一種擴增未知序列的半隨機pcr技術及其引物和試劑盒的製作方法
2023-05-22 01:37:46 2
專利名稱：一種擴增未知序列的半隨機pcr技術及其引物和試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物技術領域，特別涉及一種擴增未知序列的半隨機PCR技術及其引物和試劑盒。
背景技術：
聚合酶鏈式反應技術(PCR)是分子生物學中的重要技術手段，但PCR技術中必須設計引物，這就需要知道目標基因的部分序列。到目前為止，絕大多數物種的基因組序列仍然未知，而且基因序列變異大，引物設計困難。人們設計出各種技術方案，檢測未知序列。其中建庫測序較準確，但操作繁雜，實驗時間長，經費高；現有的隨機引物PCR技術，雖然操作較簡單，費用較低，但是因為PCR擴增程序中退火溫度相對較低，所以擴增出的核酸目的序列特異性較差。
發明內容
因此，本發明要解決的技術問題就是針對現有的隨機引物PCR技術退火溫度較低，擴增出的核酸目的序列特異性較差的缺陷，提供一種擴增未知序列的半隨機PCR技術及其引物和試劑盒。為解決上述技術問題，本發明採取的技術方案之一是一種寡核苷酸，其中所述寡核苷酸序列從5』端到3』端依次為12 30個固定鹼基,3 8個全簡併的鹼基N和3 7個固定鹼基，其中所述N為A或G或C或T。本發明所述寡核苷酸為本領域常規的寡核苷酸。其中所述寡核苷酸較佳地包括多聚脫氧核糖核苷酸、多聚核糖核苷酸及其他類型的多核苷酸中的一種或幾種；如嘌呤或嘧啶鹼基經過修飾後的嘧啶或嘌呤鹼基。「寡核苷酸」和「核酸」之間沒有長度上的區別，可以互換使用。本發明所述的寡核苷酸來源為本領域常規來源，所述寡核苷酸的來源較佳地包括人工合成寡核苷酸或從天然存在的基因組中提取獲得所述的寡核苷酸。其中所述寡核苷酸的人工合成方法較佳地包括磷酸三酯法、磷酸二酯法、二乙基磷酸醯胺法和固相載體法中的一種或幾種。其中所述寡核苷酸的序列優選地為如序列表中SEQ ID NO. I或SEQ ID NO. 2所示。其中所述寡核苷酸中的N代表的核苷酸較佳地包括長度為3 8個全簡併鹼基的核苷酸，其中所述全簡併核苷酸優選地為由6個全簡併鹼基組成的核苷酸。其中所述的全簡併鹼基為本領域常規的核苷酸鹼基，所述全簡併核苷酸鹼基較佳地包括腺嘌呤(A)、鳥嘌呤(G)、胞嘧啶(C)或胸腺嘧啶(T)。為解決上述技術問題，本發明採取的技術方案之二是一種PCR步移擴增基因試劑盒，其中所述PCR步移擴增基因試劑盒包括如上所述的寡核苷酸、dNTP、MgCl2、10XPCR緩衝液和TaqDNA聚合酶。其中所述PCR步移擴增基因試劑盒較佳地包括本領域常規PCR試劑。所述PCR試劑較佳地包括dNTP、MgCl2溶液、PCR緩衝液和TaqDNA聚合酶。
為解決上述技術問題，本發明採取的技術方案之三是一種PCR步移擴增基因的方法，其中所述PCR步移擴增基因的方法以前述的寡核苷酸為引物，以目標DNA為模板，所述PCR步移擴增基因的方法的反應體系包括如前所述的寡核苷酸0. 2 3iimol/L，0. 2 Immol /T, dNTP, I. 5 3mmol/L 的 Mg2+, Taq DNA 聚合酶 0. 02 IU/ u L,模板核昔酸的添加量為20 IOOOng ;所述PCR擴增的反應程序包括(I) 92 95°C，變性 3 6 分鐘；(2) 92 94°C，變性 30 45 秒；(3)52。〇 64。〇，退火30秒；(4) 72°C延伸2分鐘，其中步驟(2) (4)重複30 45個循環；(5) 70 75°C延伸 120 300 秒；
·
(6)產物於4°C保存。本發明所述的PCR步移擴增基因的方法為本領域常規使用的核酸目的序列擴增方法。所述核酸目的序列的擴增方法較佳地指聚合酶鏈式反應(PCR)。所述聚合酶鏈式反應(PCR)是指體外酶促合成核酸特異目的片段的一種方法，該方法程序較佳地包括高溫變性、低溫退火(復性)及適溫延伸等幾步反應組成一個周期，循環進行，從而使核酸目的片段得以迅速擴增。其中所述聚合酶鏈式反應體系為本領域常規的聚合酶鏈式反應(PCR)體系，所述PCR反應體系較佳地包括寡核苷酸(引物)、核酸聚合酶、dNTP、模板核苷酸和Mg2+。本發明所述PCR反應體系較佳地包括所述的寡核苷酸含量較佳地為0. 2 3 ii mol/L,優選地為0. 5 ii mol/L,所述dNTP的含量較佳地為0. 2 lmmol/L，含量優選地為0. 2mmol/L, Mg2+濃度較佳地為I. 5 3mmol/L，濃度優選地為I. 5mmol/L, Taq DNA聚合酶添加量較佳地為0. 02 IU/ u L，添加量優選地為0. 02U/ u L，模板核苷酸添加量較佳地為20 lOOOng，添加量優選地為50ng。其中所述聚合酶鏈式反應條件為本領域常規的PCR反應條件,所述PCR反應程序較佳地包括(I)變性溫度較佳地為92 95°C，優選地為94°C，變性時間為較佳地為3 6min，優選地為5分鐘；(2)變性溫度較佳地為92 94°C，優選地為94°C，變性時間較佳地為30 45秒，優選地為30秒；(3)退火溫度較佳地為52 60°C，優選地為56°C，退火時間較佳地為30秒；(4)延伸溫度優選地為72°C，延伸時間優選地為2分鐘，其中步驟(2) (4)循環次數較佳地為30 45，優選地為30個循環；(5)延伸溫度較佳地為70 75°C，優選地為72°C，延伸時間較佳地為120 300秒，優選地為300秒；(6)產物於4°C保存。本發明所用的原料或試劑除特別說明之外，均市售可得。相比於現有技術，本發明的有益效果如下利用本發明提供的半隨機PCR技術及其引物和試劑盒進行聚合酶鏈式反應，無需設計引物即可擴增目標基因序列，該方法通用性強，特別適合未知基因序列的擴增。本發明所述PCR反應程序簡單，退火溫度高於50°C，擴增序列特異性較強，來源於微生物、動物、植物等基因序列未知的樣品均可使用該方法，因此該方法通用性強，具有十分廣闊的應用前景。
以下結合
本發明的特徵和有益效果。圖I是XA菌株半隨機引物PCR結果。I是PCR結果電泳圖譜，M是DL2，000DNAmarker。圖2是BX動物基因組半隨機引物PCR結果。I是PCR結果電泳圖譜，M是DL2, 000DNA marker0
具體實施方式
下面用實施例來進一步說明本發明，但本發明並不受其限制。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，或按照製造廠商所建議的條件。實施例I隨機引物鑑定微生物種類I. I模板製備從汙染乳品中分離細菌使用3ml LB培養基，加入0. Iml的汙染乳品，37°C培養48小時，篩選得到汙染乳品中的未知細菌。提取細菌基因組。使用的試劑盒為TaKaRa minibest bacterial genomic dnaextraction kit ver. 2. 0 (Takara Biotechnology (Dalian) Co.，Ltd.),抽提從汙染乳品中分離的細菌基因組DNA。所述細菌基因組DNA編號為XA。1.2PCR 擴增使用半隨機引物API :5，_ggc gtt tat tea gaa g(n)6cgc c_3』做 PCR 擴增。PCR程序為(I) 94°C，變性時間 5min ；(2) 94°C，變性 30S ;(3) 52°C，退火 30S ;(4) 70°C，延伸30S ;步驟(2) (4)重複30個循環；(5)72。〇延伸51^11(6)產物於4°C保存。PCR反應體系體積為20iU，其中各組分終濃度為liimol/L半隨機引物，0. 2mmol/L dNTP, I XPCR 緩衝液，I. 5mM 的 Mg2+，Taq DNA 聚合酶 0. 02U/ u L,模板 20ng。其中 TaqDNA 聚合酶的生產商是 TakaraBiotechnology (Dalian) Co. , Ltd.，商品號為 DR001A。PCR產物電泳結果見圖1，圖中編號「I」為XA半隨機引物PCR結果，「M」為DL2, 000DNA Marker,購自 Takara Biotechnology (Dalian) Co, Ltd.。將泳道 I 中大於 500bp的所有目的條帶回收純化，克隆測序。挑選6個克隆子測序，所測序列在NCBI網站做BLAST，其結果都僅僅與枯草芽孢桿菌同源性大於99%，與其它細菌同源性低。由此鑑定XA為枯草芽孢桿菌。實施例2隨機弓I物鑑定動物種類2. I模板製備
提取動物組織基因組DNA。所用試劑盒為DNA isolation reagent for meat andmeat products,購自 Takara Biotechnology (Dalian) Co, Ltd.。所得的動物組織基因組編號為BX。2. 2PCR 擴增用半隨機引物AP2 :5，-gtc ggc gtt tat tea gaa g(n)6acg cc_3，做 PCR 擴增。PCR程序為(I) 94°C,變性 5min ；(2) 94°C，變性 30S ;(3) 58°C，退火 30S ;
(4)72°C，延伸兩分鐘；步驟(2) (4)重複30個循環；(5)72。0延伸51^11(6)產物於4°C保存。PCR反應體系體積為20iU，其中各組分終濃度為liimol/L半隨機引物，0. 2mmol/L (1見？，1\ 0 緩衝液，I. 5mM 的Mg2+，TaqDNA聚合酶 0. 02U/y L，模板DNA200ng，其中 TaqDNA 聚合酶的生產商為 Takara Biotechnology (Dalian) Co. , Ltd.,商品號為 DR001A。PCR產物電泳結果見圖2，圖中編號「I」為動物基因組PCR結果，「M」為DL2，000DNAMarker,購自 Takara Biotechnology (Dalian) Co, Ltd.。將泳道I中大於500bp的所有目的條帶回收純化並克隆測序。所測序列在NCBI網站做BLAST，其結果與牛基因同源性大於99%，與其它物種同源性低。由此鑑定BX為牛的組織。實施例3隨機引物鑑定微生物種類3. I模板製備從汙染乳品中分離細菌的方法為使用3ml LB培養基，加入0. Iml的汙染乳品，37°C培養48小時，篩選得到汙染乳品中的未知細菌。提取細菌基因組。使用的試劑盒為TaKaRa minibest bacterial genomic dnaextraction kit ver.2.0,購自 Takara Biotechnology (Dalian) Co, Ltd ,抽提從汙染乳品中分離的細菌基因組DNA。所述細菌基因組DNA編號為XC。3. 2PCR 擴增使用半隨機引物APl :5，-ggcgtt tat tea gaa g(n)6cgc c_3，做 PCR 擴增。PCR程序為(I) 95°C，變性 6 分鐘;(2) 94°C，變性 45 秒;(3) 64°C，退火 30 秒；(4) 72°C延伸2分鐘，其中步驟(2) (4)重複45個循環；(5) 75°C延伸 180 秒;(6)產物於4°C保存。PCR反應體系體積為20iU，其中各組分終濃度為3iimol/L半隨機引物，0. 2mmol/L (1見？，1\ 0 緩衝液，I. 5ml^9Mg2+，Taq DNA聚合酶 0. 02U/y L，模板DNAlOOOng。其中TaqDNA聚合酶的生產商是Takara Biotechnology (Dalian) Co, Ltd.，商品號為DROOIA。將泳道中大於500bp的所有目的條帶回收純化，克隆測序。挑選5個克隆子測序，所測序列在NCBI網站做BLAST，結果都僅僅與枯草芽孢桿菌同源性大於99%，與其它細菌同源性低。由此鑑定XC為枯草芽孢桿菌。實施例4隨機引物鑑定動物種類4. I模板製備提取動物組織基因組DNA。所用試劑盒為DNA isolation reagent for meat andmeat products,購自 Takara Biotechnology (Dalian) Co, Ltd.。所得的動物組織基因組編號為DX。4. 2PCR 擴增 用半隨機引物AP2 :5，-gtc ggc gtt tat tea gaa g(n)6acg cc_3，做 PCR 擴增。PCR程序為(1)94 °C，變性 5 分鐘;(2) 93°C，變性 40 秒;(3) 60°C，退火 30 秒；(4) 72°C延伸2分鐘，其中步驟(2) (4)重複30 45個循環；(5) 72°C延伸 120 秒;(6)產物於4°C保存。PCR反應體系體積為20iU，其中各組分終濃度為0. 2 mol/L半隨機引物，
0.2mmol/LdNTP, I X PCR 緩衝液，I. 5mM 的 Mg2+，TaqDNA 聚合酶 0. 02U/ u L,模板 DNA500ng，其中 TaqDNA 聚合酶的生產商為 Takara Biotechnology (Dalian) Co, Ltd.,商品號為 DR001A。將泳道中大於500bp的所有目的條帶回收純化克隆測序。所測序列在NCBI網站做BLAST，結果與牛基因同源性大於99%，與其它物種同源性低。由此鑑定DX為牛的組織。應理解，在閱讀了本發明的上述內容之後，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申請所附權利要求書所限定的範圍。
權利要求
1.一種寡核苷酸，其特徵在於，所述寡核苷酸序列從5』端到3』端依次為12 30個固定鹼基，3 8個全簡併的鹼基N和3 7個固定鹼基，其中所述N為A或G或C或T。
2.如權利要求I所述的寡核苷酸，其特徵在於，所述寡核苷酸的序列如序列表中SEQID NO. I 或 SEQ ID NO. 2 所示。
3.—種PCR步移擴增基因的試劑盒，其特徵在於，所述PCR步移擴增基因的試劑盒包括如權利要求I所述的寡核苷酸。
4.如權利要求3所述的PCR步移擴增基因的試劑盒，其特徵在於，所述PCR步移擴增基因的試劑盒還包括dNTP，MgCl2,10XPCR緩衝液和TaqDNA聚合酶。
5.—種PCR步移擴增基因的方法，其特徵在於，所述PCR步移擴增基因的方法以權利要求I所述的寡核苷酸為引物，以目標DNA為模板，進行PCR擴增反應，所述PCR擴增反應的體系包括權利要求I所述的寡核昔酸O. 2 3 μ mol/L, O. 2 Immol /T, dNTP, I. 5 3mmol/L的Mg2+，Taq DNA聚合酶O. 02 IU/ μ L，模板核苷酸的添加量為20 IOOOng ;所述PCR擴增的反應程序包括 (1)92 95°C，變性3 6分鐘； (2)92 94°C，變性30 45秒； (3)52 64°C，退火 30 秒； (4)72°C延伸2分鐘，步驟(2) (4)重複30 45個循環； (5)70 75°C延伸 120 300 秒； (6)產物於4°C保存。
6.如權利要求5所述PCR步移擴增基因的方法，其特徵在於，所述PCR步移擴增基因的方法的反應體系包括0. 5 μ mol/L權利要求I所述的寡核苷酸，O. 2mmol/L dNTP, I. 5mmol/L Mg2+，O. 02U/ μ L Taq DNA 聚合酶和 20 500ng 模板。
7.如權利要求5所述PCR步移擴增基因的方法，其特徵在於，所述所述PCR步移擴增基因的程序包括 (1)95°C變性5分鐘； (2)94°C變性 30 秒； (3)56°C退火30 秒； (4)72°C延伸2分鐘，步驟(2) (3)重複30個循環； (5)72°C，延伸300 秒； (6)產物於4°C保存。
全文摘要
本發明公開了一種擴增未知序列的半隨機PCR技術及其引物和試劑盒。半隨機引物序列從5』端到3』端依次為12～30個固定鹼基，3～8個全簡併的鹼基N和3～7個固定鹼基，其中所述N為A或G或C或T。半隨機引物的序列如序列表中SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。包含該引物的PCR反應程序優選地包括(1)95℃變性5分鐘；(2)94℃變性30秒；(3)56℃退火30秒；(4)72℃延伸2分鐘，步驟(2)～(3)重複30個循環；(5)72℃，延伸300秒；(6)產物於4℃保存。該半隨機引物通用性強，特別適合未知基因序列的擴增，該PCR反應程序簡單，擴增核酸目的序列特異性較強。
文檔編號C12N15/11GK102757960SQ201210266240
公開日2012年10月31日 申請日期2012年7月30日 優先權日2012年7月30日
發明者任婧, 張紅髮 申請人:光明乳業股份有限公司