芒果畸形病病原菌（Fusariummangiferae）分子快速檢測的方法與應用的製作方法
2023-05-08 15:19:36 1
芒果畸形病病原菌（Fusarium mangiferae）分子快速檢測的方法與應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種芒果病害——畸形病病原菌（Fusariummangiferae）分子快速檢測的方法與應用，屬於農作物病害檢測、鑑定及防治【技術領域】。主要採用ISSR分子標記篩選引物和目的片段，分析目的片段序列並設計了一對SCAR特異性引物（W342：5，-ACAACTCCGCACCCTCAATG-3，和W1772：5，-GGACCCTCAGACTGCCCAAT-3，），建立分子快速檢測方法，該方法對樣本中含有的DNA進行PCR反應，當PCR產物呈現1376bp特異性產物時，即樣本中含有芒果畸形病的病原菌（Fusariummangiferae）。該方法操作簡單，特異性強，可檢測真菌DNA的含量最低為10pg。所發明的檢測方法適用於芒果畸形病病原菌（Fusariummangiferae）和田間帶菌芒果組織高靈敏度快速檢測，為芒果畸形病的早期診斷和及時預防提供可靠地理論依據和技術方法。
【專利說明】芒果畸形病病原菌(Fusar i um mangi ferae)分子快速檢測
的方法與應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種芒果畸形病病原菌ffiaflgi/erae)分子快速檢測的方法與應用，即利用一對特異性引物和聚合酶鏈式反應(PCR)分子生物技術對芒果畸形病病原菌iFusarium mangi ferae")進行高靈敏度快速檢測，同時可用于田間芒果畸形病的早期診斷和病菌的檢測和鑑定，屬於農作物病害檢測、鑑定及防治領域。
【背景技術】
[0002]芒果畸形病(mango malformation disease, MMD),又稱簇生病、簇芽病，由鐮刀菌或是其複合體引發致病。目前，國內外報導較多的並且通過柯赫法則驗證的病原菌有6 f中，i 另 11? -.Fusarium subglu tinans, Fusari um mangi ferae, Fusarium pro Ii fera turn,Fusarium sterilihyphosum, Fusarium mexicanum sp.nov.取 Fusariumtupiense，哀々F.mangi ferae危害範圍最廣，並於2010年被楊順錦等人確定為我國芒果畸形病的病原菌。該病分為枝葉畸形和花序畸形。感染該病後，病株花序變密，簇生，畸形花序呈拳頭狀；嫩梢腋芽與頂芽叢生，節間變粗、變短，葉片變厚、變窄、變脆，最後乾枯；果實變黑變小，不發育，甚至不座果，為害可導致減產30%~90%，一般單株受害程度50%~80%，嚴重者達100%，每年都造成巨大的經濟損失。在我國，該病最早發生於雲南元江西北灌渠，發病株率達75.4%。2011年，楊順錦等人發現該病害在金沙江乾熱河谷地區某些果園的芒果也日趨嚴重，發病株率達30%飛0%，有的甚至高達95%。除此之外，該病害在四川攀枝花，雲南元謀、華坪和廣西部分地區的芒果園也有流行，個別果園為害嚴重，有蔓延趨勢，對我國芒果產業造成直接的威脅。
[0003]芒果畸形病病原菌潛伏期長，一旦發病，難於治理，所以建立快速檢測手段具有重要的意義。在國外，Zvi Newman等在2012年運用了 AFLP技術篩選到了 4對引物，並對芒果畸形病病原菌mangi ferae建立了一個快速診斷技術,該診斷技術同時適用於離體和活體檢測，能檢測到真菌DNA的含量最低為10pg，但是AFLP技術操作複雜，檢測周期較長，且實驗並未涉及中國芒果畸形病病原菌的檢測，在推廣方面受到限制。在國內，賈靜等於2013年利用Fusarium proliferatum的鈣調蛋白基因序列設計了一對內側引物和一對外側引物，通過巢式PCR建立了芒果畸形病病原菌Fusarium proliferatum的檢測方法，靈敏度達到5X10_5 ng/yL。該方法主要對比了巢式PCR與普通PCR檢測結果的差異，雖然巢式PCR靈敏度高，但是其操作不及普通PCR簡單，且該檢測在普遍性和特異性方面缺乏說服力。為了防止芒果畸形病從疫區傳入非疫區，確保國內芒果的安全生產，建立一種針對國內芒果畸形病病原菌mangi ferae的穩定、簡單、快速、靈敏的分子檢測方法已經迫在眉睫。
【發明內容】
[0004]本發明的主要目的在於克服現有技術的缺點與不足，提供一種針對中國芒果畸形病病原菌(/7Mari -- mangi ferae)的分子快速檢測的方法。
[0005]本發明的另一目的在於提供所述方法特異性引物及在芒果畸形病病原菌分子快速檢測中的應用。
[0006]本方法的目的通過下述技術方案實現:一種芒果畸形病病原菌iFusariummangi ferae )分子快速檢測的方法,包括以下步驟:
(I)根據ISSR分子標記篩選引物和目的片段，分析比對目的序列並設計SCAR檢測特異性引物，其中:
上遊引物 W342:5』-ACAACTCCGCACCCTCAATG-3』 ；
下遊引物 W1772:5』-GGACCCTCAGACTGCCCAAT-3』。
[0007](2)對樣本進行處理，得到樣本中的DNA:樣本為芒果植株組織時，所述處理的方式為利用改良的CTAB法提取芒果植株組織中的基因組DNA;樣本為分離的病原菌時，所述處理的方式為改良的SDS法提取菌絲基因組DNA ;然後以樣本的DNA為模板，進行PCR反應；PCR 反應體系共 25 μ L，包括:10 X PCR buffer (TaKaRa) 2.5 μ L, 10mmol/L dNTPs 2yL，模板(10叩/^0 0.5 4 1^混合引物(2(^11101/1) I μ L，Taq 酶(5U/μ L) (TaKaRa)0.13 μ L，加ddH20 補足至 25μ L ;反應條件為 94°C 5min ；94°C lmin,50°C 30s, 72°C lmin，45 個循環；72 °C 5min ;反應結束後，取5μ L PCR產物於1.0% Agarose凝膠上電泳(100V，35min)後，UV檢測，凝膠成像系統拍照記錄。當結果中呈現1376bp特異性條帶時，即樣本中含有芒果畸形病病原菌(/^saria? mangi ferae) 0 [0008]改良的SDS法:(I)取菌絲100 mg置於-20 °〇預冷的研缽中，加入適量的PVPP(佔菌絲量的2%)，液氮下研磨成粉末狀，然後轉入1.5 mL的離心管中；(2)加入600 μ LDNA 提取緩衝液(4% 十二烷基肌氨酸鈉；100 mmol.I/1 Tris-HCl, pH 8.0 ；IOmmol.l-1EDTA，pH 8.0)混勻，65 °C保溫30 min，將離心管迅速移入冰浴中靜置5 min; (3)向離心管內加入Tris飽和酚和氯仿各300 μ L，充分混勻，室溫靜置10 min, 4°C 12 000 r.min—1離心5 min ; (4)吸取上清液,加入等體積的氯仿,混勻，4°C 12 000 r ?mirT1離心5 min; (5)吸取上清液，加入1/5體積的3 mo 1-1~1的NaAc (pH 6.0)和3/5體積的異丙醇，混勻，室溫靜置10 min, 4 V 12 000 r.min—1離心5 min ; (6)棄上清,加入500 μ L體積分數70%乙醇，4°C 12 000 r.mirT1離心3 min ; (7)離心管置於超淨臺上乾燥I h，加入IOOyL無菌雙蒸水，加入2 μ L的5 mg.ml/1 RNase, 37°C下保溫30 min,在-20°C冰箱保存。
[0009]改良的CTAB 法:(I)吸取 5mLCTAB 提取液(2%(w/v)CTAB，100 mmol *L_1 Tris-HCl(ρΗ8.0),20 mmol.171 EDTA (ρΗ8.0)，1.4 mo 1.171 NaCl, 1% (w/v)PVPP)和 200 μ L β -巰基乙醇置於15mL離心管中，65°C預熱，；(2)取l_3g芒果組織於液氮中研細，磨樣時加入適量PVPP，磨好後迅速轉入預熱的CTAB提取液中，顛倒混勻，65°C溫水浴裂解Ih ;(3)加入等體積氯仿:異戍醇(24:1)混勻，12 000 r.mirT1離心5min ; (4)吸取上清液,轉移至新15mL離心管中，加入1/10體積預熱的CTAB/NaCl和等體積的氯仿:異戊醇(24:1)，顛倒混勻，12 000 r.mirT1離心5min ；(5)吸取上清液，轉移到新15mL離心管中，加入等體積提前預冷的異丙醇沉澱DNA, - 20 °C放置30min或更長時間，12 000 r.mirT1離心12min,去上清。(6)用lmL75%乙醇漂洗DNA絮團，12 000 r.mirT1離心5min，吸去液相，風乾後，加Λ 500 μ L TE 溶解；(7)轉移置 1.5mL 離心管中，加入 I μ RNase (10 μ g.mL-1) 37°C下保溫30min ; (8)加入等體積氯仿:異戍醇(24:1)抽提一次，12 000 r.mirT1離心5min ; (9)取上清液加入0.1體積3MNaAC (pH5.2)、2倍體積預冷的無水乙醇，顛倒混勻，-20 V放30min以上，12 000 r.mirT1離心12min,加入lmL75%乙醇漂洗兩次,吸乾乙醇,放IOmin晾乾，加200 μ L TE - 20°C冰箱保存。
[0010](3)本發明同時適用於芒果畸形病原菌(/7W1Sariiffl? ?aflgi/erae)以及田間芒果畸形病的早期診斷的監測和鑑定。
[0011]本發明的有益效果是:本發明方法操作簡單，特異性強，靈敏度高，特異性引物沒有多態性，適用於芒果畸形病病原菌mangi ferae )和田間帶菌芒果組織的快速檢測，為芒果畸形病的早期診斷和及時預防提供可靠地理論依據和技術方法，確保我國芒果種植區的安全生產，對病原菌分子預警具有十分重要的意義。本發明與現有技術對比，具有以下的技術優勢和積極效果:
1.結果可靠:本發明所設計出的特異性引物已經對源於中國四川省攀枝花市8個疫情村莊和雲南省華坪縣3個疫區分離得到的38株芒果鐮刀菌iFusarium mangi ferae )和廣東省湛江市南亞熱帶作物研究所保存的帶菌芒果組織進行驗證，因此結果可靠有保證；
2.特異性強:本發明設計的特異性引物擴增產物經測序，結果在NCBI資料庫中搜索比對，發現沒有與之同源性達到100%的序列。且試驗以多種中國植物致病鐮刀菌為對照菌株進行驗證，結 果比對菌株孔道處無特異性條帶出現，表明此檢測手段特異性較強；
3.靈敏度高:本發明基於普通PCR的基礎上，檢測了芒果畸形病病原菌
mangi ferae)基因組DNA和健康芒果組織與病原菌混合基因組DNA，檢測靈敏度在病菌DNA水平上可達到10pg，較為靈敏；
4.實用性好:本發明設計的特異性引物無多態性，可用於多疫區病原菌及帶菌芒果組織的高靈敏快速檢測，因此實用性強；
5.操作簡便:本發明採用普通PCR進行擴増，且採用1.0% Agarose凝膠電泳檢測結果，無需繁瑣的操作步驟和程序設置，過程簡單易行。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0012]圖1是本發明所述方法對植物病原鐮刀菌和健康芒果基因組ITS序列PCR擴增產物電泳示意圖，其中:
泳道M為DNA Marker 2000 ;泳道O為芒果鐮刀菌MG06 ;泳道I為鏈狀鐮刀菌；泳道2為早熟鐮刀菌；泳道3為磚紅鐮刀菌；泳道4為禾穀鐮刀菌；泳道5為木賊鐮刀菌；泳道6為腐皮鐮刀菌；泳道7為接骨木鐮刀菌；泳道8為健康芒果組織；泳道CK為陰性對照水；
圖2是本發明所述對不同地域芒果畸形病病原菌iFusari um mangi ferae ) ITS序列PCR擴增產物電泳示意圖，其中:
泳道M為DNA Marker 2000 ;泳道MG01-MG26為分離自四川省攀枝花市的芒果鐮刀菌；泳道MG27-MG38為分離自雲南省華坪縣芒果鐮刀菌；泳道CK為陰性對照水；
圖3是本發明所述對ISSR引物888 (BDB (CA) 7)的PCR擴增產物電泳示意圖，其中:泳道M為DNA Marker 2000 ;泳道O為芒果鐮刀菌MG06 ;泳道I為鏈狀鐮刀菌；泳道2為早熟鐮刀菌；泳道3為磚紅鐮刀菌；泳道4為禾穀鐮刀菌；泳道5為木賊鐮刀菌；泳道6為腐皮鐮刀菌；泳道7為接骨木鐮刀菌；泳道8為健康芒果組織；泳道CK為陰性對照水；
圖4是本發明所述對特異性引物(W342、W1772)的PCR擴增產物電泳示意圖，其中:泳道M為DNA Marker 2000 ;泳道O為芒果鐮刀菌MG06 ;泳道I為鏈狀鐮刀菌；泳道2為早熟鐮刀菌；泳道3為磚紅鐮刀菌；泳道4為禾穀鐮刀菌；泳道5為木賊鐮刀菌；泳道6為腐皮鐮刀菌；泳道7為接骨木鐮刀菌；泳道8為健康芒果組織；泳道CK為陰性對照水；
圖5 是本發明所述對特異性引物(W342、W1772)的靈敏度測試結果示意圖，其中:
泳道M為DNA Marker 2000 ;泳道1~4為芒果畸形病病原菌MG06基因組DNA模板量分別為:10ng，lng，0.1ng, 0.01ng ;泳道5~8為健康芒果和畸形病病原菌MG06的混合基因組DNA，混合後芒果畸形病病原菌MG06基因組DNA模板量分別為:10ng，lng，0.1ng, 0.01ng ；圖6是本發明所述對特異性引物(W342、W1772)的活體檢測結果示意圖，其中:
泳道M為DNA Marker 2000 ;孔道O為芒果鐮刀菌MG06 ;孔道1_4為典型畸形症狀花序、毗鄰花序葉、嫩芽之間的莖、嫩芽；孔道5-8為非典型畸形症狀花序、Btt鄰花序葉、嫩芽之間的莖、嫩芽；孔道9-12為健康花序、Btt鄰花序葉、嫩芽之間的莖、嫩芽；
圖7是本發明所述特異性引物(W342、W1772)對不同地域芒果畸形病菌mangi ferae PCR擴增產物電泳示意圖,其中:
泳道M為DNA Marker 2000 ;泳道MG01-MG26為分離自四川省攀枝花市的芒果鐮刀菌；泳道MG27-MG38為分離自雲南省華坪縣芒果鐮刀菌；泳道CK為陰性對照水。
【具體實施方式】
[0013]下面結合實施例及附圖對本發明作進一步詳細的描述，這些實施例只用來說明本發明，並不限制本發明的範圍。
[0014]實施例中的供試材料
供試菌株分為兩部分，第一部分菌株為中國植物致病鐮刀菌，編號FM1-FM7 ;菌株MG06為中國芒果畸形病的致病菌mangi ferae ο第二部分菌株為分離自中國不同疫區的芒果畸形病鐮刀菌MG1-MG38，經形態學和延伸因子鑑定為F.mangi ferae.[0015]供試植物組織採自中國熱帶農業科學院南亞熱帶植物研究所芒果實驗大棚內(廣東湛江)健康、典型和非典型畸形芒果花序和毗鄰花序的葉、嫩芽和嫩芽之間的莖。所有植物材料衝洗晾乾後，先用70%酒精浸泡10s，然後用30%的次氯酸鈉處理3min，無菌雙蒸水衝洗2次，在無菌環境中晾乾後液氮中冰凍後_80°C下保存備用。
[0016]供試引物:真菌通用引物ITS5 (GGAAGTAAAGTCGTAACAAGG)和 ITS4 (TCCTCCGCTTATTGATATGC),也可檢測芒果基因組DNA。本實驗的50條ISSR引物序列來源於加拿大哥倫比亞大學(UBC)設計並公布的，由英濰捷基(Invitrogen)公司合成。
[0017]基因組DNA的提取:真菌基因組DNA的提取:從菌株保藏斜面上挑取菌絲接種到查彼(Czapek)培養基(NaN032g，KH2P04 lg，MgS04.7Η20 0.5g,KCl 0.5g，FeSO4.7Η20 0.02g,蔗糖30g，瓊脂17g，蒸餾水定容到1000mL)上，在28°C下活化5天，將活化後的菌株接種到查彼液體培養基中，在28°C、150r/min條件下培養7d，用濾紙過濾獲得菌絲，將菌餅分別放入研缽中，採用改良的SDS法提取菌絲基因組DNA待用。芒果基因組DNA的提取:取凍存的供試芒果組織，用消毒後的枝剪和剪刀將供試植物組織剪成小片(塊)，分別置於研缽中，採用改良的CTAB法提取芒果基因組DNA待用。
[0018]基因組DNA的檢測:分別用1%的瓊脂糖凝膠電泳和分光光度計檢測DNA的質量和濃度，並根據需要稀釋至10ng/yL，-2(TC下保存。為了排除驗證分子標記時可能存在的假陰性情況，利用通用引物ITS5和ITS4對內生真菌rDNA上的ITS區域進行PCR擴增。PCR反應體系 25 μ L，由 IOXPCR buffer (TaKaRa) 2.5 μ L，10mmol/L dNTPs 2「1^，模板(10叩/μ L) 0.5 μ L，混合引物(20 μ mol/L) I μ L, Taq 酶(5U/yL) (TaKaRa) 0.13yL』ddH2(^總體系為 25 μ L。PCR 反應條件:94°C 5min ；94°C lmin,56°C 30s, 72°C lmin，45 個循環；72°C 5min。PCR反應結束後，取5 μ L PCR產物於1.0% Agarose凝膠上電泳(100V，35min)後，UV檢測，凝膠成像系統拍照記錄。結果45個菌株和芒果基因組均能擴增出清晰的條帶(圖1和2)，說明所有待用的DNA是正常的，因此在後面的特異性PCR擴增反應中，如果某些菌株沒有擴增產物，可以排除由於DNA不正常造成的假陰性的可能。
[0019]實施例1菌株特異性引物的獲得
以目的菌株MG06和植物病原鐮刀菌(FM1-FM7)的基因組DNA作為模板，健康芒果基因組DNA作為對照，用ISSR分子標記技術篩選引物，發現ISSR引物(BDB (CA)7)的重複性較好，能穩定地在目的菌株孔道處擴增出特異條帶(479bp)，且芒果基因組孔道沒有條帶顯示(圖3)。將特異性條帶切膠回收，測序由Invitrogen公司完成。通過NCBI資料庫對目的片段序列進行比對，發現只有fujikuroi (HF679027)與其序列相似，同源性達到87%。根據應fujikuroi (HF679027)的全基因組序列和測得目的菌株序列進行比對並設計多組引物，其中引物 W342 (ACAACTCCGCACCCTCAATG)和 W1772 (GGACCCTCAGACTGCCCAAT)特異性強，靈敏度高，可作為特異性引物建立檢測技術。
[0020]實施例2弓丨物W342和Wl772的特異性檢測
根據引物W342和W1772，確定PCR反應體系及參數:擴增反應總體積25 μ L，由10XPCRbuffer (TaKaRa) 2.5 μ L, IOmmoI/L dNTPs 2 μ L,模板(IOng/ μ L) 0.5 μ L，混合引物(20 μ mol/L) I μ L，Taq 酶(5U/μ L) (TaKaRa)0.13 μ L，加 ddH20 至總體系為 25 μ L。PCR 反應條件:94°C 5min ；94 °C lmin,50°C 30s, 72°C lmin，45 個循環；72°C 5min。反應結束後，取5 μ L PCR產物於1.0% Agarose凝膠上電泳(100V，35min)後，UV檢測，凝膠成像系統拍照記錄。檢測結果(圖4)表明:只有目的菌株孔道處出現特異性條帶，而其他對比菌株及對照無條帶。同時，將特異性條帶經切膠回收送Invitrogen公司測序,得到大小為1376bp的特異性序列，結果在NCBI資料庫中搜索比對，發現沒有與之同源性達到100%的序列。試驗表明，此檢測手段特異性較強。
[0021]實施例3引物W342和W1772的靈敏度檢測
靈敏度測試分為兩部分:第一部分檢測芒果畸形病MG6基因組DNA。檢測模板含量分為4個梯度:10ng, Ing, 0.1ng, 0.01ng ;第二部分檢測健康芒果和畸形病菌MG6基因組DNA的混合模板，使畸形病菌MG6基因組DNA含量分別為:10 ng，lng，0.lng, 0.01ngo檢測結果(圖5)表明:在兩種檢測試驗中，該手段可檢測真菌DNA的含量最低為10pg，靈敏度較高。
[0022]實施例4弓丨物W342和W1772的活體檢測
分別以典型和非典型畸形症狀的芒果嫩芽和畸形嫩芽之間的莖，花序和毗鄰花序的葉的基因組DNA為檢測模板，以芒果畸形病原菌MG6基因組DNA為陽性對照，健康的芒果嫩芽和嫩芽之間的莖，花序和毗鄰花序的葉的基因組DNA為陰性對照。根據建立的PCR反應體系進行活體檢測。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果如圖6所示:典型畸形症狀的所有組織部分均能檢測到特異性條帶，而非典型症狀中只有嫩芽和花序部分可以檢測到，陽性對照條帶明顯，陰性對照組均無條帶出現，說明此檢測手段適合活體檢測。非典型症狀嫩芽之間的莖和毗鄰花序的葉檢測不到特異性條帶存在，可能原因有:非典型症狀一般出現在畸形病發病初期，較典型症狀帶菌量少，當帶菌量低於檢測濃度時，就不能出現明顯的特異性條帶。同時，Btt鄰花序葉和非典型症狀嫩芽之間的莖並非畸形病症發病組織，外部特徵與健康組織相同，其中並不存在病原菌也是很有可能的。
[0023]實施例5弓丨物W342和W1772的多態性檢測
對分離自四川和雲南兩省多地的芒果畸形病原菌/7.mangi ferae進行多態性分析,結果(圖7)並未呈現多態性，說明此檢測手段適應不同地區芒果畸形病原菌的檢測。其中菌株MG21和菌株MG38未檢測到條帶，可能是兩株菌在檢測的基因位點出現變異或者缺失所導致的。
[0024]應當理解 的是，對於本領域普通技術員來說，可以根據上述說明加以改進和變換，而所有在不偏離本發明精神的基礎之上所做的這些改進和變換都應屬於本發明所附權利要求的保護範圍。
【權利要求】
1.一種芒果畸形病病原菌ffiaflgi/erae)分子快速檢測的方法,其特徵在於:包括以下步驟: (1)設計一組SCAR特異性引物，其中:
上遊引物 W342:5』-ACAACTCCGCACCCTCAATG-3』 ；
下遊引物 W1772:5』-GGACCCTCAGACTGCCCAAT-3』 ； (2)對樣本進行處理，得到樣本中的DNA;然後以樣本的DNA為模板，進行PCR反應，電泳檢測PCR產物，當PCR產物檢測呈現1376 bp條帶時，即表明樣本中含有芒果畸形病的病原菌 iFusarium mangiferae )。
2.根據權利要求1所述芒果畸形病病原菌?aflgi/erae)分子快速檢測的方法，其特徵在於:步驟(2)中所述的樣本處理的樣本為芒果植株組織時，處理的方式為利用改良的CTAB法提取芒果植株組織中的基因組DNA。
3.根據權利要求1所述芒果畸形病病原菌iFusarium?aflgi/erae)分子快速檢測的方法，其特徵在於:步驟(2)中所述的樣本處理的樣本為分離的病原菌時，處理的方式為改良的SDS法提取菌絲基因組DNA。
4.根據權利要求1所述芒果畸形病病原菌?aflgi/erae)分子快速檢測的方法，其特徵在於:步驟(2)中所述PCR反應體系共25yL，包括:10XPCR buffer TaKaRa2.5 μ L，IOmmoI/L dNTPs 2 μ L, 10ng/ μ L 模板 0.5 μ L, 20 μ mol/L 混合引物 1 μ L, 5U/ μ LTaq 酶 TaKaRa 0.13 μ L,加 ddH20 補足至 25 μ L。
5.根據權利要求1所述芒果畸形病病原菌?aflgi/erae)分子快速檢測的方法，其特徵在於:步驟(2)中所述PCR反應條件為94°C 5min ；94°C lmin,50°C 30s, 72°Clmin, 45 個循環；72°C 5min。
6.根據權利要求1所述芒果畸形病病原菌?aflgi/erae)分子快速檢測的方法，其特徵在於:步驟(2)中所述PCR產物於1.0% Agarose凝膠上電泳後，UV檢測，凝膠成像系統拍照記錄。
7.根據權利要求1或6所述芒果畸形病病原菌iFusarium?aflgi/erae)分子快速檢測的方法，其特徵在於:步驟(2)中所述電泳檢測的條件為100V，35min。
8.權利要求1~7任一項所述芒果畸形病病原菌?aflgi/erae)分子快速檢測的方法應用于田間芒果畸形病的早期診斷以及病菌的監測和鑑定。
【文檔編號】C12Q1/68GK103952469SQ201410065341
【公開日】2014年7月30日 申請日期:2014年2月26日 優先權日:2014年2月26日
【發明者】吳婧波, 柳鳳, 詹儒林, 李國平, 趙豔龍, 常金梅, 何衍彪 申請人:中國熱帶農業科學院南亞熱帶作物研究所