羅氏沼蝦諾達病毒核酸點雜交檢測的方法
2023-05-08 08:24:11
專利名稱：羅氏沼蝦諾達病毒核酸點雜交檢測的方法
技術領域：
本發明屬於蝦類病害檢測技術領域，具體涉及一種羅氏沼蝦諾達病毒核酸點雜交檢測的方法，適用於羅氏沼蝦肌肉白濁病病原的診斷。
參考文獻(1)Arcier J.M.，Herman F.，Lightner D.V.，Redman R.M.，Mari J.Bonami J.R.(1999).A viral disease associated with mortalities in hachery-reared postlarvaeof the giant freshwater prawn Macrobrachium rosenbergii.Diseases ofAquatic Organisms，38，177-181.
(2)Bonami J.R.(2002)A new viral disease in the giant freshwater prawnMacrobrachium rosenbergii.World Aquaculture 2002.Annual Meetings of theWorld Aquaculture Society and the China Society of Fisheries，April 23-27，2002.Beijing Convention Center，Beijing China.Abstract，p.79.
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(5)Tung C.W.，Wang C.S. Chen S.N.(1999)Histological and electronmicroscopic study on Macrobrachium muscle virus(MMV)infection in the giantfreshwater prawn，Macrobrachium rosenbergii(de Man)，cultured in Taiwan.Journal of Fish Diseases，22，1-5.
參考資料(1)、(2)(3)和(5)主要側重於羅氏沼蝦肌肉白濁病的病原研究，在組織病理、病毒的超微結構和生化特徵的水平上對病毒進行描述。資料(4)報導了一種羅氏沼蝦諾達病毒的免疫檢測方法，該方法操作簡單、快速，但靈敏度低。
為了達到以上目的，本發明採取以下技術方案(1)製備試劑盒試劑盒含有所有檢測程序中的必要成分，包括病毒核酸探針、樣品處理液、雜交液，封閉液、抗地高辛抗體、洗滌液、顯色劑、陽性對照、陰性對照、1.5ml離心管、雜交膜、雜交帶、研磨小棒。
(2)建立最佳的雜交反應體系。包括組織取材部位(整個幼苗或附肢)，最佳探針濃度(30-50ng/ml)，雜交溫度(42℃)，雜交液系統(雜交液採用50％甲醛，0.05M磷酸鈉2×SSC，2％封閉液，7％十二烷基硫酸酸鈉，0.1％十二烷基肌氨酸鈉)。
本發明主要技術難點(1)特異性病毒核酸探針的製備。地高辛探針的製備用多聚酶鏈反應擴增(PCR)方法。在100μl反應體積內加入10μl 10x緩衝液，7μl 25mM氯化鎂，10μl地高辛核甘酸混合物，2μl l0μM的上下遊質粒通用引物(上遊引物cgccagggttttcccagtcacgac；下遊引物gagcggataacaatttcacacagg)，1μl耐高溫核糖核甘酸聚合酶(Tag DNA聚合酶)，1μl含羅氏沼蝦諾達病毒基因組(cDNA)片段的質粒DNA(10-50ng)。PCR結束後，在PCR產物中加入10μl 200μM乙二胺四醋酸，pH8.0、1μl 4M氯化俚和2倍體積的無水乙醇沉澱並乾燥DNA，然後溶在50μl的無菌蒸餾水中。
(2)組織樣品處理。(整個幼苗或成蝦的附肢)，放入1.5ml的離心管內，加入樣品處理液(1∶10重量/體積)，用研磨小棒研磨直至組織被研碎。低速離心(3000g)後取上清1μl按1∶5稀釋，70℃處理15min並迅速放置冰上。
(3)點雜交程序的優化。首先是探針濃度的確定，合適的探針濃度為30-50ng/ml雜交液；其次是雜交液的選擇，雜交液採用50％甲醛，0.05M磷酸鈉2xSSC，2％封閉液，7％十二烷基硫酸酸鈉，0.1％十二烷基肌氨酸鈉；再次是雜交溫度的選擇，根據雜交液成分和病毒核酸性質，42℃為最佳雜交溫度。
本發明與現有技術相比有以下優點靈敏度高，能檢測出少於26ng的病蝦組織中的諾達病毒和少於2.5ng的病毒RNA；樣品處理程序簡單；不需要特殊昂貴的儀器；成本低；可以同時檢測多個樣品。
(2)探針的製備地高辛探針的製備用常規PCR方法，將PCR產物標記上地高辛。擴增引物來自質粒通用引物，構建羅氏沼蝦諾達病毒cDNA文庫。
(3)樣品處理稱取樣品(幼苗整個或成蝦的鰓)，放入1.5ml的離心管內，加入樣品處理液(1∶10重量/體積)，樣品處理液為焦碳酸二乙酯處理的緩衝液，緩衝液配方為0.02M三氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCl)，0.4M氯化鈉(NaCl)，pH7.4)，用研磨小棒研磨直至組織被研碎。低速離心(3000g)後取上清1μl按1∶5稀釋，70℃處理15min並迅速放置冰上。
取不同稀釋度的點雜交樣品1μl，點在帶正電荷的尼龍膜上，紫外燈下處理3min。
(4)預雜交和雜交將雜交膜放入雜交帶內，加入預雜交液使雜交膜被溶液覆蓋，預雜交液為50％甲醛，0.05M磷酸鈉2×SSC，2％封閉液，7％十二烷基硫酸鈉(SDS)，0.1％十二烷基肌氨酸鈉，封閉好雜交帶，在42℃預雜交1-4小時。然後用預雜交液稀釋探針(30-50ng/ml)，向雜交帶內加入探針雜交液，42℃雜交過夜。
(5)洗滌將雜交膜放在乾淨的平皿內，用洗滌液在室溫條件下洗滌2次，洗滌液為2×SSC，0.1％SDS，每次15min。將雜交膜重新放回乾淨的雜交帶內，用洗滌液，洗滌液為0.1×SSC，0.1％SDS，在68℃洗滌2次，每次15min。
(6)封閉棄洗滌液，洗滌液為0.1×SSC，0.1％SDS，加入緩衝液，緩衝液為1％封閉液，室溫下孵育30min。
(7)抗體抗原反應用緩衝液稀釋抗地高辛抗體(1∶5000稀釋)，緩衝液為1％封閉液，放入雜交帶內，室溫下孵育30min。
(8)洗滌取出雜交膜放在乾淨的平皿內，用緩衝液在室溫下連續洗滌2次，緩衝液為100mM馬來酸(Maleic acid)，150mM Nacl，pH7.5(20℃)，每次15min。
(9)顯色用緩衝液配置顯色底物(2ml緩衝液中加入9ul氯化硝基四氮唑藍鹽(NBT)和7ul 5-溴-4氯-3吲哚磷酸鹽(BCIP)。緩衝液為100mM Tris-HCl，100mM NaCl，50mM MgCl2，pH9.5，將雜交膜放在乾淨的雜交帶內，放入顯色底物覆蓋雜交膜，在避光處顯色(30min-2hr)。肉眼觀察結果，顯棕色為弱陽性反應，藍紫色為強陽性反應。
(10)終止反應棄顯色液，加入終止液。終止液為100mM Tris-Hcl；1mM乙二胺四乙酸(EDTA)；pH9.5(20℃)。記錄結果。
權利要求
1.一種羅氏沼蝦諾達病毒核酸點雜交檢測的方法，包括下列步驟(1)製備試劑盒包括病毒核酸探針、樣品處理液、雜交液，封閉液、抗地高辛抗體、洗滌液、顯色劑、陽性對照、陰性對照、1.5ml離心管、雜交膜、雜交帶、研磨小棒；(2)探針的製備地高辛探針的製備用常規PCR方法，將PCR產物標記上地高辛，擴增引物來自質粒通用引物，構建羅氏沼蝦諾達病毒cDNA文庫；(3)樣品處理稱取樣品，放入1.5ml的離心管內，加入樣品處理液，用研磨小棒研磨直至組織被研碎，低速離心後取上清1μl按1∶5稀釋，70℃處理15min並放置冰上；(4)預雜交和雜交將雜交膜放入雜交帶內，加入預雜交液使雜交膜被溶液覆蓋，封閉好雜交帶，在42℃預雜交1-4小時，然後雜交帶內加入探針雜交液，42℃雜交過夜；(5)洗滌將雜交膜放在乾淨的平皿內，用洗滌液在室溫條件下洗滌2次，將雜交膜重新放回乾淨的雜交帶內，加入洗滌液在68℃洗滌2次，每次15min；(6)封閉棄洗滌液，加入1％封閉液，室溫下孵育30min；(7)抗體抗原反應用緩衝液稀釋抗地高辛抗體，放入雜交帶內，室溫下孵育30min；(8)洗滌取出雜交膜放在乾淨的平皿內，用緩衝液在室溫下連續洗滌2次；(9)顯色用緩衝液配置顯色底物，將雜交膜放在乾淨的雜交帶內，放入顯色底物覆蓋雜交膜，在避光處顯色，肉眼觀察結果，顯棕色為弱陽性反應，藍紫色為強陽性反應；(10)終止反應；棄顯色液，終止液，記錄結果。
全文摘要
本發明公開了一種羅氏沼蝦諾達病毒核酸點雜交檢測的方法，其步驟是首先是探針的製備；其次是樣品處理；第三是預雜交和雜交；第四洗滌；第五是封閉；第六是抗體抗原反應；第七是洗滌；第八是顯色反應；最後終止反應。本發明靈敏度高，成本低，適合於羅氏沼蝦肌肉白濁病病原的診斷以及親蝦、幼苗和成蝦的健康狀態檢測。
文檔編號C12P19/34GK1438330SQ0311873
公開日2003年8月27日 申請日期2003年3月6日 優先權日2003年3月6日
發明者石正麗, 寶納米·簡·羅伯特 申請人:中國科學院武漢病毒研究所