一種鑑定水稻低植酸突變體zju-lpa3雜交後代基因型的引物及方法

2023-05-21 23:51:06 1

專利名稱：一種鑑定水稻低植酸突變體zju-lpa3雜交後代基因型的引物及方法
技術領域：
本發明屬於農業生物工程技術領域，尤其涉及一種鑑定水稻低植酸突變體zju-lpa3雜交後代基因型的引物及方法。
背景技術：
植酸，即肌醇-六磷酸，是禾穀類種子中含磷最豐富的化合物，佔到種子乾重的I %以上，佔種子全磷量的75. O ± 10 %。植酸通常與Zn2+、Ca2+、Fe3+等金屬陽離子 螯合成植酸鹽，並與蛋白進ー步形成球狀複合體，沉積在禾本科作物籽粒的糊粉層中。由於人和非反芻動物(豬、雞、魚等)體內不含植酸酶，食物中的植酸難以被消化利用，即降低了磷元素的有效吸收，也影響微量元素、蛋白質和澱粉的生物有效性。因此，植酸是ー種典型的抗營養因子。此外，植酸隨動物糞便排洩到環境中，極易引起水體富營養化，造成嚴重的環境汙染，特別是在飼養業發達的國家尤為嚴重；另ー方面為了滿足動物生長發育的需要，飼料中往往要額外添加有機磷或骨粉等，提高了飼養成本。因此，降低作物種子中植酸的含量日益成為育種學家、營養學家和環境學家關注的焦點。運用理化誘變和基因工程技木，創製種子中植酸含量下降的低植酸(LPA)作物，可從源頭上解決上述問題。迄今，國內外學者已從水稻、大豆、玉米、大麥、小麥等作物中獲得了ー批LPA突變體，培育出了ー些LPA作物新品種，如在大麥中已育成和推廣了 2個LPA新品種『Herald』和『Clearwater』。臨床和動物飼養實驗證實,人對食物中的Zn2+的吸收與LPA玉米籽粒中植酸鹽下降的程度成正比；LPA大麥或玉米作為飼料，不但Fe3+和Zn2+的有效性增加，而且可以提高大麥和玉米用做飼料時動物對磷的利用，從而減少動物糞便造成的磷汙染。目前獲得LPA突變系的主要途徑是理化誘變和自然篩選，並且只能收穫作物成熟種子後才能通過微量測定方法檢測個體種子無機磷含量，初步篩選高無機磷品系，然後根據材料表型及實驗條件進ー步通過鐵沉澱等方法測定植酸磷和全磷含量，選育周期較長，成本高，且效率低。隨著現代分子生物學理論和技術的快速發展，利用正向(圖位克隆)或反向遺傳學(RNAi，T-DNA插入突變)技術，已報導克隆了若干LPA基因(MIPS，MIK, MRP，2_PGK，IPK1)，不僅掲示了 LPA突變發生的分子機制，也為基於LPA相關基因核苷酸變異的引物在LPA作物新品種的選育方面奠定了理論基礎。因此，充分利用已有的LPA基因資源選育LPA水稻新品種是今後水稻功能性成份育種的ー個重要組成部分。水稻是我國及世界上三大糧食作物之一。作為稻米生產和消費的大國，我國也是鐵缺乏和缺鐵性貧血等微量元素缺乏症發生較嚴重的國家之一，而降低水稻植酸含量可顯著提高Fe3+、Zn2+等微量元素的生物有效性。因此，若能獲得與目的基因共分離的基因功能性引物，有效快速鑑定含有目的基因的LPA水稻種質資源，培育具有營養與環保雙重功能的LPA水稻在我國就有重要的經濟和社會意義。

發明內容
本發明提供了ー種引物，利用該引物可以方便地鑑定水稻低植酸突變體zju-lpa3雜交後代的基因型。ー種引物，正向引物為ZW3F和ZW4F，反向引物為ZW3R ；ZW3F:5』 -AATTAACGGCTTGTAAAACGTG-3』ZW4F:5，-GGTTCCCACTCGGTATGCG-3，；ZW3R 5，-ACGATGGTTGTTTGGGTCTTG-3，。水稻低植酸突變體zju_lpa3低植酸含量性狀受2_PGK(L0C 0s02g57400)等位突變基因ZJU-LPA3控制，基因組外顯子和內含子上缺失了ー個1475bp大片段。據此，在TIGRV7. O網站(http://rice.plantbiology.msu. edu/)下載對應的核苷酸序列，並對序列進行·比對分析，利用Primer Premier 5. O軟體在水稻低植酸基因ZJU-LPA3突變體缺失片段區域附近設計相應的弓I物ZHJ3，引物ZHJ3的反向引物和一個正向引物根據基因2-PGK的保守區域設計，另外一個正向引物是根據基因ZJU-LPA3缺失片段區域設計，具有較好的通用性和特異性。本發明還提供了一種鑑定水稻低植酸突變體zju-lpa3雜交後代基因型的方法，包括如下步驟(I)提取水稻樣品苗期葉片的總DNA ；(2)以所述總DNA為模板，利用所述的引物進行PCR擴增，擴增產物經凝膠電泳分離、染色後拍照成像；(3)根據成像結果，判斷水稻樣品的基因型；若只出現390bp特徵帯，則該水稻樣品為不含水稻低植酸基因ZJU-LPA3的純合型材料；若只出現746bp特徵帶，則該水稻樣品為含水稻低植酸基因ZJU-LPA3的純合型材料；若同時出現390和746bp特徵帶，則該水稻樣品為含水稻低植酸基因ZJU-LPA3的雜合型材料；所述水稻低植酸基因ZJU-LPA3的鹼基序列如SEQ ID NO. I所示。所述水稻低植酸突變體zju_lpa3的製備已在文獻(Liu, Q. L.，Xu, X. H.，Ren,X. L. , Fu, H. ff. , ffu, D. X. , and Shu, Q. Y. 2007. Generation and characterization of lowphytic acid germplasm in rice(Oryza sativa L. ). Theoretical and Applied Genetics114(5) :803-814)中公開，它是指2-PGK基因的核苷酸序列突變成與基因ZJU-LPA3的核苷酸序列相同。而所述水稻低植酸突變體zju-lpa3的雜交後代指水稻低植酸突變體zju-lpa3與2-PGK基因未突變的水稻品種雜交培育的後代，所述2-PGK基因未突變的水稻品種可以是嘉禾218、日本睛、9311、嘉興08-1等。常用的植物總DNA提取方法為CTAB法。植物的次生代謝物對核酸提取有幹擾作用。因此，一般儘可能選幼嫩的、代謝旺盛的新生組織作為提取DNA的材料，幼嫩的新生組織次生代謝物較少，DNA含量高，且易於破碎。植物材料最好是新鮮的。所述PCR擴增的反應體系為20 μ L，其中，2 XPCR Master Mix緩衝液10 μ L(含
I.5mM Mg2\200yM dNTPUU Taq 酶)、10 μ M 正反向引物各 O. 4 μ L、總 DNAl μ L、滅菌去離子水補至20 μ L0
所述PCR擴增的反應程序為94°C預變性4min ;94°C變性30s，57°C退火45s，72°C延伸lmin，35個循環；最後72°C延伸7min。對於瓊脂糖凝膠電泳，凝膠濃度通常在O. 5 2. 0%之間，低濃度的用來進行大片段核酸的電泳，高濃度的用來進行小片段核酸的電泳。本發明中採用的凝膠濃度為1.0%。因所述的390bp和746bp片段大小差異較大，I. 0%的凝膠濃度已足夠將二者分開，同時也節省了材料。與現有技術相比較，本發明有益效果為I、本發明所獲得的引物是依據zju_lpa3突變體與正常水稻品種在核苷酸序列上的差異設計合成的，因此不存在遺傳上的交換，也不需要表型的進ー步驗證。2、利用本發明獲得的引物可以對大量zju-lpa3雜交後代群體進行篩選，從而準確高效鑑定出含水稻低植酸基因ZJU-LPA3的LPA水稻材料。 3、通常LPA水稻材料的鑑定必須等到水稻種子成熟以後才能進行，而利用和水稻低植酸基因ZJU-LPA3共分離的引物可在苗期對其葉片進行檢測，可大大提高LPA水稻品種的選擇效率，加快LPA水稻育種進程。


圖I為用於水稻低植酸基因ZJU-LPA3檢測的PCR引物設計策略，其中黑色方框代表蛋白編碼區，白色方框代表UTR，折線代表內含子，箭頭代表引物位置。圖2為引物ZHJ3對嘉興08-lXzju-lpa3F2代單株的選擇效果。其中M為DNA分子量標準；1泳道為嘉興08-1 ；2泳道為zju-lpa3 ；3泳道為嘉興OS-IXzju-IpaSF1代；4、
6、7、14、18泳道為不含ZJU-LPA3基因純合型的正常植酸含量單株；5、8、9、10、11、13、15泳道為ZJU-LPA3基因雜合型的正常植酸含量單株；12、16、17泳道為ZJU-LPA3基因純合型的低植酸單株。圖3為引物ZHJ3在不同水稻品種中的PCR擴增結果。其中M為DNA分子量標準；
I泳道為嘉興08-1 ；2泳道為日本睛；3泳道為9311 ；4泳道為嘉禾218 ；5泳道為秀水110。
具體實施例方式一、引物設計水稻低植酸突變體zju_lpa3由6ciCo- Y射線誘變處理秈稻品種協青早B獲得，植酸含量下降46%，無機磷含量升高6. 4倍(Liu, Q. L.，Xu, X. H.，Ren, X. L.，Fu, H. ff.，Wu, D. X.，and Shu, Q. Y. 2007. Generation and characterization of low phytic acidgermplasm in rice (Oryza sativa L.). Theoretical and Applied Genetics 114(5)803-814)，遺傳分析和基因定位表明，水稻低植酸突變體zju-lpa3植酸含量由單隱性核基因控制，定位在水稻第2號染色體的長臂上，進ー步的研究結果表明z ju_lpa3低植酸含量性狀受2-PGK等位突變基因ZJU-LPA3控制，在基因組序列上缺失了ー個1475bp的大片段，在TIGR V7. O (http://rice. plantbiology. msu. edu/)下載相應的核苷酸序列，並對序列進行比對分析。利用Primer Premier 5. O (www. premierbiosoft. com)軟體在水稻低植酸基因ZJU-LPA3缺失片段保守區域附近設計相應的引物，並將新合成的標記命名為ZHJ3(圖I)，其引物序列如下
正向引物序列ZW3F為 5 』 -AATTAACGGCTTGTAAAACGTG-3 』和ZW4F 為 5，-GGTTCCCACTCGGTATGCG-3，；反向引物序列ZW3R為 5，-ACGATGGTTGTTTGGGTCTTG-3，。引物結合部位在基因的保守區域，水稻序列資料庫檢索結果表明該引物具有較好特異性，在採用不同水稻品種進行PCR擴增時，可見均能檢測出特異性的目標條帶(圖3)。ニ、DNA提取及PCR檢測利用上述引物可以對水稻低植酸突變體zju-lpa3雜交後代的基因型進行鑑定，具體方法為(I)總DNA的提取
採用CTAB法提取水稻樣品苗期嫩葉的總DNA，具體操作方法如下將葉片剪碎後置於2. OmL離心管中，加入800μ L CTAB提取緩衝液(IOOmM Tris-HCl pH 8. 0、20mM EDTApH8. 0、500mM NaCl,2% CTAB)，用組織碾磨儀磨碎，65°C水浴40min，期間搖動3-4次，加入等體積的氯仿異戊醇(24 :1，v/v)混合液，上下顛倒混勻，10000r/min離心lOmin，轉移上清至新的I. 5mL離心管中，加入等體積預冷(_20°C )的異丙醇，輕輕顛倒混勻，置-20°C下沉澱30min ；10000r/min離心IOmin,棄上清液,70%こ醇洗漆2次，自然風乾,溶於適量(100-200 μ L)TE 溶液中，_20°C保存。(2)對總DNA進行PCR擴增檢測PCR 反應體系為 20 μ L，其中，2 XPCR Master Mix 緩衝液 10 μ L (含 I. 5mM Mg2+、200 μ M dNTPUU Taq 酶)、10 μ M 正反向引物各 O. 4 μ L、50ng/μ L 總 DNA I μ L、滅菌去離子水補至20 μ L0PCR 反應程序為94°C預變性 4min ;94°C變性 30s，57°C退火 45s，72°C延伸 lmin，35個循環；最後72°C延伸7min。擴增產物在1%瓊脂糖凝膠上電泳，經溴化こ錠染色後拍照成像。(3)判斷是否含有目標基因採用引物ZHJ3擴增時，若只能擴出390bp特徵帯，則該樣品為含水稻低植酸基因ZJU-LPA3的純合型材料；若只能擴出746bp特徵帶，則該樣品為不含水稻低植酸基因ZJU-LPA3的純合型材料；若能同時擴出390和746bp特徵帶，則該樣品為含水稻低植酸基因ZJU-LPA3的雜合型材料。三、引物ZHJ3對基因型ZJU-LPA3雜交後代的選擇效果利用設計合成引物ZHJ3，對含Z JU-LPA3基因純合型材料z ju_lpa3和不含ZJU-LPA3基因純合型材料嘉興08-1的F2代在苗期進行PCR基因型檢測，檢測結果如圖2所示，將材料分為3種基因型具有390bp特徵帶的材料，具有746bp特徵帶的材料和兩者兼具的材料。收穫匕植株上的F2 : 3種子，利用化學分析法及離子交換色譜法檢測每個單株的植酸含量，結果表明，所有具有390bp特徵帶的單株均是低植酸含量單株，而具有746bp特徵帶和二者兼具的材料均為植酸含量正常的單株。因此，引物ZHJ3為共顯性的基因功能性標記，檢測結果與預期完全相符，標記選擇效率達到100%。
權利要求
1.一種引物，其特徵在於，正向引物為ZW3F和ZW4F，反向引物為ZW3R ；ZW3F :5』 -AATTAACGGCTTGTAAAACGTG-3』ZW4F :5』 -GGTTCCCACTCGGTATGCG-3』 ；ZW3R :5』 -ACGATGGTTGTTTGGGTCTTG-3』。
2.一種鑑定水稻低植酸突變體zju-lpa3雜交後代基因型的方法，包括如下步驟 (1)提取水稻樣品苗期葉片的總DNA； (2)以所述總DNA為模板，利用權利要求I所述的引物進行PCR擴增，擴增產物經凝膠電泳分離、染色後拍照成像； (3)根據成像結果，判斷水稻樣品的基因型； 若只出現390bp特徵帶，則該水稻樣品為不含水稻低植酸基因ZJU-LPA3的純合型材料；若只出現746bp特徵帶，則該水稻樣品為含水稻低植酸基因ZJU-LPA3的純合型材料；若同時出現390和746bp特徵帶，則該水稻樣品為含水稻低植酸基因ZJU-LPA3的雜合型材料； 所述水稻低植酸基因ZJU-LPA3的鹼基序列如SEQ ID NO. I所示。
3.根據權利要求2所述的方法，其特徵在於，採用CTAB法提取總DNA。
4.根據權利要求2所述的方法，其特徵在於，所述PCR擴增的反應體系為20μ L，其中，2 X PCR Master Mix緩衝液10 μ L、10 μ M正反向引物各O. 4 μ L、總DNA I μ L、滅菌去離子水補至20 μ L0
5.根據權利要求2所述的方法，其特徵在於，所述PCR擴增的反應程序為94°C預變性4min ;94°C變性 30s, 57°C退火 45s, 72°C延伸 lmin, 35 個循環；最後 72°C延伸 7min。
全文摘要
本發明公開了一種鑑定水稻低植酸突變體zju-lpa3雜交後代基因型的引物及方法，該引物鹼基序列如SEQ ID NO.2～4所示，該方法包括(1)提取水稻樣品苗期葉片總DNA；(2)以所述總DNA為模板，利用所述的引物進行PCR擴增，擴增產物經凝膠電泳分離、染色後拍照成像；(3)根據成像結果，判斷水稻樣品的基因型；本發明公開的引物為基因功能性引物，因此，不存在遺傳上的交換，也不需要表型的進一步驗證；可以對大量zju-lpa3雜交後代群體進行篩選，並且可在苗期對其葉片進行檢測，從而準確高效鑑定出含水稻低植酸基因ZJU-LPA3的LPA水稻材料，加快LPA水稻育種進程。
文檔編號C12Q1/68GK102808028SQ201210297318
公開日2012年12月5日 申請日期2012年8月21日 優先權日2012年8月21日
發明者舒慶堯, 趙海軍, 譚瑗瑗, 劉慶龍 申請人:浙江大學