甲型h1n1流感病毒總抗體檢測試紙的製作方法

2023-05-22 01:43:41

專利名稱：甲型h1n1流感病毒總抗體檢測試紙的製作方法
技術領域：
本實用新型是涉及生物應用技術領域，特別是涉及一種以膠體金免疫層析法快速 檢測甲型Hmi流感病毒總抗體檢測試紙。
背景技術：
甲型Hmi流感病毒是一種新型的流感病毒，2009年在世界範圍內大流行，嚴重 危害人類的健康。其「Ha」指的是血球凝集素(Hemagglutinin)、「Na」指的是神經氨酸酶 (Neuraminidase)，甲型流感病毒H有1 15型，有1 9型。Hmi是甲型流感病毒的一 種，也是危害最大的病毒之一。在歷史上曾造成數次大流行。目前對甲型Hmi流感檢測的主要方法是PCR基因擴增診斷方法，鼻咽試紙抗原診 斷方法等。在抗體檢測方面，有ELISA等檢測方法，但用膠體金類免疫層析技術對甲型Hmi 總抗體進行檢測尚未有相關報導。對Hmi總抗體檢測主要有已下作用ι 對Hmi流感進 行輔助診斷。根據「甲型Hmi流感診療方案」第三版，甲型Hmi流感病原學檢測方法之一 為動態檢測雙份血清甲型Hmi流感病毒特異性抗體水平呈4倍或4倍以上升高，是感染 HlNl流感病毒的指標。2 對是否已感染Hmi進行鑑別，隱性感染或感染過該病毒的人體 內抗Hmi病毒總抗體將長期存在。3 對免疫接種的效果進行評價，從數據上看，目前Hmi 接種的有效率約為90%，尚有10%的人需要篩選出來重新接種或用其它方式進行該病的 預防。考慮到感染和接種的人群巨大，運用一種快速、簡便、有效的抗體檢測方法非常必要。免疫層析膠體金技術是新型的診斷技術，在抗體檢測方面已得到較為廣泛運用， 基本原理如下利用膠體金標記一種抗原或抗體，在試劑的NC膜上包被相應的配對抗原或 抗體，檢測時當樣品中含相應的特異性抗體或抗原時，膠體金標記顆粒和樣品中配體相結 合形成複合物，然後在NC膜上層析，再被包被抗原或抗體捕獲，形成肉眼可見的檢測T線， 通過檢測線的有無實現對結果的判定。具有操作簡便、反應快速、敏感性高、特異性強、適合 現場檢測和經濟實用等優點。
發明內容本實用新型的目的是提供一種甲型Hmi流感病毒總抗體檢測試紙，採用雙抗原 夾心法製備，具有操作簡便、反應快速、敏感性高、特異性強、適合現場檢測和經濟實用等優
點O本實用新型提供一種甲型Hmi流感病毒總抗體檢測試紙，其特徵在於塑料支撐 板7 —端連接上樣墊1，上樣墊1的一端緊密壓接含有標記Hmi特異性的血球凝集素Ha或 HlNl特異性的血球凝集素Ha和神經氨酸酶Na抗原的膠體金墊2，膠體金墊2 —端緊密壓 接硝酸纖維素NC膜3，硝酸纖維素NC膜3包被有相互分離的檢測T線5和質控C線6，T線 為包被在NC膜上的的Hmi特異性的血球凝集素Ha或Hmi特異性的血球凝集素Ha和神 經氨酸酶Na抗原，C線為包被在NC膜上的抗Hmi抗體，硝酸纖維素NC膜3的另一端連接 吸樣墊4形成試紙。[0007]所述的甲型Hmi流感病毒總抗體檢測試紙，其特徵在於所述的抗原為Hmi特異 性的血球凝集素(Ha)和神經氨酸酶(Na)抗原，抗原可以從Hmi病毒中純化提取或利用基 因工程重組表達。所述的甲型Hmi流感病毒總抗體檢測試紙，其特徵在於所述的上樣墊1為玻璃纖 維膜或無紡布，吸樣墊由吸水濾紙構成4。所述的甲型Hmi流感病毒總抗體檢測試紙，其特徵在於，所述的抗原的包被方法 為以0. OlM PH 7. 2磷酸鹽緩衝液(PBS)將Hmi特異性的血球凝集素(Ha)和(或)神經 氨酸酶(Na)抗原配製成0. 5-2mg/ml的溶液，用噴膜儀在NC膜下部以lul/cm的參數進行 劃線，包被T線，同時在NC膜上部包被抗Hmi抗體作為C線，劃線後將NC膜在乾燥間，溫 度20-25°C，溼度小於30%，乾燥2-5小時。上述的甲型Hmi流感病毒總抗體檢測試紙，其特徵在於，所述的抗原標記膠體金 顆粒的方法為以氯金酸-檸檬酸三鈉還原法製備直徑為30-50nm的膠體金溶液，製備完 成後取IOOml膠體金液放在燒杯內，用0. 2M K2CO3調至pH8. 0，按IOOml膠體金溶液加入 0. 5-2mg HlNl血球凝集素(Ha)和神經氨酸酶(Na)抗原，室溫攪拌2小時，加入牛血清 白蛋白BSA，0. 1 %聚乙二醇PEG20000封閉20min，12000r/m離心30分鐘，棄上清，用膠體金 工作液復溶至100ml，按Iml溶液鋪22cm2的比例均勻地鋪在玻璃纖維膜或無紡布上，再置 乾燥間，溫度20-25°C，溼度小於30%，乾燥2-5小時，製成膠體金墊。上述的甲型Hmi流感病毒總抗體檢測試紙，其特徵在於所述的試紙的裝配方法 為在乾燥室內，溫度20-25 °C，溼度小於30 %，取塑料支撐板板，將已包被的NC膜放置在 塑料支撐板的中部粘貼，在NC膜T線一側搭接膠體金墊(搭膠體金墊的1/3)粘貼，在膠體 金墊另一側搭接粘貼上樣墊，搭膠體金墊的1/5 ；在NC膜C線一側搭接吸樣墊，搭吸樣墊的 1/10 ；最後用裁剪機將貼好塑料板切成2-5mm寬的試紙條，切好的試紙條可以再裝入塑料 卡內，形成檢測卡。所述的甲型Hmi流感病毒總抗體檢測試紙，其特徵在於，檢測方法為將被檢血 清或血漿平衡至溫室，將試紙條或試劑卡平放，在上樣墊上加入50-100U1被檢樣品，樣品 溶解膠體金並在NC膜上層析，然後用肉眼直接觀察在20分鐘內C、T線的出現情況，並判定 檢測結果。本實用新型的有益效果是提供一種利用免疫層析膠體金技術檢測甲型Hmi流 感病毒總抗體檢測試紙。採用雙抗原夾心法實現對總抗體的檢測。採用膠體金標記甲型 HlNl流感病毒抗原，包被甲型Hmi流感病毒抗原實現對血液中抗甲型Hmi流感病毒總抗 體的檢測。可同時檢測IgG和IgM。具有操作簡便、反應快速、敏感性高、特異性強、適合現 場檢測和經濟實用等優點。

圖1甲型Hmi流感病毒總抗體檢測試紙結構示意圖。附圖符號說明1 上樣墊；2 膠體金墊；3 =NC膜；4 吸樣墊5 檢測(T)線；6 質控(C)線；7 塑 料支撐板
具體實施方式
實施例製備甲型Hmi流感病毒總抗體檢測試紙ι主要材料1. 1特異性甲型Hmi流感病毒Ha抗原Sino Biological Inc.公司產品，為重組 抗原，用於膠體金標記和NC膜T線包被；抗Ha抗體，用Ha免疫山羊自製，用於NC膜包被； 氯金酸=Sigma公司產品；硝酸纖維素(NC)膜=Millipore公司產品；牛血清白蛋白(BSA)， 聚乙二醇PEG20000，水解酪蛋白=Sigma產品。其它常用試劑均為分析純試劑。1. 2臨床血清由公司在相關醫院獲得，其中在近期接種Hmi疫苗樣本80份，未接 種疫苗樣本120份。1. 3 甲型 HlNl 流感病毒 IgG ELISA 試劑盒，Sino Biological Inc.產品。2 方法2. 1甲型Hmi流感病毒Ha重組抗原的膠體金標記氯金酸-檸檬酸三鈉還原法 製備直徑為40nm的膠體金溶液，製備完成後取三份膠體金，分別用0. 2M K2CO3將溶液調 到pH7. O、pH8. O和pH9. O。然後將溶液置於磁力攪拌器上緩慢攪拌，按每IOOml溶液加入 0. 5mg、lmg、l. 5mg將重組抗原將蛋白緩慢滴加到膠體金溶液中，繼續攪拌2小時，再滴加入 到終濃度為0. 1 %的PEG2000和1 %的BSA進行封閉20min,標記結束後以12000r/m離心， 棄上清，沉澱按原體積復溶至不同配比的膠體金工作液硼酸鹽緩衝液，PH8. 0，含BSA、羊血 清，蔗糖和表面活性劑中。然後將標記膠體金溶液按Iml溶液鋪22cm2的比例加樣於無紡 布上，在溫度20-25°C，相對溼度在< 30%的乾燥間乾燥2-4小時，製成膠體金墊。2. 2H1N1流感病毒Ha重組抗原的包被用0. OlM pH7. 2PBS將Hmi流感病毒Ha重 組抗原分別稀釋成0. 5mg/ml、lmg/ml、2mg/ml，然後用噴膜儀在NC膜下部按lul/cm進行劃 線包被，同時在NC膜上部包被抗Ha抗體，用於產品的質控，包被完成後將NC膜在在溫度 20-25°C，相對溼度在< 30%的乾燥間乾燥2-5小時。2. 3甲型Hmi流感病毒總抗體快速檢測試紙的組裝在乾燥室內(溫度20_25°C， 相對溼度 0. 05。試劑性能和ELISA試劑相比無顯著 性差異，適合臨床檢測需要。
權利要求一種甲型H1N1流感病毒總抗體檢測試紙，其特徵在於塑料支撐板(7)一端連接上樣墊(1)，上樣墊(1)的一端緊密壓接含有標記H1N1特異性的血球凝集素Ha或H1N1特異性的血球凝集素Ha和神經氨酸酶Na抗原的膠體金墊(2)，膠體金墊(2)一端緊密壓接硝酸纖維素(NC)膜(3)，硝酸纖維素(NC)膜(3)包被有相互分離的檢測(T)線(5)和質控(C)線(6)，T線為包被在NC膜上的的H1N1特異性的血球凝集素Ha或H1N1特異性的血球凝集素Ha和神經氨酸酶Na抗原，C線為包被在NC膜上的抗H1N1抗體，硝酸纖維素(NC)膜(3)的另一端連接吸樣墊(4)形成試紙。
2.根據權利要求1所述的甲型Hmi流感病毒總抗體檢測試紙，其特徵在於所述的上樣 墊(1)為玻璃纖維膜或無紡布，吸樣墊由吸水濾紙構成(4)。
專利摘要本實用新型是涉及生物應用技術領域，特別是涉及一種甲型H1N1流感病毒總抗體檢測試紙，採用雙抗原夾心法實現對總抗體的檢測。採用膠體金標記甲型H1N1流感病毒抗原，包被甲型H1N1流感病毒抗原實現對血液中抗甲型H1N1流感病毒總抗體的檢測。可同時檢測IgG和IgM。具有操作簡便、反應快速、敏感性高、特異性強、適合現場檢測和經濟實用等優點。
文檔編號G01N33/569GK201637744SQ20102014209
公開日2010年11月17日 申請日期2010年3月26日 優先權日2010年3月26日
發明者李洲, 楊發青 申請人:天津中新科炬生物製藥有限公司