為培養基總重量的0.05—0.15%和0.05—0.15%。6.根據權利要求1或2所述的方法，其特徵在於在發酵培養48—60h時補充菌種，菌種的補入量為發酵液體積的8_10%。7.根據權利要求1或2所述的方法，其特徵在於在發酵過程中，當發酵液的還原糖含量在2—3wt^時補充碳源。8.根據權利要求7所述的方法，其特徵在於在發酵培養過程中逐漸增加溶氧初始通氣量為0.5VVM，以後每次補充碳源後提高通氣量0.02VVM。9.根據權利要求1或2所述的方法，其特徵在於在發酵進入穩定期前期，控制溫度為29—3rC，在進入穩定期後控制溫度為22—24'C。全文摘要利用寇氏隱甲藻(Crypthecodiniumcohnii)工業化發酵生產含甘油三酯型二十二碳六烯酸(DHA)油脂的方法，包括以寇氏隱甲藻為菌種，採用包含碳源、氮源和無機鹽的培養基，經發酵製得二十二碳六烯酸油脂；所述氮源中含有緩效氮源豆粕粉水解汁。經發酵製得DHA含量高於50％的油脂，其中二十碳五烯酸(EPA)含量在1％以下，DHA生產率達到4.6g/升.天。本發明DHA產量高、純度高，質量安全可靠，生產成本低，生產穩定，並且基本不含EPA；能夠低成本、大量生產綠色、安全的高含量的甘油三酯型DHA油脂。文檔編號C12P7/64GK101538592SQ20091006183公開日2009年9月23日申請日期2009年4月28日優先權日2009年4月28日發明者吳豔榮,夏德才,寧超美,徐叢英,林紹朗,解秀娟申請人:湖北福星生物科技有限公司