一種利用免疫親和技術提純硫酸軟骨素的方法
2023-05-15 19:40:41 1
一種利用免疫親和技術提純硫酸軟骨素的方法
【專利摘要】本發明公開了一種利用免疫親和技術提純硫酸軟骨素的方法，屬於生物醫藥【技術領域】，以解決現有技術中醇沉法提純硫酸軟骨素純度低的問題。本發明包括以下步驟：1）將硫酸軟骨素作為免疫原免疫小鼠，製備抗硫酸軟骨素單克隆抗體；2）抗硫酸軟骨素單克隆抗體與固相載體偶聯後作為免疫親和柱填料，製備硫酸軟骨素免疫親和柱；3）通過硫酸軟骨素免疫親和柱純化硫酸軟骨素。本發明篩選出的用於捕獲硫酸軟骨素的抗體具高特異性，對樣品中的硫酸軟骨素具有極強的滯留和濃縮能力，偶聯了該抗體的親和層析介質分離純化出的硫酸軟骨素樣品具有純度高、品質好、環保節能、生產周期短等優點，適合規模化生產，易於推廣。
【專利說明】-種利用免疫親和技術提純硫酸軟骨素的方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物醫藥【技術領域】，特別涉及一種利用免疫親和技術提純硫酸軟骨素 的方法。
【背景技術】
[0002] 硫酸軟骨素是共價連接在蛋白質上形成蛋白聚糖的一類糖胺聚糖，存在於除植物 以外的所有生物中。以其為主要原料開發的相關產品主要用於製藥工業，因此，對於硫酸軟 骨素的純度和其中的雜質限定有較為嚴格的要求。
[0003] 目前，硫酸軟骨素主要從動物（如鯊魚、牛、雞等）的軟骨中提取，提取方法主要為 酶解法，除雜方法主要為醇沉法。以上工藝所生產的硫酸軟骨素普遍存在純度不高，工藝繁 瑣，生產周期較長、生產成本較高、且對環境造成汙染較為嚴重等問題，因此，有必要對其純 化方式進行改進。
[0004] 如申請公布號為"CN102190740A"的發明專利公開了一種硫酸軟骨素的製備方 法，軟骨加水浸沒，鹼調PH至8?9, 5?60°C保溫4?6小時；加入2709鹼性蛋白酶，攪 拌6?8小時，升溫至沸騰，過濾得硫酸軟骨素溶液；向硫酸軟骨素溶液中加入氯化鈉，再 加入溶液體積2?3倍的酒精，靜止6小時，過濾得硫酸軟骨素沉澱；將硫酸軟骨素沉澱加 入水中溶解，同時向水中加入氯化鈉，調節PH10?12,加入溶液重量1?3%雙氧水氧化6 小時過濾得濾液；調節硫酸軟骨素濾液PH5?6,加入濾液體積4?6倍體積的酒精二次沉 澱，得硫酸軟骨素沉澱；將二次硫酸軟骨素沉澱倒入裝有乳化劑的脫水罐中，將硫酸軟骨素 沉澱體積3?5倍的酒精泵入脫水罐，抽濾，收集沉澱，乾燥，得硫酸軟骨素成品。
[0005] 免疫親和技術是一種利用抗原抗體之間所形成的高特異性的親和力所發生的特 異性、具有可逆性的相結合的原理，在含有眾多組分的混合物中分離出特定的目標抗原物 質或抗體的一類層析技術。到目前為止，該技術已在激素、抗體、多肽以及小分子化合物如 黃麴黴毒素、氯黴素等的分析檢測領域得到廣泛的應用。儘管免疫親和純化方法在20世 紀80年代以來逐漸在分離純化領域得到廣泛的應用，並且工業上對硫酸軟骨素產品的純 度提出越來越高的要求，但利用免疫親和技術來分離純化硫酸軟骨素的方法尚未見到報 道。
【發明內容】
[0006] 本發明提供了一種利用免疫親和技術提純硫酸軟骨素的方法，以解決現有技術中 醇沉法提純硫酸軟骨素純度低的問題。
[0007] 本發明的技術方案為： 一種利用免疫親和技術提純硫酸軟骨素的方法，包括以下步驟： 1) 將硫酸軟骨素作為免疫原免疫小鼠，製備抗硫酸軟骨素單克隆抗體； 2) 所述抗硫酸軟骨素單克隆抗體與固相載體偶聯後作為免疫親和柱填料，製備硫酸軟 骨素免疫親和柱； 3)通過所述硫酸軟骨素免疫親和柱純化硫酸軟骨素。
[0008] 作為優選方案，所述步驟1)包括： a. 小鼠皮下注射硫酸軟骨素，使小鼠產生免疫應答； b. 分離步驟a產生抗體反應的小鼠脾臟中的脾細胞，所述脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞按 1:3?10的比例進行細胞融合； c. 將步驟b所得的融合的雜交瘤細胞用HAT培養基篩選，得到融合成功的雜交瘤細 胞； d. 對步驟c中所得到的融合成功的雜交瘤細胞進行ELISA檢測，篩選出針對硫酸軟骨 素的特異性陽性雜交瘤細胞； e. 將步驟d所獲得的陽性雜交瘤細胞進行大罐培養或注射小鼠，取培養上清或採集腹 水，以硫酸銨沉澱法和proteinA/G純化，提取特異性的抗硫酸軟骨素單克隆抗體。
[0009] 作為優選，步驟2)中所述的固相載體為瓊脂糖珠，所述瓊脂糖珠為經過溴化氰活 化的瓊脂糖珠。
[0010] 進一步的，所述步驟2)包括： f. 將活化的瓊脂糖珠以PBS溶液懸浮分散，以PBS溶液稀釋所述抗硫酸軟骨素單克隆 抗體，將所述抗硫酸軟骨素單克隆抗體的PBS溶液加至瓊脂糖珠的PBS溶液中，室溫攪拌 0. 3?3小時，偶聯得到偶聯複合物，離心並以PBS溶液洗滌，以除去未結合的抗體； g. 採用含有〇. 2?0. 8mol/LNaCl的pH為8. 0的Tris-HCl緩衝液浸泡所述偶聯複合 物2小時，以封閉所述偶聯複合物中多餘的活性基團；然後用5?12倍於所述偶聯複合物 體積的所述Tris-HCl緩衝液洗滌； h. 使用上述偶聯複合物裝柱。
[0011] 進一步的，步驟f所述的PBS溶液濃度為0.lmol/L。
[0012] 優選的，步驟f所述瓊脂糖珠與所述抗硫酸軟骨素單克隆抗體的用量比為2:1? 5:lmg/mL〇
[0013]作為優選方案，步驟3)具體為：將過濾後的硫酸軟骨素粗提物溶液加至所述硫酸 軟骨素免疫親和柱，使其自然滴下；過完柱後以〇.lmol/L的PBS溶液洗柱以除去未與所述 偶聯複合物裝柱結合的物質；最後採用體積分數為70%乙醇溶液進行洗脫，收集洗脫液， 乾燥得提純後的硫酸軟骨素。
[0014] 本發明的有益效果為： 本發明篩選出的用於捕獲硫酸軟骨素的抗體具高特異性，對樣品中的硫酸軟骨素具有 極強的滯留和濃縮能力，偶聯了該抗體的親和層析介質分離純化出的硫酸軟骨素樣品具有 純度高、品質好、環保節能、生產周期短等優點，適合規模化生產，易於推廣。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0015] 圖1為對比例中採用醇沉法提純的硫酸軟骨素的液相色譜圖； 圖2為本發明實施例1中提純的硫酸軟骨素的液相色譜圖。
【具體實施方式】
[0016] 試劑：實施例和對比例中所使用的試劑均購自Sigma公司。
[0017] 儀器：島津LC-10AT高效液相色譜儀； 色譜檢測條件 色譜柱：以十八烷基矽烷鍵合矽膠為填充劑的矽膠柱； 流動相：10%乙腈、0. 12%辛烷磺酸鈉、0. 08%磷酸、高純水補足； 檢測波長：195nm。
[0018] 對比例： 採用申請公布號為"CN102190740A"的發明專利中記載的方法，鯊魚軟骨加水浸沒，鹼 調PH至8?9, 50°C保溫5小時；加入2709鹼性蛋白酶，攪拌7小時，升溫至沸騰，過濾得 硫酸軟骨素粗液。
[0019] 採用申請公布號為"CN102190740A"的發明專利中記載的醇沉提純方法提純所述 硫酸軟骨素粗液，得到醇沉法提純後的硫酸軟骨素。採用醇沉法提純的硫酸軟骨素產品的 檢驗報告，結果如下：
【權利要求】
1. 一種利用免疫親和技術提純硫酸軟骨素的方法，其特徵在於，包括以下步驟： 1) 將硫酸軟骨素作為免疫原免疫小鼠，製備抗硫酸軟骨素單克隆抗體； 2) 所述抗硫酸軟骨素單克隆抗體與固相載體偶聯後作為免疫親和柱填料，製備硫酸軟 骨素免疫親和柱； 3) 通過所述硫酸軟骨素免疫親和柱純化硫酸軟骨素。
2. 如權利要求1所述的免疫親和技術提純硫酸軟骨素的方法，其特徵在於，所述步驟 1) 包括： a. 小鼠皮下注射硫酸軟骨素，使小鼠產生免疫應答； b. 分離步驟a產生抗體反應的小鼠脾臟中的脾細胞，所述脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞按 1:3~10的比例進行細胞融合； c. 將步驟b所得的融合的雜交瘤細胞用HAT培養基篩選，得到融合成功的雜交瘤細 胞； d. 對步驟c中所得到的融合成功的雜交瘤細胞進行ELISA檢測，篩選出針對硫酸軟骨 素的特異性陽性雜交瘤細胞； e. 將步驟d所獲得的陽性雜交瘤細胞進行大罐培養或注射小鼠，取培養上清或採集腹 水，以硫酸銨沉澱法和protein A/G純化，提取特異性的抗硫酸軟骨素單克隆抗體。
3. 如權利要求1所述的免疫親和技術提純硫酸軟骨素的方法，其特徵在於：步驟2)中 所述的固相載體為瓊脂糖珠，所述瓊脂糖珠為經過溴化氰活化的瓊脂糖珠。
4. 如權利要求3所述的免疫親和技術提純硫酸軟骨素的方法，其特徵在於，所述步驟 2) 包括： f. 將活化的瓊脂糖珠以PBS溶液懸浮分散，以PBS溶液稀釋所述抗硫酸軟骨素單克隆 抗體，將所述抗硫酸軟骨素單克隆抗體的PBS溶液加至瓊脂糖珠的PBS溶液中，室溫攪拌 0. 3~3小時，偶聯得到偶聯複合物，離心並以PBS溶液洗滌，以除去未結合的抗體； g. 採用含有〇. 2~0. 8 mol/L NaCl的pH為8. 0的Tris-HCl緩衝液浸泡所述偶聯複合 物2小時，以封閉所述偶聯複合物中多餘的活性基團；然後用5~12倍於所述偶聯複合物體 積的所述Tris-HCl緩衝液洗滌； h. 使用上述偶聯複合物裝柱。
5. 如權利要求4所述的免疫親和技術提純硫酸軟骨素的方法，其特徵在於：步驟f所 述的PBS溶液濃度為0? 1 mol/L。
6. 如權利要求4所述的免疫親和技術提純硫酸軟骨素的方法，其特徵在於：步驟f所 述瓊脂糖珠與所述抗硫酸軟骨素單克隆抗體的用量比為2:1飛：lmg/mL。
7. 如權利要求1所述的免疫親和技術提純硫酸軟骨素的方法，其特徵在於，步驟3)具 體為：將過濾後的硫酸軟骨素粗提物溶液加至所述硫酸軟骨素免疫親和柱，使其自然滴下； 過完柱後以0.1 mol/L的PBS溶液洗柱以除去未與所述偶聯複合物裝柱結合的物質；最後 採用體積分數為70%乙醇溶液進行洗脫，收集洗脫液，乾燥得提純後的硫酸軟骨素。
【文檔編號】C08B37/08GK104387499SQ201410401022
【公開日】2015年3月4日 申請日期:2014年8月15日 優先權日:2014年8月15日
【發明者】張敉, 張金陽, 於美妍, 李寶才, 姜福勤, 劉珊珊, 趙忠瑩 申請人:濟南盛嶽林生物工程有限公司