桑黃提取物在製備提高免疫力作用的藥物中的應用的製作方法

2023-05-21 13:20:31 1

桑黃提取物在製備提高免疫力作用的藥物中的應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種桑黃提取物在製備提高免疫力作用的藥物中的應用，該桑黃提取物的製備方法如下:（1）桑黃子實體粉碎後，用95%乙醇回流提取三次，合併三次提取液得總提取液；（2）總提取液回收乙醇後，濃縮至適量，加蒸餾水製成懸浮液，再依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取；（3）將乙酸乙酯萃取液減壓蒸餾，回收溶劑，濃縮至幹，即得桑黃提取物。本發明桑黃提取物能夠顯著提高機體免疫力，且對人體無毒無害，即使長期大劑量服用亦無任何毒副作用；同時製備方法簡單易行，操作方便，能夠有效提取多種有效成分，提取效率高，產品質量穩定。
【專利說明】桑黃提取物在製備提高免疫力作用的藥物中的應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種桑黃提取物在製備提高免疫力作用的藥物中的應用，屬於醫藥【技術領域】。
【背景技術】
[0002]桑黃,基原為多孔菌科針層孔菌的子實體,拉丁學名:phellinus igniarius(L.exFr.)Quel。又名:火木層孔菌，子實體無柄，菌蓋扁半球形或馬蹄形，木質，淺肝褐色至暗灰色或黑色，老時常龜裂，無皮殼，初期有細微絨毛，後變無毛，有同心環稜.邊緣鈍，深肉桂色至淺咖啡色，下側無子實層。菌肉深咖啡色，硬，木質。菌管與菌肉近同色，多層，但層次不明顯，年老的菌管層充滿白色菌絲。管口鏽褐色至醬色，圓形。子近球形，光滑，無色。剛毛頂端尖銳，基部膨大。菌絲不分枝，無橫隔。生於楊、柳、樺、櫟等樹幹上。分布東北、華北、西北及四川、雲南等地。桑黃具有利五臟、軟堅、排毒、止血、活血和胃止瀉之功效，主治淋病，崩漏帶下，症瘕積聚，癖飲，脾虛洩瀉。
[0003]現代研究證實桑黃含有黃酮、多糖等有效成分，具有免疫調節、抗腫瘤等多方面的藥理活性，本發明提供了一種桑黃提取物的製備方法，並以小鼠為實驗研究對象，進一步驗證該桑黃提取物的增強免疫力作用。

【發明內容】

[0004]本發明的目的在於在於提供一種桑黃提取物在製備提高免疫力作用的藥物中的應用。
[0005]為實現上述目的，本發明採用的技術方案如下:·[0006]桑黃提取物在製備提高免疫力作用的藥物中的應用。
[0007]所述的藥物劑型可以是片劑、顆粒劑、丸劑、膠囊、口服液、糖漿、凍乾粉針、水針等劑型。
[0008]所述的桑黃提取物的製備方法如下:
[0009](I)桑黃子實體粉碎後，用95%乙醇回流提取三次，每次提取2-3小時，提取溫度為75-85°C，合併三次提取液得總提取液；
[0010](2)總提取液回收乙醇後，濃縮至適量，加蒸餾水製成懸浮液，再依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取；
[0011](3)將乙酸乙酯萃取液減壓蒸餾，回收溶劑，濃縮至幹，即得桑黃提取物。
[0012]本發明的有益效果:
[0013]本發明桑黃提取物能夠活化人體免疫系統，能夠配合手術、放、化療患者提高免疫力，提早傷口癒合，減輕放、化療毒性，提高紅細胞、白細胞的數量，減小癌症復發、癌細胞轉移的風險，同時能夠減少併發症，且對人體無毒無害，即使長期大劑量服用亦無任何毒副作用；同時製備方法簡單易行，操作方便，能夠有效提取多種有效成分，提取效率高，產品質量穩定。【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]圖1為桑黃乙酸乙酯提取物對小鼠脾臟指數的影響分析圖；其中，Vs.正常組*P〈0.05，**P〈0.01(左旋咪唑為陽性藥);模型組的小鼠脾臟指數跟正常組有明顯的差異性，說明造模成功。
[0015]圖2為桑黃乙酸乙酯提取物對小鼠胸腺指數的影響分析圖；其中，Vs.正常組*P〈0.05, #P〈0.01 (左旋咪唑為陽性藥)。
[0016]圖3為桑黃乙酸乙酯提取物刺激脾細胞增殖實驗分析圖；其中，Vs.對照組*P〈0.05 ;各組藥物對小鼠的脾淋巴細胞都有刺激作用，藥物處理組跟對照組比較有顯著性差異(P〈0.05)，說明桑黃的乙酸乙酯提取物能夠刺激小鼠脾細胞的增殖。
[0017]圖4為桑黃乙酸乙酯提取物協同ConA (刀豆蛋白)刺激脾細胞的增值實驗分析圖；其中，Vs.對照組(刀豆蛋白);*P〈0.05，Vs.ConA (刀豆蛋白，5 μ g/ml);^ Ρ〈0.05 ;桑黃乙酸乙酯提取物協同ConA對小鼠的脾細胞的刺激作用跟對照組的刺激作用相比較有差異；桑黃乙酸乙酯提取物協同ConA對小鼠的脾細胞的刺激作用跟ConA單獨的刺激作用相比較，在12.5μ g/ml時沒有顯著性差異，其餘組別有顯著性差異。[0018]圖5為桑黃乙酸乙酯提取物協同LPS (脂多糖)刺激脾細胞的增值實驗分析圖；其中，Vs.LPS組(脂多糖，10 μ g/ml) ;☆ Ρ〈0.05Vs.對照組;*P〈0.05 ;桑黃乙酸乙酯提取物協同LPS對小鼠的脾細胞的刺激作用跟對照組的刺激作用相比較有差異；桑黃乙酸乙酯提取物協同LPS對小鼠的脾細胞的刺激作用跟LPS單獨的刺激作用相比較，在12.5 μ g/ml時沒有顯著性差異，其餘組別有顯著性差異。
[0019]圖6為巨噬細胞吞噬中性紅能力分析圖，其中，Vs.對照組*Ρ〈0.05, #Ρ〈0.01，LPS為脂多糖；藥物刺激巨噬細胞後，細胞的吞噬作用跟對照組相比較，吞噬作用都增加了，藥物在低濃度6.25 μ g/ml跟對照組的吞噬活性沒有顯著性差異，其餘的藥物濃度跟對照組比較都有顯著性差異。
【具體實施方式】
[0020]下面舉出實施例對本發明的製備方法進行說明，但本發明的製備方法並不限於此。
[0021]實施例
[0022]一種桑黃提取物的製備方法，包括以下步驟:
[0023](I)取桑黃子實體10kg，粉碎，用95%乙醇回流提取三次(6倍量、5倍量、4倍量)，每次提取2小時，提取溫度為80°C，合併三次提取液得總提取液；
[0024](2)總提取液回收乙醇後，濃縮至1.5g生藥/ml，加蒸餾水製成懸浮液，再依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取；
[0025](3)將得到的乙酸乙酯萃取液減壓蒸餾，回收溶劑，濃縮至幹，即得桑黃提取物462g。
[0026]下面通過試驗證明本發明桑黃提取物對免疫力提高的作用。
[0027]1、免疫力低下模型的建立
[0028]SPF級別的昆明種小鼠，18_22g，雄性，70隻。[0029]腹腔注射環磷醯胺(CTX)60mg/kg/day,0.lml/10g,每天注射一次,兩天暫停一次，連續5次；(腹腔注射過程中可能有死亡的小鼠，本實驗處理腹腔注射過程中，死了 4隻，灌胃過程中死I只)；末次腹腔注射第二天，開始灌胃給藥，連續7天。按照體積為0.lml/10g,
0.5%的CMC-Na作為藥物的混懸劑製備藥物。
[0030]2、實驗分組:n=12
[0031 ] (I)正常組(不做任何處理，灌胃生理鹽水)
[0032](2)模型組(免疫力低下模型，灌胃生理鹽水)
[0033](3)陽性藥組(鹽酸左旋咪唑，20mg/kg.d)
[0034](4)低劑量組:50mg/kg.d
[0035](5)中劑量組:100mg/kg.d
[0036](6)高劑量組:200mg/kg.d
[0037]3、體內實驗 [0038]實驗觀察指標:
[0039](1)灌胃前後稱量小鼠的體重，臟器指數，胸腺、脾臟的重量；
[0040](2)末次灌胃後禁食不禁水，次日眼球取血，離心，取上層的血清，-20°C保存，ELISA法測量血清中的IL-2，TNF-α的含量。
[0041]4、體外實驗
[0042]4.1提取腹腔巨噬細胞，種96孔板；吞噬中性紅能力(正常小鼠的巨噬細胞，用藥物刺激)
[0043]脫臼處死小鼠，浸入75%的乙醇中l_2min即可，於超淨臺中操作，剪開腹部的皮毛，腹腔注射預冷的PBS5ml左右，用鑷子輕輕揉小鼠腹部，時間不能超過Imin ;然後用鑷子提起腹膜，剪開一個小口子，用Iml的槍頭吸出PBS，沿著皮吸，注意不要吸到內臟和血液；40C，500rpm, IOmin;棄掉上清液，用PBS清洗2遍，用RPM1-1640培養液重懸細胞，細胞計數後，調節細胞濃度為lXlOVml，接種於96孔板中，100μ I/孔；完全RPM1-1640為空白對照組；貼壁4h後，用PBS清洗2遍後，(若有血細胞，貼壁時間減少為2h左右，衝洗細胞)去除非貼壁細胞，即為小鼠腹腔巨噬細胞。
[0044]藥物刺激巨噬細胞後24h，傾去上清液，每孔加入0.1%的中性紅生理鹽水100 μ I,繼續培養20min，傾去上清液，用37°C預熱的PBS清洗3遍，用注射器吸乾淨，每孔加入細胞溶解液(乙酸:無水乙醇=1:1)0.2ml，室溫下放置2-3h，待細胞溶解後，即在酶聯免疫檢測儀上測490nm處的吸光度。每個濃度設置6個復孔，重複3次試驗，取其平均值。
[0045]巨噬細胞的酸性磷酸酶活性測定；
[0046]巨噬細胞分泌NO的作用；
[0047]4.2提取脾臟巨噬細胞；YAC-1細胞；NK細胞的自然殺傷能力
[0048](I)效應細胞:
[0049]常規無菌取小鼠脾淋巴細胞，無菌取出脾臟，置於5ml的PBS液體的小培養皿中(冰上操作)，脾臟上用小剪刀剪開幾個小口子，用鑷子在4層紗布中，將脾臟輕輕研碎，製成單細胞懸液，收集細胞混懸液於離心管中，lOOOrpm，lOmin，離心，棄掉上清液，餘留固體在離心管底部，加入紅細胞裂解液，量為細胞體積的3-5倍，混均勻，靜止3-5min ;補充1640離心，得到沉澱為脾細胞，用10%FBS的RPM1-1640培養液培養細胞，製成為I X 107/ml的細胞懸液；
[0050] (2)製備靶細胞:
[0051 ] 取傳代培養24-48h的YAC-1細胞，10%的RPM1-1640，洗滌兩次後，用0.5%的BSA-RPM1-1640培養液洗滌一次，調節細胞濃度為3 X 105/ml，臺盼藍染色存活率>95% ；
[0052](3)活性測定:
[0053]96孔板，實驗孔加效應細胞，靶細胞各100 μ I;
[0054]靶細胞對照孔:靶細胞+培養液各100 μ I ;
[0055]效應細胞對照孔:效應細胞+培養液各100 μ I ;
[0056]每個標本有3各復孔；
[0057]培養液孵育4h後，各孔加入MTTlO μ 1，在孵育4h ;結束後，DMSO150 μ 1，
0.05mol (ρΗΙΟ.5)甘氨酸緩衝液20 μ 1，微型震蕩lOmin，570nm測量OD值;
[0058]5、實驗結果
[0059]表1桑黃乙酸乙酯提取物對小鼠體重的影響(X 土 s，n=10)
【權利要求】
1.桑黃提取物在製備提高免疫力作用的藥物中的應用。
2.根據權利要求1所述的桑黃提取物在製備提高免疫力作用的藥物中的應用，其特徵在於，所述的藥物劑型可以是片劑、顆粒劑、丸劑、膠囊、口服液、糖漿、凍乾粉針、水針等劑型。
3.根據權利要求1所述的桑黃提取物在製備提高免疫力作用的藥物中的應用其特徵在於，所述的桑黃提取物的製備方法如下: (O桑黃子實體粉碎後，用95%乙醇回流提取三次，每次提取2-3小時，提取溫度為75-85°C，合併三次提取液得總提取液； (2)總提取液回收乙醇後，濃縮至適量，加蒸餾水製成懸浮液，再依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取； (3)將乙酸乙酯 萃取液減壓蒸餾，回收溶劑，濃縮至幹，即得桑黃提取物。
【文檔編號】A61K36/06GK103845369SQ201410022879
【公開日】2014年6月11日 申請日期:2014年1月17日 優先權日:2014年1月17日
【發明者】李寧, 尹維龍, 黃河, 王開金, 餘春富 申請人:安徽省康美來大別山生物科技有限公司, 六安市丹皇生物科技有限責任公司, 安徽醫科大學