人炎性乳腺癌細胞系及其建立方法
2023-05-21 18:34:11
專利名稱：人炎性乳腺癌細胞系及其建立方法
技術領域：
本發明屬微生物動物細胞系領域，具體涉及一種人炎性乳腺癌細胞系的建立及其建立方法。
背景技術：
乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤，血道轉移與淋巴道播散是乳腺癌最重要的兩條轉移途徑。遠處轉移是影響腫瘤療效和預後，導致患者死亡的主要因素。炎性乳腺癌(inflammatory breast cancer，IBC)是一種較罕見的高度惡性、預後極差的特殊類型乳腺癌，其組織病理學特徵為廣泛的淋巴道播散-真皮淋巴管內瘤栓浸潤導致乳腺皮膚紅腫等「炎性」改變，短期內出現遠處轉移。絕大多數病例就診時已無手術指徵，患者平均生存期低於2.5年。
目前對炎性乳腺癌特殊生物學特徵的分子機制尚不十分清楚，也無理想的治療方案和藥物。迄今為止，炎性乳腺癌自發性動物模型尚未成功建立，無法利用在體腫瘤轉移的生物學研究模型進行探索預測腫瘤轉移的早期、敏感、特異的指標；無法進行篩選和驗證創新藥物；無法為進一步提高腫瘤的綜合防治效果提供技術支撐。
建立腫瘤細胞系的常用方法是採用腫瘤患者標本直接接種裸鼠，在裸鼠體內大量增殖並通過在體篩選過程，建立穩定的移植瘤模型，再行體外連續培養，得到穩定傳代的細胞系。另一種方法是取患者腫瘤組織塊或細胞體外直接進行原代培養，篩選和建立穩定傳代的細胞系。影響腫瘤細胞系建立的因素很多，如腫瘤組織的活力狀態、組織塊的大小、培養基的種類選擇等。目前普遍應用的人癌轉移模型，是人癌接種於免疫缺陷動物，主要是指在裸小鼠體內形成的人癌裸鼠轉移模型，和能在免疫缺陷動物體內發生轉移的人癌細胞系。人乳腺癌移植模型成功率僅10％左右。
發明內容
本發明的目的是提供一種具有高轉移表型的人炎性乳腺癌細胞系，為研究炎性乳腺癌的特殊生物學特性和腫瘤轉移的分子機制提供細胞模型與研究工具。
本發明的另一目的是提供高轉移表型的人炎性乳腺癌細胞系的建立方法。
本發明採用人類炎性乳腺癌裸鼠移植瘤動物模型(邵志敏等，中華外科雜誌)，用體外連續培養方法，篩選建立能穩定傳代的炎性乳腺癌細胞系，命名IBC-1。
本發明人炎性乳腺癌細胞系IBC-1，癌細胞呈多極形上皮形態特徵，聚集成片或團簇狀，貼壁牢固，難消化分離，染色體呈亞三倍體核型，染色體結構畸變，染色體眾數範圍49~61條，佔總數的71.6％，細胞增殖周期與凋亡符合腫瘤細胞特徵，S期42.90％，G2/G11.89，成瘤率高，能再現炎性乳腺癌的臨床特徵，指數增殖期在第3~6天，蛋白印跡E-cadherin陽性。細胞凍存復甦後生長良好，能夠連續傳代。
本發明通過下述方法和步驟建立炎性乳腺癌細胞系。
1、原代及傳代移植1)按已知方法無菌切取腫瘤組織，進行原代皮下原位接種。
2)按原代移植的方法繼續系列傳代。
2、瘤細胞原代培養取新鮮炎性乳腺癌裸鼠移植瘤組織塊，切成1mm3並均勻貼附於50ml Corning塑料培養瓶中，加入5ml DMEM培養基，含20％胎牛血清(FCS)。CO2培養箱，37℃幹貼壁培養，待組織塊周圍游離並長出細胞，增殖達一定面積時胰酶消化，M-199培養基連續培養。
3、建立細胞系隔5d傳代1次，分種率1∶2。體外傳代至第16代後，進行各項生物學指標檢測，記作IBC-1。至25代後培養基中FBS減至5％濃度並維持傳代。
本發明IBC-1細胞系裸鼠皮下原位接種成瘤率100％，有真皮淋巴管及血管浸潤。4周後自發性肺轉移率為100％，組織病理學檢查證實為轉移性腺癌。上述移植瘤模型的腫瘤生長曲線符合Gompertz函數模型，為潛伏期後呈指數模式生長。FCM分析顯示細胞增殖周期分布在人炎性乳腺癌細胞系IBC-1與裸鼠移植瘤細胞一致，表明模型中傳代腫瘤細胞分裂增殖趨於穩定，能較好的再現人炎性乳腺癌生長增殖的生物學特徵。
圖1為倒置顯微鏡下IBC-1細胞形態。
圖2a為IBC-1細胞系染色體，2b為IBC-1染色體核型分析(亞三倍體)。
圖3為IBC-1裸鼠原位接種移植瘤組織病理學形態(HE×400)。
圖4為人炎性乳腺癌細胞系IBC-1裸鼠接種模型。
具體實施例方式
實施例1建立炎性乳腺癌細胞系1)原代及傳代移植無菌切取腫瘤組織，進行原代皮下原位接種。
原位移植清除纖維、脂肪等非瘤組織和壞死部分，滅菌生理鹽水漂洗，瘤塊剪切成0.5mm3。動物腹腔麻醉後，碘酒、酒精消毒雌性裸小鼠乳腺表麵皮膚，將瘤組織接種於皮下脂肪墊。原代移植瘤腫瘤長至約2cm3時，處死裸小鼠，切取原代移植瘤；按原代移植的方法繼續系列傳代。
2)瘤細胞原代培養取新鮮炎性乳腺癌裸鼠移植瘤組織塊，切成1mm3並均勻貼附於50ml Cornin塑料培養瓶中，加入5ml DMEM培養基(20％FCS)。貼附面向上將培養瓶放入CO2培養箱中，37℃幹貼壁4h，待組織塊牢固貼壁後，翻轉培養瓶，使組織塊浸於培養基中繼續培養，待組織塊周圍游離並長出細胞，增殖達到培養瓶底60％面積時胰酶消化，M-199培養基連續培養，可裂解細胞團中混入的紅細胞，並抑制成纖維母細胞的競爭性生長。
3)建立細胞系每隔5d傳代1次，分種率1∶2。體外傳代至第16代後，進行各項生物學指標的檢測，記作IBC-1。至25代後培養基中FBS減至5％濃度並維持傳代。
進行實驗觀察與驗證，體外生長的IBC-1具有以下特徵1)細胞形態癌細胞呈多極形上皮形態特徵，聚集成片或團簇狀，與培養瓶壁貼附牢固，較難消化分離。
2)染色體分析挑選染色體分散良好的100個中期的分裂相細胞進行染色體分析。統計顯示，細胞染色體呈亞三倍體核型，有染色體數目和結構畸變；染色體眾數範圍49~61條，佔總數的71.6％。表1是炎性乳腺癌細胞系IBC-1染色體核型分析。
表1.
53，xx，der(1)t(1；7)，+add(1)(q21)，(q10；q10)，+add(3)(p21)，+add(3)(p13)，add(4)(q21)，+5，add(6)(p23)，add(7)(q22)，add(8)(p21)，add(8)(p11.2)，add(9)(p12)，+add(9)(q12)，add(11)(p11.2)，der(13)t(11；13)add(14)(p11.2)，add(15)(q26)，+add(16)(q11.2)，？t(18；19)(q11.2；q12)add(20)(q13.3)，add(21)(p12)，-22，+mar1，+mar2[14]/100~104，xxxx，idem，-12，-13，-14，-14，-17，-18，-18[CP2].
3)基因組DNA微衛星序列檢測人炎性乳腺癌細胞系IBC-1、原代移植瘤、傳代移植瘤三個隨機位點微衛星(D14S68、D18S69、D20S199)均擴增出完全相同的片段，而裸鼠正常乳腺組織沒有擴增出相應的帶型。
4)細胞增殖周期與凋亡流式細胞分析，檢測炎性乳腺癌移植瘤細胞S期39.38％，G2/G11.83；IBC-1細胞系S期42.90％，G2/G11.89，二者細胞周期均符合腫瘤細胞特徵，具有一致性。
5)成瘤率和生長模式成瘤率為100％，腫瘤生長符合Gompertzian指數函數模型。
6)炎性乳腺癌細胞系IBC-1生長曲線，指數增殖期在第3~6天。
7)炎性乳腺癌細胞系IBC-1以及原位移植模型生物學特性蛋白印跡檢測顯示IBC-1及移植瘤細胞E-cadherin陽性。
8)細胞凍存與復甦細胞凍存復甦後生長良好，能夠連續傳代。微生物汙染檢測細胞無細菌、真菌或支原體汙染。
權利要求
1.一種人炎性乳腺癌細胞系，其特徵在於能在體外長期生長和穩定傳代，具有下列生物學特徵和遺傳學特徵(1)細胞呈多極形上皮形態特徵，聚集成片或團簇狀，貼壁牢固，難消化分離，接觸性生長抑制喪失；(2)細胞為亞三倍體，染色體數目和結構畸變；(3)原位接種成瘤率和自發性肺轉移率為100％，能再現炎性乳腺癌的臨床特徵。
2.按權利要求1所述的人炎性乳腺癌細胞系，其特徵在於所述染色體眾數範圍49~61條，佔總數的71.6％。
3.一種按權利要求1所述的人炎性乳腺癌細胞系，其特徵在於通過下述方法建立(1)原代及傳代移植無菌切取腫瘤組織後進行原代皮下原位接種。(2)瘤細胞原代培養取新鮮炎性乳腺癌裸鼠移植瘤組織塊，貼附於培養瓶中，加入5mlDMEM培養基(20％FCS)，CO2培養箱，37℃幹貼壁4h，貼壁後，組織塊浸於培養基中繼續培養，增殖，胰酶消化，M-199培養基連續培養。(3)建立細胞系每隔5d傳代1次，分種率1∶2。體外傳代至第16代後，生物學指標檢測，驗證。
全文摘要
本發明屬微生物動物細胞系領域，具體涉及一種人炎性乳腺癌細胞系的建立及其建系方法。本發明利用人炎性乳腺癌裸鼠模型移植瘤組織作為建系瘤源，採用體外培養方式進行傳代，建成具有高轉移表型的人炎性乳腺癌細胞系。本發明細胞系細胞呈多極形上皮形態特徵，聚集成片或團簇狀，貼壁牢固，難消化分離，細胞為亞三倍體，染色體數目和結構畸變，原位接種成瘤率和自發性肺轉移率為100％，能再現炎性乳腺癌的臨床特徵，是一個較理想可靠的研究模型，適用於炎性乳腺癌的在體、體外研究，具有重要的基礎研究與臨床應用價值。
文檔編號C12N5/06GK1490403SQ03150538
公開日2004年4月21日 申請日期2003年8月25日 優先權日2003年8月25日
發明者邵志敏, 劉剛 申請人:復旦大學附屬腫瘤醫院