一種高效酶誘導提取老鸛草中多酚類活性成分的方法
2023-05-21 23:48:21 3
專利名稱：一種高效酶誘導提取老鸛草中多酚類活性成分的方法
技術領域：
本發明涉及一種酶誘導提高中草藥中有效成分的含量、並對其進行負壓空化輔助 提取的方法，即獲得富含沒食子酸、柯裡拉京、老鸛草素三種多酚類活性成分的老鸛草提取 物的高效酶誘導輔助提取方法。
背景技術：
老鸛草[Geranium]，為櫳牛兒苗科老鸛草屬多年生草本植物。又名老觀草、鴨腳草 等，是一種民間用藥。老鸛草具有抗菌、抗病毒、抗氧化的功效，可用於治療風溼痺痛、麻木 拘攣、筋骨酸痛、洩瀉痢疾(周海燕，1996;雷志勇等，2002)。根據國外相關報導，老鸛草提 取物製劑還具有治療腸炎，保護肝臟和抑制高血壓的作用(Kinoshita et al,2007 ;Jae & Kye,2008)。在老鸛草中，多酚類化合物是含量最高的組分，其中沒食子酸、柯裡拉京、老鸛草 素有較好的藥理作用，具有抗菌、抗病毒、抗氧化、抗腫瘤、降血壓、保肝等作用，對預防血栓 也有一定功效(王曉麗等，2008 ;Shyr-Yi Lin et al,2008 ；K. Nagendra Prasad et al, 2009 ；)。傳統的提取方法如煎煮法、浸漬法、滲漉法、回流提取及索式提取過程都是在完整 植物細胞的情況下，通過浸潤與滲透、使溶劑進入組織細胞、溶解細胞內物質並使其擴散至 溶劑主體，這使溶劑提取細胞內生物活性成分成為可能。但由於細胞壁的屏障作用，決定 了中藥材有效成分的提取效率有一定限度(劉增琪等，2003 ；馮青然等，2003 ；賈立革等， 2004)。所以傳統提取方法存在提取溫度過高，提取率低，有機溶劑汙染環境等問題。酶誘導是在提取的基礎上，一方面利用酶(如半纖維素酶、纖維素酶、果膠酶等) 將細胞壁的成分水解或降解，破壞細胞壁結構，使有效成分充分游離出來，溶解、混懸或膠 溶於提取溶劑中，加速有效成分的釋放，從而提高提取效率；另一方面利用酶(如葡萄 糖苷酶等)將細胞內的苷類化合物水解成相應的苷元，從而提高細胞內目標物的含量。所謂空化，一般是指液體內部局部壓力降低時，液體內部或液固交界面上蒸汽或 氣體的空穴(空泡)的形成、發展和潰滅的過程。當潰滅發生在固體表面附近時，由於空泡 瞬間(微秒級)潰滅產生極高的瞬時壓強，極高壓強的反覆作用，從而破壞固體表面。因 此，負壓空化輔助提取技術是利用負壓空化氣泡產生強烈的空化效應和機械振動(李根生 等，1997 ；高秋生，1999)，造成樣品顆粒細胞壁快速破裂，加速了胞內物質向介質釋放、擴散 和溶解，從而促進提取。現在有一些關於通過酶預處理來提取油類作物中油和蛋白質以及利用負壓空化 輔助提取技術提取植物材料中活性成分的報導，但將酶誘導技術和負壓空化提取技術相結 合提取老鸛草中的活性成分還未見報導。
發明內容
本發明的目的在於提供一種以老鸛草為原料，高效地獲得富含三種多酚類活性成分提取物的酶誘導輔助提取方法。在確定提取技術路線的基礎上，對工藝進行優化，獲得富 含沒食子酸、柯裡拉京、老鸛草素三種多酚類活性成分的老鸛草提取物，從而提高老鸛草的 資源利用度。本發明的技術方案將乾燥的老鸛草與配製好的酶溶液混合，勻漿，將勻漿液轉移 入容器置於恆溫搖床中進行振蕩酶解，酶解過程之後將酶解液轉移入提取容器中，進行負 壓空化輔助提取，將提取液進行減壓抽濾後濃縮至幹，即得到富含沒食子酸、柯裡拉京、老 鸛草素三種活性成分的老鸛草提取物。具體方案如下(1)勻漿破碎酶解以水為溶劑配製濃度為50 100U/mL的酶溶液，將酶溶液和 乾燥的老鸛草以溶液體積與原料質量比20 30mL/g混合，調節pH值至4. 0 6. 0，利用勻 漿機勻漿1 2min。(2)恆溫酶解將勻漿液轉移入容器並置於恆溫搖床中，在30 50°C下，酶解3 6h，轉速 100 120rpm。(3)負壓空化輔助提取將酶解液轉移入負壓空化提取器中，提取1 3次，每次 10 30min，將提取液減壓抽濾後濃縮至幹，即得到富含多酚類活性成分的老鸛草提取物。本發明步驟(1)採用的勻漿粉碎技術與普通乾燥粉碎技術相比，可將老鸛草在酶 溶液中粉碎成細胞組織，並具有破壞細胞壁、使植物組織細胞與酶充分接觸以及瞬時刺激 誘發內源性酶活性的作用，從而提高目標成分的游離，增加目標成分的含量；而且勻漿粉碎 時不產生粉塵，不汙染環境。由於植物細胞壁是以纖維素為骨架，並與半纖維素、果膠及蛋白質等大分子結合， 單一的酶無法使細胞壁徹底崩潰、對提高有效成分的提取率作用有限，因此，本發明使用的酶 為纖維素酶、半纖維素酶和果膠酶，其中的一種或兩種以上的組合。根據所加酶組成與比例， 調節PH值為4. 0 6. 0，使酶的活性保持最佳。酶溶液體積與原料質量比為20 30mL/g。本發明所述步驟⑵恆溫酶解過程，酶溶液的濃度為50 100U/mL，酶解溫度 30 50°C，酶解時間為3 6h。本發明所述步驟(3)負壓空化輔助提取過程，將酶解液進行負壓空化輔助提取， 在室溫下提取1 3次，每次10 30min，通過空化效應使細胞壁進一步破碎，加速目標成 分的游離，增加目標成分的含量；而且提取過程無需高溫加熱，無需有機溶劑，綠色環保。按照本發明所述優選的高效酶誘導負壓空化輔助提取條件對老鸛草中主要含有 沒食子酸、柯裡拉京、老鸛草素的多酚類活性成分進行提取，所得提取物中總多酚類活性成 分的含量最高可達156. 14mgGAE/g，沒食子酸、柯裡拉京、老鸛草素三種主要多酚類活性成 分的含量最高分別可達9. 58、6. 87、19. 82mg/g,比傳統熱回流方法提高了 30 67%。本發明的優點(1)該方法具有經濟、快速、高效、設備簡單、操作安全的特點，可實現大規模的產 業化生產。(2)與傳統提取方法相比，無需高溫加熱、無需有機溶劑、綠色環保、提取率高、降 低了生產成本。
圖1為沒食子酸的結構
圖2為柯裡拉京的結構圖3為老鸛草素的結構
具體實施例方式實施例1配製纖維素酶濃度為100U/mL、半纖維素酶濃度為50U/mL的酶溶液，調節pH至 5. 3。稱取乾燥的老鸛草10g，以酶溶液體積與原料質量30mL/g的比例加入酶溶液，勻漿 2min,將勻漿液轉移入容器置於40°C的恆溫搖床中振蕩酶解5h，酶解過程之後將酶解液 轉移入提取容器，負壓空化輔助提取2次，時間為15min，提取液減壓抽濾後將濾液濃縮至 幹，得到固形物2. 41g，甲醇定容，利用Folin-Phenol試劑法測定總多酚含量，HPLC檢測， 所得固形物中總多酚類活性成分的含量為156. 14mgGAE/g,比傳統的熱回流方法提高了 50. 9%，沒食子酸、柯裡拉京、老鸛草素的含量分別為7. 46,6. 31,19. 82mg/g，分別比傳統的 熱回流方法提高了 30.6%、44. 1%和67.3%。實施例2配製半纖維素酶濃度為60U/mL、果膠酶濃度為80U/mL的酶溶液，調節pH至4. 6。 稱取乾燥老鸛草10g，以酶溶液體積與原料質量20mL/g的比例加入酶溶液，勻漿lmin，將勻 漿液轉移入容器置於30°C的恆溫搖床中振蕩酶解5h，酶解過程之後將酶解液轉移入提取 容器，負壓空化輔助提取1次，每次30min，提取液減壓抽濾將後將濾液濃縮至幹，得到固形 物2. 16g，甲醇定容，利用Folin-Phenol試劑法測定總多酚含量，HPLC檢測，所得固形物中 總多酚類活性成分的含量為134. 28mgGAE/g,比傳統的熱回流方法提高了 29.8%，沒食子 酸、柯裡拉京、老鸛草素的含量分別為9. 58,5. 79、15. 66mg/g，分別比傳統的熱回流方法提 高了 67. 7%,32. 2%、和 31. 9%。實施例3配製纖維素酶濃度為70U/mL、果膠酶濃度為100U/mL的酶溶液，調節pH至5. 7。 稱取乾燥老鸛草10g，以酶溶液體積與原料質量比25mL/g的比例加入酶溶液，勻漿2min，將 勻漿液轉移入容器置於50°C的恆溫搖床中振蕩酶解6h，酶解過程之後將酶解液轉移入提 取容器，負壓空化輔助提取3次，每次20min，提取液減壓抽濾將後將濾液濃縮至幹，得到固 形物2. 25g，甲醇定容，利用Folin-Phenol試劑法測定總多酚含量，HPLC檢測，所得固形物 中總多酚類活性成分的含量為142. 75mgGAE/g,比傳統的熱回流方法提高了 38. 1%，沒食 子酸、柯裡拉京、老鸛草素的含量分別為8. 82,6. 87、16. 04mg/g,分別比熱回流方法提高了 54. 5%,56. 8%、和 35. 1%。對照組稱取乾燥老鸛草10g，以溶液體積與原料質量25mL/g的比例加入蒸餾水，勻漿粉 碎2min，7(TC熱回流提取5h，提取液減壓抽濾將後將濾液濃縮至幹，得到固形物1. 73g，甲 醇定容，利用Folin-Phenol試劑法測定總多酚含量，HPLC檢測，所得固形物中總多酚類活 性成分的含量為103. 42mgGAE/g，沒食子酸、柯裡拉京、老鸛草素的含量分別為5. 71,4. 38、 11. 87mg/g。本發明中，結果定量檢測分析採用下表條件
權利要求
一種高效酶誘導提取老鸛草中多酚類活性成分的方法，包括如下操作步驟(1)勻漿破碎酶解以水為溶劑配製濃度為50～100U/mL的酶溶液，將酶溶液和乾燥的老鸛草以溶液體積與原料質量比20～30mL/g混合，調節pH值至4.0～6.0，利用勻漿機勻漿1～2min；(2)恆溫酶解將勻漿液轉移入容器並置於恆溫搖床中，在30～50℃下，酶解3～6h，轉速100～120rpm；(3)負壓空化輔助提取將酶解液轉移入負壓空化提取器中，提取1～3次，每次10～30min，將提取液減壓抽濾後濃縮至幹，即得到富含多酚類活性成分的老鸛草提取物。
2.按照權利要求1所述步驟(1)勻漿破碎酶解過程，其特徵在於使用的酶為纖維素 酶、半纖維素酶和果膠酶其中的一種或一種以上的組合，酶溶液的濃度為50 100U/mL，酶 溶液體積與原料質量比為20 30mL/g。
3.按照權利要求1所述步驟(2)恆溫酶解過程，其特徵在於酶解溫度為30 50°C， 酶解時間為3 6h，恆溫搖床的轉速為100 120rpm。
4.按照權利要求1所述步驟(3)負壓空化輔助提取過程，其特徵在於負壓空化提取 技術是以負壓為動力，利用氣泡產生的空化效應、湍流效應的一種強化輔助提取工藝，提取 次數為1 3次，所用壓力為0. 04 0. 06MPa。
全文摘要
本發明涉及中草藥老鸛草活性成分的提取技術，目的在於提供一種經濟快速的高效酶誘導提取老鸛草中多酚類活性成分的方法。本發明採用勻漿破碎高效酶解技術結合負壓空化輔助提取技術，獲得富含三種多酚類活性成分的老鸛草提取物，結果表明提取物中總多酚類活性成分的含量最高可達156.14mgGAE/g，沒食子酸、柯裡拉京、老鸛草素三種主要多酚類活性成分的含量最高分別可達9.58、6.87、19.82mg/g，比傳統熱回流方法提高了30～67％。該方法無需高溫加熱，無需有機溶劑，提取率高，綠色環保，操作安全，適於產業化生產，為中藥提取現代化提供了一種新的方法和手段。
文檔編號A61P31/04GK101849978SQ20101018444
公開日2010年10月6日 申請日期2010年5月27日 優先權日2010年5月27日
發明者付玉傑, 吳楠, 孔羽, 李吉, 楊雨春, 祖元剛 申請人:東北林業大學;付玉傑