梨小食心蟲螢光pcr檢測方法與應用的製作方法

2023-05-08 18:24:11

梨小食心蟲螢光pcr檢測方法與應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種梨小食心蟲實時螢光PCR檢測方法，包括以下步驟：①、待鑑定樣品基因組DNA的提取；②、實時螢光定量PCR擴增體系設置：以基因組DNA為擴增模板，用特異性引物和探針，進行實時螢光PCR檢測；③、擴增結果分析及結果判斷。探針為：Probe：5』-(FAM)CGAAATCTTAATACTTCATTTTTTGACCCTG(TAMRA)-3』。本發明能用於有效地從蛀果性害蟲(包括梨小食心蟲、蘋果蠹蛾和香梨優斑螟等)中區分出梨小食心蟲。
【專利說明】梨小食心蟲螢光PCR檢測方法與應用

【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種梨小食心蟲汙染的分子檢測方法，具體地說，涉及一種梨小食心 蟲螢光PCR檢測方法，其屬於生物【技術領域】。

【背景技術】
[0002] 梨小食心蟲（Grapholitha molesta(Busck))屬鱗翅目卷蛾科，簡稱梨小，又名東 方果蠹蛾、梨姬食心蟲、桃折梢蟲、小食心蟲、桃折心蟲，俗稱蛀蟲、黑膏藥，廣泛分布於世界 各地，國內遍布個省區，是梨樹的重要害蟲，在梨、桃樹混栽的果園為害尤為嚴重。幼蟲蛀果 多從萼窪處蛀入，直接蛀到果心，在蛀孔處有蟲糞排出，被害果上有幼蟲脫出的脫果孔。幼 蟲蛀害嫩梢時，多從嫩梢頂端第三葉葉柄基部蛀入，直至髓部，向下蛀食。蛀孔處有少量蟲 糞排出，蛀孔以上部分易萎蔫千枯。主要寄主除桃和梨外，還有李、杏、蘋果、山楂等，既危害 果實，也危害新梢，嚴重影響果品產量和品質。近年來其發生出現上升趨勢，是世界性的主 要蛀果害蟲之一，為出口檢疫對象。
[0003] 梨小食心蟲的形態特徵，成蟲：體長5- 7毫米，翅展9一 15毫米，全身灰褐色無光 澤，觸角絲狀，下唇須灰褐上翹；前翅灰黑，前緣有7-10組白色短針紋，在翅的中部有一小 白點，近外緣處有10個小黑斑點，是其顯著特徵。幼蟲：末齡幼蟲體長10?13毫米。全體 非骨化部分淡黃白色或粉紅色，腹部橙黃，頭黃褐色，前胸背板黃白色，透明，體背桃紅色。 腹足趾鉤 3〇?40個。蛹：體長6-_7毫米，紡錘形，黃褐色，腹部3?7節背面各具兩排短 刺，排列整齊， 8?10節各生一排稍大刺，腹未有8根鉤狀臀棘。繭絲質白色，長橢圓形，稍 扁平，長約1〇_。卵：黃白色，扁橢圓形，中央隆起，周緣扁平，直徑0.5?0.8_，半透明。 [000 4] 梨小食心蟲的發生特點：發生世代多，各代發生時期不整，各代發生期很長，世代 明顯重疊。遼寧、河北、新疆地區1年發生3?4代，河南、安徽、江蘇、陝西、山東地區為4? 5代，四川 5?6代，江西和廣西分別為6和7代。以老熟幼蟲在果樹枝幹和根頸裂縫處及 土中結成灰白色薄繭越冬，華北第4代多為不完全世代，以3代和部分4代幼蟲越冬。翌年 春季4月上中旬開始化蛹，越冬部位較分散，樹幹、主枝分杈、根頸部的粗裂、翹皮下，樹下 落葉裡、草根上和土裡都有分布。
[0005]蘋果蠹蛾（Cydia pomonella L·),香梨優斑螟（Euzophera pyriella Yang)和梨 小食心蟲為我國常見的蛀果性害蟲，此三種害蟲的低齡幼蟲在外部形態上非常相似，沒有 顯著差異，目前，我國檢疫部門對梨小食心蟲的分類鑑定主要是以老熟幼蟲或成蟲的外部 形態特徵為依據，在果品出口、運輸和實施檢疫控制前準確地區分檢疫性害蟲是相當必要 的，目前大多憑藉形態學特徵只能區分成蟲、晚齡期害蟲，大多數的檢疫性有害生物較短暫 的幼蟲階段很難依靠形態學特徵精確區分，但蘋果蠹蛾、香梨優斑螟和梨小食心蟲等有害 生物的幼蟲基本是在水果採收時大量出現，同時中、外雙方截獲的食心蟲形態特點都不明 顯，有時以殘體形式出現，給種類的鑑定帶來很大困難。國外在截獲有害生物時，截獲檢疫 性有害生物和截獲一般有害生物，對貨物處理，產地的制裁，出口的限制有很大的區別。從 收到的國外通報看，對方國對截獲有害生物的鑑定結果五花八門，我方想對對方結果進行 質疑，缺乏有力的證據和方法。檢驗方法的不成熟和低解析度依然會造成進口國在截獲檢 疫性有害生物時採取嚴厲制裁措施的風險。帶來過多的技術糾紛，增加禁止出口的風險，增 加檢疫性處理或者退貨會產生較大的費用消耗。因此，建立一種梨小食心蟲快速、靈敏、準 確的分子生物學檢測方法是十分必要和緊迫的，對口岸檢疫和防治監測都有重要意義。


【發明內容】

[0006] 本發明要解決的技術問題是提供一種梨小食心蟲實時螢光PCR檢測方法，本發明 具體給出了用於梨小食心蟲實時螢光PCR檢測的特異性引物和Taqman探針，本發明能用於 有效地從蛀果性害蟲（包括梨小食心蟲、蘋果蠹蛾和香梨優斑螟等）中區分出梨小食心蟲。
[0007] 為了解決上述技術問題，本發明提供一種梨小食心蟲實時螢光PCR檢測方法，檢 測中所用特異性引物和探針的核苷酸分別為：
[0008] 特異性引物為：
[0009] F-Primer: 5，-CAGCTCTTTTATTACTACTTTCACTACCA-3 '
[0010] R-Primer:5' -AATAGGATCTCCTCCTCCT-3' ；
[0011] 探針為：
[0012] Probe : 5 ' _ (FAM) CGAAATCTTAATACTTCATTTTTTGACCCTG (TAMRA) -3 '。
[0013] g卩，本發明首先提供了一種梨小食心蟲的鑑定引物，其核酸序列如SEQ ID No. 1和 2所示，其中，SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列為正向引物，SEQ ID No. 2所示的核苷酸序列 為反向引物。
[0014] LX-FP :5' -CAGCTCTTTTATTACTACTTTCACTACCA-3'（SEQ ID No. 1)或其互補鏈；
[0015] LX-RP :5, -AATAGGATCTCCTCCTCCT-3,（SEQ ID No. 2)或其互補鏈；
[0016] 本發明用於梨小食心蟲實時螢光PCR檢測的Taqman探針，該探針針對上述引物的 擴增區域內，其核苷酸序列如SEQ ID No. 3所示，即本發明所述的Taqman探針為：5'-(FAM) CGAAATCTTAATACTTCATTTTTTGACCCTG(TAMRA)_3'（SEQ ID Νο·3)或其互補鏈。
[0017] 本發明所述的特異性引物和Taqman探針由Takara(大連，中國）公司委託合成及 記。
[0018] 特別地，本發明利用通用引物對不同地區的31次採樣的近500隻梨小食心蟲、蘋 果蠹蛾和香梨優斑螟樣本進行PCR擴增，產物純化、克隆、測序後，分別得到517bp、 5〇4bp 和527bp的序列，各物種的C0I基因長片段用CLUSTAL 2. 1和DNA-star等軟體進行比對 分析，篩選出差異位點較多的區段，進而在該區段使用Primer premier 5.0和ABI Primer Express 3.0軟體設計特異性引物和螢光探針，並用BLAST程序驗證引物特異性。該引物/ 探針組合具有較高的檢測靈敏度和擴增特異性，能高效的將梨小食心蟲與其他相似的檢驗 檢疫性害蟲區分開。
[0019] 本發明還提供了一種使用上述梨小食心蟲特異性引物和Taqman探針鑑定梨小食 心蟲的方法，包括以下步驟：
[0020] ①、待鑑定樣品基因組DNA的提取；
[0021] ②、實時螢光定量PCR擴增體系設置：
[0022]以基因組DNA為擴增模板，用上述弓I物和探針（Taqman探針），進行實時螢光PCR 檢測；
[0023] ③、擴增結果分析及結果判斷：
[0024] 根據實時螢光擴增曲線判定樣品檢測結果。
[0025] 作為本發明的梨小食心蟲實時螢光PCR檢測方法的改進：
[0026] 探針的5,端標記有報告螢光染料，根據所採用的實時螢光PCR儀的配置而定，所 述報告螢光染料為FAM、HEX、JOE、VIC、NED、FITC、CY3或CY5,探針的3'端標記有淬滅螢光 染料，所述萍滅突光染料為TAMRA、ROX、dabcyl、BHQ或ECLIPSE。
[0027] 在本發明中：
[0028] 步驟①提取樣品基因組DNA的具體步驟為：將待鑑定樣品放入研缽內，導入液氮， 充分研磨後，加入裂解液，待溶化後用移液器轉移至 L 5mL離心管內，採用試劑盒離心柱法 提取基因組DNA，試劑盒共採用了北京全式金（EE111)、天根（DP304)、北京鼎國（NEP001)、 Qiagen(69504)等4種植物DNA提取試劑盒。DNA濃度及純度通過ND-2000C核酸蛋白分析 儀檢測。
[0029] 所述樣品為梨小食心蟲成蟲，老熟幼蟲，小齡幼蟲，蛹和殘體，或經糖醋液捕捉到 的蟲體。
[0030] 步驟②所用檢測體系的具體組成如下：25 μ L總體積中含有10 XPCR Buffer (含 Mg2+)2. 5μ L，dNTP(2. 5mM，each)2p L,上下遊引物（1〇μΜ)各 0· 5μ L,探針（10μΜ)0· 5μ L， 500U Taq DNA聚合酶0.25 μ L和DNA模板（由步驟①提取得到的溶液）2 μ L,補水至25 μ L。
[0031] 在本發明中，同時設置重複實驗和陽性對照、陰性對照以及空白對照實驗，陽性對 照由經形態學專家驗證的梨小食心蟲體提取的DNA為模板，可確保核酸提取和擴增反應的 有效性；空白對照中不加模板DNA,而以滅菌蒸餾水代替，用於檢驗是否存在PCR汙染和較 高的引物二聚體汙染；陰性對照為蘋果蠹蛾、香梨優斑螟提取的DNA為模板，避免出現假陰 性結果；設置三個重複確保數據可靠準確。
[0032] 步驟②所述的實時螢光PCR檢測時的反應參數為：95°C預處理15s，再以95°C變性 5s，60°C退火/延伸34s，進行40個循環，在每個循環的60°C退火/延伸階段收集螢光信號。 [0033] 步驟③中檢測結果的判定標準為：根據樣品擴增出具有指數增長型的螢光擴增曲 線，當其Ct值小於35,且陰性對照和空白對照無螢光信號，說明該樣品受到梨小食心蟲汙 染，否則不是梨小食心蟲汙染。當檢測樣品Ct值小於35,但陰性對照/空白對照有螢光信 號，說明該檢測結果不可信，整個檢測過程需要重新做。
[0034] 本發明中所述的水均為無核酸酶汙染的雙蒸水。
[0035] 本發明中還可以通過標準曲線驗證所設計引物和探針的擴增效率以及對建立的 螢光PCR反應進行重複性和靈敏性分析。所述標準曲線是以前述的DNA擴增模板的連續的 5個濃度梯度為樣品，每個樣品設置3個重複，擴增得到的平均 Ct值為縱坐標，模板起始濃 度為橫坐標的關係曲線。
[0036] 本發明的優點在於：
[0037]特異性高：本發明利用梨小食心蟲C0I基因中的差異性序列設計特異性引物，用 該引物擴增蘋果蠹蛾、香梨優斑螟和梨小食心蟲，1 %瓊脂糖凝膠電泳結果僅有梨小食心蟲 樣本中出現一條114bp的清晰條帶，其它對照樣品均無條帶產生。此外，本發明還設計了一 條特異性螢光探針，在實時螢光檢測過程中對靶片段進行雙重質控，利用上述的引物和探 針序列進行實時螢光PCR擴增驗證，僅有梨小食心蟲樣品出現了指數型的擴增曲線，其餘 對照樣品無螢光信號，本發明設計的引物和探針可以保證擴增的特異性，避免假陽性檢測 結果。
[0038]重複性好：本發明使用DNA擴增模板的連續5個濃度梯度樣品做標準曲線，每個 樣品設置三個重複，這三個重複之間的變異係數在〇. 243-0. 978之間，標準曲線的R2值為 0· 9900,試驗數據具有良好的線性關係，重複性較好。
[0039] 靈敏度高：本發明梨小食心蟲COI基因擴增效率為96. 74%，在可接受的PCR擴增 效率範圍內（90-110%)。DNA溶液在4·75Χ1(Γ3?47.52ng/uL的檢測範圍內螢光定量 PCR起始模板濃度和Ct值之間具有較好的線性關係，本發明建立的分子檢測體系靈敏度較 高，最低檢出限在4. 75 X l(T3ng/ μ L，即4· 75pg/ μ L，滿足檢驗檢疫日常檢測需求。
[0040]本發明所涉及的操作方法簡單，易行，能夠在較短時間內（約3小時）完成梨小食 心蟲的鑑定，一次可檢測多個樣品，特別適合於大批量的抽樣檢查，可應用到實際檢疫工作 中，不僅能大大縮短進出口物品的通關時間，而且還能降低檢疫人員的工作強度，為進出口 安全提供了技術保障。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0041]下面結合附圖對本發明的【具體實施方式】作進一步詳細說明。
[0042]圖1為使用本發明特異性引物和探針實時螢光PCR擴增待檢樣本，陽性對照，陰性 對照等成蟲以及空白對照的擴增曲線圖譜；
[0043] 1.通過形態學專家鑑定為梨小食心蟲成蟲的樣本為陽性對照；
[0044] 2.疑似梨小食心蟲成蟲的待檢樣本；
[0045] 3.通過形態學專家鑑定為蘋果蠢蛾成蟲的樣本為陰性對照；
[0046] 4.通過形態學專家鑑定為香梨優斑螟成蟲的樣本為陰性對照；
[0047] 5.以滅菌蒸餾水為模板的空白對照。
[0048]圖2為使用本發明特異性引物和探針實時螢光PCR擴增待檢樣本，陽性對照，陰性 對照等幼蟲以及空白對照的擴増曲線圖譜；
[0049] 1.通過形態學專家鑑定為梨小食心蟲幼蟲的樣本為陽性對照；
[0050] 2.疑似梨小食心蟲幼蟲的待檢樣本；
[0051] 3.通過形態學專家鑑定為蘋果蠢蛾幼蟲的樣本為陰性對照；
[0052] 4.通過形態學專家鑑定為香梨優斑螟幼蟲的樣本為陰性對照；
[0053] 5.以滅菌蒸餾水為模板的空白對照。
[0054]圖3為使用10倍梯度稀釋的標準品在實時螢光PCR體系中擴增的標準曲線圖譜。 [0055]圖4為使用本發明特異性引物和探針實時螢光PCR進行盲樣測試的擴增曲線圖 譜；
[0056] 1.通過形態學專家鑑定為梨小食心蟲成蟲的樣本為陽性對照； t〇〇57] 2.盲 1(成蟲）
[0058] 3.盲 2(成蟲）
[0059] 4.盲 3(幼蟲）
[0060] 5.盲 4(幼蟲）
[0061] 6.盲 5(幼蟲）
[0062] 7·通過形態學專家鑑定為蘋果蠹蛾成蟲的樣本為陰性對照；
[0063] 8·通過形態學專家鑑定為香梨優斑螟成蟲的樣本為陰性對照；
[0064] 9.以滅菌蒸餾水為模板的空白對照。
[0065] 圖5為序列表1的比對。
[0066] 圖6為序列表2的比對。

【具體實施方式】
[0067]本發明基於目前的分子生物學技術手段，從待鑑定樣品的DNA模板提取，特異性 引物和探針設計和實時螢光PCR反應及結果判斷等入手，通過開發新的方法以達到準確、 快速檢測梨小食心蟲的目的。下面實施例用於本發明的進一步說明，但不用來限制本發明 的範圍。
[0068] 備註說明：以下幼蟲均指老熟幼蟲。
[0069] 實施例1、引物和探針的設計與合成
[0070] 通過採集新疆巴州不同地區的梨小食心蟲成蟲及幼蟲樣本，以C0I通用引物：正 向引物：5 ' -GGWGGATTTGGAAATTGAYTAGTWCC-3 '、反向引物：5，-CCHGGTAAAATTAAAATATAMCTT C-3'經常規PCR擴增和產物測序得到梨小食心蟲C0I基因片段序列。通過NCBI中的BLAST比 對梨小食心蟲C0I特徵序列，序列同源性達99% (AB603521. 1、HQ538466. 1、JF733841. 1), 即C0I區域的保守性較高，保證了引物設計的準確性。此外，我們還將梨小食心蟲與蘋果蠹 蛾、香梨優斑螟的C0I序列進行比對分析，尋找到他們之間的差異位點，在差異性序列區域 設計種屬特異性的引物和探針，並委託Takara(大連，中國）公司合成和標記。
[0071] 上遊引物 LX-FP : 5 ' -CAGCTCTTTTATTACTACTTTCACTACCA-3，
[0072] 下遊引物 LX-RP : 5 ' -AATAGGATCTCCTCCTCCT-3，
[0073] 探針 LX-P : 5 ' -CGAAATCTTAATACTTCATTTTTTGACCCTG-3，
[0074] 該探針的5'端標記螢光報告基團FAM，3'端標記螢光淬滅基團TRAMA。
[0075] 備註說明：梨小食心蟲特異性引物和探針的設計是本發明的關鍵，為了保證設計 的準確性，我們開展了以下研究：
[0076] 1.梨小食心蟲種內C0I基因保守性研究：將採集到的梨小食心蟲成蟲、幼蟲及殘 骸標本，DNA提取後，以C0I通用引物擴增，經常規PCR擴增和測序得到梨小食心蟲線粒體 基因 C0I片段序列。同時，我們從NCBI上下載了 4條梨小食心蟲的相關序列（KJ027508、 AB6〇3521. UHQ538466. 1、JF733841. 1)。用 CLUSTAL 2. 1 軟體對上述的 C0I 序列進行比對 分析（見圖5所述的序列表1)，同源性達99%，表明不同來源的梨小食心蟲在C0I區域的 保守性很高，保證了引物設計的準確性。
[0077] 2.香梨優斑螟、蘋果蠹蛾種內C0I基因保守性研究：將採集到的蘋果蠹蛾和香梨 優斑螟的成蟲、幼蟲及殘骸標本，DNA提取後，以C0I通用引物擴增，經常規PCR擴增和測 序得到香梨優斑螟、蘋果蠹蛾種內C0I基因片段。同時，我們從NCBI上下載了 3條蘋果 蠹蛾的相關序列（FJ217755. 2、FJ217756. 2、FJ2177M· 2)和3條香梨優斑螟的相關序列 (KC215198. 1、KC442311. 1、KC442309. 1)。用 CLUSTAL 2. 1 軟體對上述的 C0I 序列進行比對 分析，同源性分別達99%和97%，表明蘋果蠢蛾和香梨優斑螟的C0I區域的均具有較高的 保守性。
[0078] 3·梨小食心蟲與其他兩種害蟲的C0I序列比對：為了設計出針對梨小食心蟲的特 異性引物和探針，我們對梨小食心蟲、蘋果蠹蛾和香梨優斑螟的C0I序列進行了比對分析 (見圖6所述的序列表 2)，尋找出種間變異區，該區域的序列差異較大，而在種內又相當保 守，因此選定該區域作為梨小食心蟲引物和探針設計的靶序列。
[0079] 4.通過實驗驗證梨小食心蟲引物和探針的特異性（見實施例4)。
[0080] 綜上所述，本發明利用梨小食心蟲與蘋果蠹蛾和香梨優斑螟的序列差異，設計出 了針對梨小食心蟲特異的引物和探針，開發出了一種基於該引物和探針的實時螢光定量 PCR鑑別梨小食心蟲的快速檢測方法。
[0081] 實施例2總DNA的提取
[0082] 取梨小食心蟲及蘋果蠹蛾、香梨優斑螟等陰性對照樣本，放入研缽中，加液氮充 分研磨，用DNeasy blood kit(Qiagen公司）提取樣品DNA，按照試劑盒說明書操作。樣 品提取時所用的肌肉組織星：平果蠢蛾：單頭2. 5-5· Omg，多頭（4-5隻）15-20mg ;梨小食 心蟲：單頭〇· 8-1· 2mg，多頭（12-13隻）12-16mg ;香梨優斑螟：單頭1· 8-2. 2mg，多頭（3-5 只）8-12mg;地老虎：單頭8-12mg;單頭加30yL TE緩衝液進行洗脫，多頭加60μ? TE緩 衝液洗脫。DNA溶液於-20°C保存備用。
[0083] 提取得到的DNA溶液經核酸蛋白分析儀檢測，0D260/280大於1. 5, 0D260/230大 於1.0,提取效果均良好，濃度在30-200ng/yL(未經RNase降解），經10-100倍稀釋後可 用於實時螢光PCR檢測。
[0084] 備註說明：以下實施例3?實施例5採用的是單頭所得的DNA。
[0085] 實施例3實時螢光PCR檢測
[0086] 25μL實時螢光PCR反應體系中包括：滅菌蒸餾水16.75μL，10XPCRBuffer(含 Mg2+) 2. 5 μ L，dNTP (2. 5mM，each) 2 μ L，上下遊引物（10 μ M)各 0. 5 μ L,探針（1〇 μ M) 0. 5 μ L， 500U Taq DNA聚合酶0· 25 μ L和DNA模板（實施例2提取得到的DNA溶液）2 μ L。反應混 合液在ABI 7500實時定量PCR儀中進行擴增。反應條件設置為95°C預處理15s，再以95? 變性5s, 6〇°C退火/延伸34s，進行40個循環。同時設置重複實驗和陽性對照、陰性對照以 及空白對照實驗。實驗結果應用ABI 7500software ν2.0·1進行分析處理。
[0087] 實施例4實時螢光PCR檢測特異性試驗
[0088] 將通過形態學鑑定的梨小食心蟲，香梨優斑螟，蘋果蠹蛾的成蟲和幼蟲的樣本分 別按照實施例2所述方法進行DNA的提取，分別以上述DNA為模板，以通過形態學鑑定的梨 小食心蟲為陽性對照，以香梨優斑螟、蘋果蠹蛾為陰性對照，以滅菌蒸餾水為空白對照，以 待測蟲體作為待測樣本；進行實時螢光PCR反應，反應條件及設置同實施例 3,目的是驗證 梨小食心蟲C0I基因引物和探針的特異性。結果如圖1和圖2所示。結果顯示：只有以梨 小食心蟲成蟲和幼蟲的DNA為模板的反應管中顯示了指數型擴增曲線，其他蟲體樣本均無 信號，證明梨小食心蟲C0I基因引物和探針具有特異性。
[0089] 表1各檢測樣本（成蟲）實時螢光PCR反應的Ct值分析表 檢測樣本(1丫1頭成 蟲） 龜值；iCt_平均値 _^偏_ _某判 ;定 陽性對照 ：-"?4.13 15.11 14.?~ 14崩 〇.；19| + 蘋 Μ蛾 ^~>40 >40 ： >40 - 香梨優斑螺^ S"""?40 ># ^ ?40 - 待檢樣木 15.03： 15.：16 15 26 15.16 0.105 + 空白 _i >40 ?40 >40 >40 -
[0090] 表2各檢測樣本（幼蟲）實時螢光PCR反應的Ct值分析表
[0091] 檢測樣本(單頭幼 m Ct僵 Ct平均位 標準犏差 _集判記 陽性對照 18.92 19.?4 liJl 19.09 0l0§ + 蘋果蠹蛾 > >4〇 M0 - 香梨優廳螟.. >40 .靖?>Ψ〇 >40 - 待檢樣本 21.Q5 20.51 21.20 20.92 036? + 空白對照 >40 >40 >40 >40 -
[0092] 實施例5實時螢光PCR檢測重複性和靈敏性試驗
[0093] 提取梨小食心蟲樣本的基因組DNA，將測定好濃度的基因組DNA作為標準品，進 行10倍梯度稀釋，共設置5個梯度，分別為47. 52ng/y L、4. 752ng/y L、0. 4752ng/y L、 0. 〇4752ng/ 和0· 0〇4752ng/ μ L，稀釋介質為基因組DNA提取時所用的洗脫液（即實施 例2中的TE緩衝液）。對5個梯度的標準品為模板進行實時螢光 PCR反應，每個梯度設置3 個重複。以標準品濃度的自然對數值為橫坐標，以Ct值為縱坐標做標準曲線（圖3)，其R2 為0· "0。對Ct值統計分析（表3)，同一參照樣品重複間Ct值變異較小，梨小食心蟲⑶I 基因 Ct值變化範圍在19. 01-Μ. 39之間，標準偏差在0. 243_0· 978之間，表明該方法亙有 較好的重複性和穩定性。 ~
[0094] 表3梨小食心蟲濃度梯度標準品Ct值分析表
[0095] _品旗量_度 (ngVL) Ct值 Ct平均值 標準偏犛 47.5200 19 63~11.01 ~1 讀 !： 19；54 〇_ ^ 4^520 23 89 24 38 24 14 i PIP #·24| _52 WM 28.03-%6M 27.45 ?·576 _752 2$M 30.33 29.79 WM 0362~' *~~0,004752 32.54 3：4.3f 34.03 ：： 33,65 ______〇# 孫
[0096] 由表3可示，在最高稀釋度的樣品中，梨小食心蟲COI基因得到擴增，Ct值 為34. 39,接近檢測臨界限（Ct = 35)，結果表明梨小食心蟲C0I基因在模板濃度為 〇· 004752ng/u L時為有效擴增，即確定該濃度為最低定量限，最低檢測限為〇· 〇〇4752ng/ U L，即 4. 752pg/ μ L。
[0097] 實施例6、單多頭DNA樣本和DNA混合樣本檢測
[0098] 將梨小食心蟲的單（包括僅剩餘頭部或腹部的殘體樣本）、多頭DNA樣品以及蘋果 蠹蛾、香梨優斑螟和梨小食心蟲混合DNA樣品分別用梨小食心蟲的特異性引物和探針進行 擴增，檢驗單多頭取樣和混合樣本提取的模板DNA對後續擴增反應以及對引物探針特異性 的影響。結果顯示只有梨小食心蟲存在的樣本才能得到擴增，其他樣本無信號。各個反應 的PCR擴增C t值匯總如表4所示。
[0099] 表4單多頭DNA樣本和DNA混合樣本螢光定量PCR檢測結果
[0100] 蘋果蠹蛾 香梨優斑螟 梨小食心蟲 3種害蟲混 樣品名稱 單頭|多頭：單頭|多頭?·頭 多頭 #"：Dm LX引輸和探針擴増 ' 1? UJI >4? >40 ^40 >4?' ... Ct(SD) (±0,134) (±&415) (±0 325) 鐵果判 R ： _ ： 4 + -(-
[01 01 ] 由表4可示，在蘋果蠹蛾、香梨優斑螟的單、多頭DNA樣本中，所得到擴增曲線的Ct 值均大於40,為陰性，即無梨小食心蟲存在。而在梨小食心蟲單頭、多頭和3種害蟲混合樣 本中，所得到擴增曲線的Ct值分別為I7· 45、I6· 71和18. 29,為陽性，即有梨小食心蟲存在。 [0102] 實施例7盲樣測試
[0103] 將上述所建立的螢光定量PCR檢測體系應用於梨小食心蟲的日常檢測。項目組形 態學專家製作了成蟲和幼蟲盲樣，分別以盲1?盲5標記，使用本發明研究確立的引物探針 以及實時螢光定量PCR體系方法檢測鑑定是否是梨小食心蟲，見表5和圖4,結果表明用本 發明建立的分子檢測方法鑑定的結果同形態學專家鑑定的一致。
[0104] 表5盲樣測試結果表
[0105]

【權利要求】
1. 梨小食心蟲實時螢光PCR檢測方法，其特徵是： 檢測中所用特異性引物和探針的核苷酸分別為： 特異性引物為： F-Primer:5 ' -CAGCTCTTTTATTACTACTTTCACTACCA-3 ' R-Primer:5' -AATAGGATCTCCTCCTCCT-3' ； 探針為： Probe :5' -(FAM)CGAAATCTTAATACTTCATTTTTTGACCCTG(TAMRA)-3'。
2. 根據權利要求1所述的梨小食心蟲實時螢光PCR檢測方法，其特徵是包括以下步 驟： ① 、待鑑定樣品基因組DNA的提取； ② 、實時螢光定量PCR擴增體系設置： 以基因組DNA為擴增模板，用上述特異性引物和探針，進行實時螢光PCR檢測； ③ 、擴增結果分析及結果判斷。
3. 根據權利要求2所述的梨小食心蟲實時螢光PCR檢測方法，其特徵是： 探針的5'端標記有報告螢光染料，根據所採用的實時螢光PCR儀的配置而定，所述報 告螢光染料為FAM、HEX、J0E、VIC、NED、FITC、CY3或CY5,探針的3'端標記有淬滅螢光染料， 所述淬滅螢光染料為TAMRA、ROX、dabcyl、BHQ或ECLIPSE。
4. 根據權利要求2或3所述的梨小食心蟲實時螢光PCR檢測方法，其特徵是： 所述步驟②實時螢光定量PCR擴增體系設置為： 25 4 1^總體積中含有10父？〇?81^€612.5 4 1^，（1階13(2.51111，63(*)2 4 1^上下遊引物 (10 μ M)各 0· 5 μ L，探針（10 μ M) 0· 5 μ L，500U Taq DNA 聚合酶 0· 25 μ L 和 DNA 模板 2 μ L， 補水至25 μ L。
5. 根據權利要求4所述的梨小食心蟲實時螢光PCR檢測方法，其特徵是： 實時螢光PCR擴增條件為：95°C預處理15s，再以95°C變性5s，60°C退火/延伸34s，進 行40個循環，在每個循環的60°C退火/延伸階段收集螢光信號。
6. 根據權利要求5所述的梨小食心蟲實時螢光PCR檢測方法，其特徵是： 所述步驟④的擴增結果分析及結果判斷為：根據樣品擴增出具有指數增長型的螢光擴 增曲線，當其Ct值小於35,且陰性對照和空白對照無螢光信號，說明該樣品受到梨小食心 蟲汙染，否則不是梨小食心蟲汙染；當檢測樣品Ct值小於35,但陰性對照/空白對照有熒 光信號，說明該檢測結果不可信，整個檢測過程需要重新做。
7. 根據權利要求6所述的梨小食心蟲實時螢光PCR檢測方法，其特徵是： 所述步驟①的梨小食心蟲待檢樣品的DNA的提取可採用CTAB法、SDS法、高鹽低pH法 或試劑盒法進行提取。
【文檔編號】C12Q1/68GK104232785SQ201410536526
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2014年10月11日 優先權日:2014年10月11日
【發明者】王鳳軍, 馮俊麗, 華鵬, 張祥林, 張偉, 郭鐵群, 劉永傑, 王鵬舉 申請人:中華人民共和國庫爾勒出入境檢驗檢疫局