果糖基肽基氧化酶和用於測定糖化蛋白質的傳感器的製作方法

2023-05-08 11:20:06

專利名稱：果糖基肽基氧化酶和用於測定糖化蛋白質的傳感器的製作方法
技術領域：
本發明涉及新的果糖基肽基氧化酶(FPOX)。更具體地，本發明涉及在用於測量糖化蛋白質(glycated proteins)，例如糖化白蛋白、果糖胺、HbAlc、果糖基六肽、果糖基纈氨酸和果糖基纈氨醯組氨酸的試劑盒和傳感器中使用的果糖基肽基氧化酶。
背景技術：
糖化的蛋白質通過蛋白質上的氨基和糖的還原端之間的共價鍵非酶促地產生，並又被稱作Amadori化合物。在血液中，葡萄糖在血紅蛋白β鏈的N端結合纈氨酸，從而產生糖化的血紅蛋白(糖化血紅蛋白(glycohemoglobin^HbAlc)。與正常的健康個體相比，在患有糖尿病的患者中HbAlc與血紅蛋白(Hb)的豐度比值較高，且已知血液中的HbAlc濃度反映了在過去幾周內的血糖水平。因此血液中的HbAlc濃度在診斷糖尿病的臨床檢測和在患有糖尿病的患者的血糖控制中非常重要。可使用對果糖基纈氨酸具有特異性的酶測量血液中的HbAlc濃度。果糖基胺基酸氧化酶是FAD依賴性酶，其催化下述反應，其中果糖基胺基酸被氧化，從而生成2-酮基-D-葡萄糖和相應的胺基酸。已經從多種生物中分離出果糖基胺基酸氧化酶，且已表明可使用這樣的酶分析糖化蛋白質，例如糖化白蛋白、HbAlc和果糖胺。為了以高特異性測定HbAlc，果糖基胺基酸氧化酶優選地具有對果糖基纈氨酸的選擇性(相比果糖基賴氨酸)。更優選地，果糖基胺基酸氧化酶可具有對果糖基纈氨醯組氨酸的氧化酶活性，果糖基纈氨醯組氨酸對應於Hb的N端的2個胺基酸。Hirokawa等人 (Biochem Biophys Res Commun, 311(1)，2003，104-111)公開了來源於 Achaetomiella 和Chaetomius屬的絲狀細菌的果糖基肽基氧化酶。本發明的目的是提供用於測量糖化蛋白質的新的果糖基肽基氧化酶。

發明內容
本發明是基於具有圖1所示的胺基酸序列(SEQ ID NO: 1)的來源於小麥穎枯病菌 (.Phaeosphaeria floi/ory )的果糖基肽基氧化酶的發現。在一個方面，本發明提供了包含與SEQ ID NO: 1中所述的胺基酸序列具有至少70%同一性的胺基酸序列並對果糖基纈氨醯組氨酸具有ImM或更低的Km值的果糖基肽基氧化酶用於測定樣品中的糖化蛋白質的用途。 本發明還提供了包含與SEQ ID NO: 1中所述的胺基酸序列具有至少70%同一性的胺基酸序列並對果糖基纈氨醯組氨酸具有10U/mg · mM或更高的Vmax/Km值的果糖基肽基氧化酶用於測定樣品中的糖化蛋白質的用途。本發明還提供了包含與SEQ ID N0:1中所述的胺基酸序列具有至少70%同一性的胺基酸序列並且當在50°C熱處理10分鐘時具有50%或更高的殘留活性的果糖基肽基氧化酶用於測定樣品中的糖化蛋白質的用途。在另一個方面，本發明提供了測定樣品中的糖化蛋白質的方法，其包括使樣品接觸如上定義的果糖基肽基氧化酶，並測量被果糖基肽基氧化酶氧化的糖化蛋白質的量。在還另一個方面，本發明提供了測定HbAlc的方法，其包括消化樣品中的HbAlc以產生果糖基纈氨酸或果糖基纈氨醯組氨酸，使果糖基纈氨酸或果糖基纈氨醯組氨酸接觸如上定義的果糖基肽基氧化酶，並測量被氧化的果糖基纈氨酸或果糖基纈氨醯組氨酸的量。在還另一個方面，本發明提供了測定樣品中果糖基纈氨酸、果糖基纈氨醯組氨酸、 果糖基六肽或HbAlc的裝置，其包含如上定義的果糖基肽基氧化酶和電子轉移介質。優選地，電子轉移介質是N，N-雙羥乙基-4-亞硝基苯胺。也優選地，所述裝置還包含一種或多種選自皂苷、膽紅素氧化酶和蛋白酶N的試劑。在另一個方面，本發明提供了測定樣品中果糖基纈氨酸、果糖基纈氨醯組氨酸、果糖基六肽或HbAlC的試劑盒，其包含如上定義的果糖基肽基氧化酶和電子轉移介質。在還另一個方面，本發明提供了酶電極，其具有固定在電極上的如上定義的果糖基肽基氧化酶。優選地，使用可光交聯的聚乙烯醇樹脂將果糖基肽基氧化酶固定在電極上。在還另一個方面，本發明提供了測定果糖基纈氨酸、果糖基纈氨醯組氨酸、果糖基六肽或HbAlc的酶傳感器，其包含本發明的酶電極作為工作電極。


圖1顯示了來自小麥穎枯病菌的果糖基肽基氧化酶的胺基酸序列。圖2顯示了果糖基肽基氧化酶的純化步驟。圖3顯示了純化的果糖基肽基氧化酶的SV曲線。圖4顯示了果糖基肽基氧化酶的熱穩定性。圖5顯示了在m-PMS/DCIP系統中使用果糖基肽基氧化酶測量果糖基纈氨酸。圖6顯示了使用果糖基肽基氧化酶測量果糖基六肽。圖7顯示了使用果糖基肽基氧化酶測量HbAlc。圖8顯示了在H2A系統中使用具有果糖基肽基氧化酶的電極測量果糖基纈氨酸。圖9顯示了在普魯士藍系統中使用具有果糖基肽基氧化酶的電極測量果糖基纈氨酸。圖10顯示了在亞硝基苯胺(NA)系統中使用具有果糖基肽基氧化酶的電極測量果糖基纈氨酸。圖11顯示了在m-PMS系統中使用具有果糖基肽基氧化酶的電極測量果糖基纈氨酸。
具體實施例方式本發明的果糖基肽基氧化酶(PnFPOX)來源於小麥穎枯病菌，並具有圖1中所示的胺基酸序列(SEQ ID NO: I).在本發明中也可使用具有與SEQ ID NO: 1中所述的胺基酸序列至少80%序列同一性的修飾的胺基酸序列的果糖基肽基氧化酶變體。優選地，序列同一性為至少85%，更優選地至少90%，和最優選地至少95%。小麥穎枯病菌的基因組序列已被公開，但此基因還沒有被注釋。沒有跡象或暗示顯示小麥穎枯病菌具有果糖基肽基氧化酶或此基因可能編碼任意種類的酶。PnFPOX 的胺基酸序列顯示了與 FP0X-E (土正青黴(Eupenicillum terrenum)ATCC 18547; GenBank: BAD00185. 1)的 71% 的同一性和與FP0X-C (錐毛殼屬物種(Coniochaeta sp. )NISL 9330; GenBank: BAD00186. 1)的74%的同一性。與其他已知果糖基胺基酸氧化酶的序列同源性為約30%。如在下面的實施例中所描述地，PnFPOX顯示了對果糖基纈氨酸的更高的活性(相比對果糖基賴氨酸)。其也顯示了對果糖基纈氨醯組氨酸的甚至更高的活性。PnFPOX對果糖基纈氨醯組氨酸的Km值是ImM或更低，優選地0. 5mM或更低，和更優選地0. 3mM或更低， 這比FPOX-E和FPOX-C的低約10倍。PnFPOX對果糖基纈氨醯組氨酸的Vmax/Km值是IOU/ mg · mM或更高。此特徵在使用此酶以更高的靈敏度和特異性測定HbAlc中特別有利。本發明的果糖基肽基氧化酶的另一個有利特徵是其熱穩定性。當在10 mM PPB (pH 7.0)中在50°C熱處理PnFPOXlO分鐘時，觀察到約75%的殘留活性。可使用本領域熟知的技術通過重組表達製備本發明的果糖基肽基氧化酶。PnFPOX 的核酸序列可見GenBank: ΧΡ_001798711. 1。可適當地修飾或設計序列，從而在選定的宿主生物中獲得更好的表達水平。編碼PnFPOX的多核苷酸可從小麥穎枯病菌中克隆，或使用一系列化學合成的寡核苷酸通過PCR製備，或使用自動化DNA合成儀完全合成。將編碼PnFPOX的基因插入合適的表達載體，並將載體引入合適的宿主細胞，例如大腸桿菌。培養轉化體，並從細胞或培養基中收集在轉化體中表達的果糖基肽基氧化酶。這樣得到的重組果糖基肽基氧化酶可通過本領域已知的任意純化技術純化，所述技術包括離子交換柱層析、親和層析、液體層析、過濾、超濾、鹽沉澱、溶劑沉澱、免疫沉澱、 凝膠電泳、等電電泳和透析。本發明的果糖基肽基氧化酶在測定樣品中的糖化蛋白質中有用。測定方法包括使樣品接觸本發明的果糖基肽基氧化酶，並測量被果糖基肽基氧化酶氧化的糖化蛋白質的量。通過本發明測定的糖化蛋白質包括，例如，果糖基纈氨酸、果糖基纈氨醯組氨酸、果糖基六肽、HbAlc、糖化白蛋白和果糖胺。在一個方面，本發明提供了測定HbAlc的方法，其包括消化樣品中的HbAlc以產生果糖基纈氨酸，使果糖基纈氨酸接觸本發明的果糖基肽基氧化酶，並測量被氧化的果糖基纈氨酸的量。可用蛋白酶(proteinase)(例如蛋白酶(protease) 和蛋白酶N)消化HbAlc。在優選的實施方案中，所述方法包括用蛋白酶N消化樣品中的 HbAlc以產生果糖基纈氨醯組氨酸，使果糖基纈氨醯組氨酸接觸本發明的果糖基肽基氧化酶，並測量被氧化的果糖基纈氨醯組氨酸的量。在另一個方面，本發明提供了通過內切蛋白酶(endoprotease) Glu-C消化HbAlc以產生果糖基六肽，並通過本發明的果糖基肽基氧化酶測定果糖基六肽來測定HbAlc的方法。現在令人驚訝地發現，來自小麥穎枯病菌的果糖基胺基酸氧化酶能夠氧化果糖基六肽，而現有技術的FPOX-C (錐毛殼屬物種MSL 9330 ； GenBank: BADOO186. 1)不能。可通過本領域已知的任意方法，例如使用H2A檢測試劑如4AA/T0DB/P0D (4_氨基安替比林/N，N -雙磺丁基)-3-甲基苯胺二鈉鹽/辣根過氧化物酶)或通過鉬電極測量產生的H2A的量來實現被果糖基肽基氧化酶氧化的糖化蛋白質的量的測量。可選地，可在電子介質的存在下進行測定，並使用例如mPMS/DCIP (1-甲氧基-5-甲基吩嗪 甲基硫酸化物/2，6-二氯靛酚)，cPES (三氟乙酸-1-(3-羧基-丙氧基)-5-乙基-吩嗪 H，NA BM31_1144 (N，N-雙(羥乙基)-3-甲氧基-亞硝基苯胺鹽酸化物，NA BM31_1008 (N, N- 二羥乙基-4-亞硝基苯胺)和N-N-4- 二甲基-亞硝基苯胺測量轉移至介質的電子的量。其中，特別優選NA_BM31_1008。在另一個方面，本發明提供了測定樣品中果糖基纈氨酸、果糖基纈氨醯組氨酸、果糖基六肽或HbAlc的裝置，其包含本發明的果糖基肽基氧化酶。測定裝置可具有與常規的、市售的用於監控血糖水平的測量電流的生物傳感器檢測條類似的結構。這樣的裝置的實例具有放置在絕緣基質上的2個電極(工作電極和參考電極或對電極)、試劑埠和樣品接收器。試劑埠包含本發明的果糖基肽基氧化酶、FAD 和電子轉移介質。當向樣品接收器中加入例如血樣的樣品時，樣品中包含的果糖胺將與果糖基肽基氧化酶反應從而產生電流，其指示樣品中果糖胺的量。當使用全血作為樣品時， 裝置還可包含用於溶血的試劑。特別優選的溶血試劑是皂苷。在另一個優選的實施方案中，裝置還可包含膽紅素氧化酶(BOD)以減少由全血樣品中包含的還原性成分導致的傳感器的背景電流。在另一個優選的實施方案中，裝置還可包含蛋白酶N以實現果糖基纈氨酸或果糖基纈氨醯組氨酸從血液中存在的糖化白蛋白中的釋放。皂苷、BOD和蛋白酶N可被單獨地固定在裝置上，使得全血樣品與皂苷接觸以實現溶血，然後與BOD和蛋白酶N接觸。適於測定酶底物的電化學傳感器的一般實例是已知的，例如來自WO 2004/113900和US 5，997，817。作為電化學傳感器的替代選擇，可使用光學檢測技術。一般地，這樣的光學裝置是基於包含酶、電子轉移介質和指示劑的試劑系統中發生的顏色變化。可使用螢光、吸收或減輕(remission)的測量定量顏色變化。適於測定酶底物的光學裝置的一般實例是已知的，例如來自 US 7,008,799，US 6, 036, 919,和 US 5，334，508。在還另一個方面，本發明提供了用於測定樣品中果糖基纈氨酸、果糖基纈氨醯組氨酸、果糖基六肽或HbAlc的試劑盒，其包含本發明的果糖基肽基氧化酶。可使用本發明的果糖基肽基氧化酶構建用於測量果糖基纈氨酸、果糖基纈氨醯組氨酸或果糖基六肽的試劑盒。除了本發明的果糖基肽基氧化酶以外，試劑盒可包含測量所必需的緩衝液，合適的介質，用於製作校準曲線的果糖基纈氨酸、果糖基纈氨醯組氨酸或果糖基六肽或其衍生物的標準品，和使用說明書。試劑盒也可包含內切蛋白酶Glu-C，用於消化HbAlc以產生果糖基六肽。可以多種形式提供本發明的果糖基肽基氧化酶，例如作為凍幹試劑或作為在合適的儲存溶液中的溶液。也有可能使用本發明的果糖基肽基氧化酶構建果糖胺、糖化白蛋白或HbAlc測定試劑盒。酶促或化學消化果糖胺、糖化白蛋白或HbAlc，從而產生果糖胺化合物例如糖基纈氨酸或果糖基纈氨醯組氨酸，其然後通過使用本發明的果糖基肽基氧化酶被定量。因此， 用於果糖胺、糖化白蛋白或HbAlc的本發明的測定試劑盒可還包含用於水解的試劑或蛋白酶。優選的蛋白酶是蛋白酶N，其將消化HbAlc以產生果糖基纈氨醯組氨酸。在另一個方面，本發明提供了具有固定在電極上的本發明的果糖基肽基氧化酶的酶電極。在優選的實施方案中，使用聚合物將本發明的果糖基胺基酸氧化酶固定在電極上，以避免BOD和蛋白酶N與果糖基胺基酸氧化酶和介質接觸。否則，BOD將幹擾介質的氧化還原性能，且蛋白酶N將降解果糖基胺基酸氧化酶。優選的聚合物是可光交聯的聚乙烯醇樹脂，例如由Toyo Gosei有限公司(Chibii，Japan)提供的具有疊氮化物單元側基的 (azide-unit pendant)水溶性光聚合物(AWP)。為了構建酶電極，向電極表面應用包含AWP、 果糖基胺基酸氧化酶和介質如NA_BM31_1008的緩衝溶液。在乾燥溶液後，輻射紫外光以實現聚合物的交聯。在另一個方面，本發明提供了用於測定果糖基纈氨酸、果糖基纈氨醯組氨酸、果糖基六肽或HbAlc的酶傳感器，其包含本發明的酶電極作為工作電極。
可通過測量通過酶反應產生的電子的量測定樣品中果糖胺的濃度。本發明的果糖基肽基氧化酶被固定在電極，例如碳電極、金屬電極和鉬電極上。可通過交聯、封裝進大分子基質、用透析膜覆蓋、光交聯聚合物、導電聚合物、氧化還原聚合物或本領域技術人員熟知的其它方法和任意其組合固定酶。當在測量電流的系統中進行測量時，使用具有固定的PnFPOX的碳電極、金電極或鉬電極作為工作電極，同時使用對電極(例如鉬電極)和參考電極(例如Ag/AgCl電極)。將電極插入包含介質的緩衝液並維持在預定的溫度下。對工作電極應用預定的電壓，然後加入樣品並測量電流的增加值。在測定中使用的介質的實例包括鐵氰化鉀、二茂鐵、鋨衍生物、釕衍生物、吩嗪甲基硫酸化物等等。一般也可能使用所謂的雙電極系統，其具有一個工作電極和一個對電極或假參考電極。為了製造用於測量果糖胺、糖化白蛋白或HbAlc的傳感器，將上述用於測量果糖基纈氨酸或果糖基纈氨醯組氨酸的傳感器進一步與包含固定的蛋白酶(如蛋白酶N或蛋白酶，優選蛋白酶N)的膜組合，以構建複合傳感器。這樣的通過組合多種酶基於連續反應的複合傳感器的結構是本領域熟知的。見，例如Anthony P. F. Tuner, Isao Karube和George S. Wilson 的「Biosensor - Fundamental 禾口 Applications，，，Oxford University Press, 1987。在本說明書中引用的所有專利和參考文件內容以其整體引入本文作為參考。 實施例通過下面的實施例將詳細說明本發明，儘管本發明不應受限於這些實施例。實施例1
小麥穎枯病菌果糖基肽基氧化酶的製備
在公開資料庫中的小麥穎枯病菌的基因組信息中發現PnFPOX的核苷酸序列 (GenBank: XP_001798711. 1)。由於推定的ORF包含大腸桿菌中的一些稀有密碼子，因此優化了基因的密碼子使用以在大腸桿菌中表達基因。在此優化後，在序列中不存在顯著的稀有密碼子。將合成的基因亞克隆進表達載體pET28a以構建pEPN (pET28a-PnFP0X)。在50 ml補充50 μ g/ml卡那黴素的LB培養基中在37°C培養用PnFAOD表達載體(pEPN)轉化的大腸桿菌BL21 (DE3)細胞，並在0D660nm = 0.8時加入IPTG (終濃度0. 4 mM)。在25°C繼續培養，直到0D660nm達到約3。通過離心(5，000xg, 4°C，10分鐘)收集細胞，洗滌(0.85% NaCl 溶液，6，000xg，4°C , 5 分鐘)，在:3ml 10 mM PPB (pH 7.0)中懸浮，並通過超聲波均質器均質。將得到的懸浮液離心(10，OOOxg，4°C , 20分鐘)，並進一步離心上清(60，000 rpm, 4°C，60分鐘)。將上清針對添加25 μ M FAD的IOmM PPB (ρΗ7. 0)透析以得到水溶性級分。在SDS-PAGE分析中，水溶性級分顯示了約48_50kDa的條帶，這與PnFPOX的預測分子量一致。使用P0D/T0DB/4A. A.法用3種底物果糖基纈氨酸(FV)、果糖基賴氨酸(ΠΟ和果糖基纈氨醯組氨酸(FVH)檢查水溶性級分的氧化酶活性。果糖基肽基氧化酶不僅顯示了對果糖基胺基酸(FV、HO的氧化活性，而且顯示了對果糖基二肽(FVH)的氧化活性。實施例2
小麥穎枯病菌果糖基肽基氧化酶的純化和表徵在圖2中總結了純化步驟。在含有50 yg/ml卡那黴素的LB培養基(7L)中在37 V 有氧培養用pEPN (pET28a-PnFP0X)轉化的大腸桿菌BL21 (DE3)。在達到1. 4的A660nm 值後，用0. 3 mM IPTG誘導細胞，並在25 °C繼續培養，直到達到3. 0的A660nm值。通過離心收穫細胞，並將1/4的收穫細胞(約10. 5g)在10 mM PPB, pH 7.0中重懸，並通過2個通道穿過弗氏壓碎器(1，000 kg cm-2)裂解。以10，OOOg在4 °C離心裂解液20分鐘，並以 40, 000 rpm在4 ！離心上清90分鐘。然後將上清對含有25 μ M FAD的10 mM PPB, pH 8.0透析。向透析的上清中加入硫酸銨至35%飽和，然後通過以15，OOOg離心20分鐘沉澱形成的沉澱物。向上清中加入硫酸銨至95%飽和，以15，OOOg離心20分鐘。在含有25 μ M FAD和1%甘露糖的IOmM PPB, pH 8. 0中溶解得到的沉澱物，並在4 °C對相同的緩衝液透析,並且之後對含有25 μ M FAD的10 mM PPB, pH 8. 0透析。對用10 mM PPB, pH 8. 0平衡的RESOURCE Q柱(GE Healthcare)應用透析的酶溶液。收集活性流通(flow-through) 級分，並用1 M NaCl洗脫顯示無FAOD活性的吸附的蛋白質。收集活性流通級分，並對10 mM PPB, pH 7. 0 透析。對用10 mM PPB, pH 7. 0 平衡的 HiLoad 16/60 Superdex 75 pg 柱(GE Healthcare)應用透析的酶溶液。用相同的緩衝液進行凝膠過濾層析。收集活性級分，並將純化的酶溶液對含有100 μ M FAD的10 mM PPB, pH 7.0透析，並儲存在4 °C。通過 SDS-PAGE驗證純化的酶的純度，並使用DC蛋白質測定試劑盒(Bio-Rad，CA, USA)測量蛋白質濃度。如在表1中總結的，通過硫酸銨沉澱、陰離子交換層析和凝膠過濾層析，從大腸桿菌BL21(DE3)/pEPN(pET28a-PnFP0X)的細胞提取物中純化了 35倍的PnFPOX。純化的製品在SDS-PAGE上顯示了接近單個條帶。 表1重組PnFPOX的純化
權利要求
1.果糖基肽基氧化酶用於測定樣品中的糖化蛋白質的用途，所述果糖基肽基氧化酶包含與SEQ ID NO: 1中所述的胺基酸序列具有至少70%同一性的胺基酸序列並對果糖基纈氨醯組氨酸具有ImM或更低的Km值。
2.果糖基肽基氧化酶用於測定樣品中的糖化蛋白質的用途，所述果糖基肽基氧化酶包含與SEQ ID NO: 1中所述的胺基酸序列具有至少70%同一性的胺基酸序列並對果糖基纈氨醯組氨酸具有10U/mg · mM或更高的Vmax/Km值。
3.果糖基肽基氧化酶用於測定樣品中的糖化蛋白質的用途，所述果糖基肽基氧化酶包含與SEQ ID NO: 1中所述的胺基酸序列具有至少70%同一性的胺基酸序列並且當在50°C 熱處理10分鐘時具有50%或更高的殘留活性。
4.一種用於測定樣品中的糖化蛋白質的方法，其包括使所述樣品接觸如在權利要求 1-3的任一項中定義的果糖基肽基氧化酶，並測量被所述果糖基肽基氧化酶氧化的糖化蛋白質的量。
5.一種用於測定HbAlc的方法，其包括消化樣品中的HbAlc以產生果糖基纈氨酸或果糖基纈氨醯組氨酸，使所述果糖基纈氨酸或果糖基纈氨醯組氨酸接觸如在權利要求1-3的任一項中定義的果糖基肽基氧化酶，並測量被氧化的果糖基纈氨酸或果糖基纈氨醯組氨酸的量。
6.一種用於測定樣品中果糖基纈氨酸、果糖基纈氨醯組氨酸、果糖基六肽或HbAlc的裝置，其包含如在權利要求1-3的任一項中定義的果糖基肽基氧化酶和電子轉移介質。
7.如權利要求6中要求保護的裝置，其中所述電子轉移介質是N，N-雙羥乙基-4-亞硝基苯胺。
8.如權利要求6或7中要求保護的裝置，其還包含一種或多種選自皂苷、膽紅素氧化酶和蛋白酶N的試劑。
9.一種用於測定樣品中果糖基纈氨酸、果糖基纈氨醯組氨酸、果糖基六肽或HbAlc的試劑盒，其包含如在權利要求1-3的任一項中定義的果糖基肽基氧化酶和電子轉移介質。
10.如權利要求9中要求保護的試劑盒，其中所述電子轉移介質是N，N-雙羥乙基-4-亞硝基苯胺。
11.如權利要求10或11中要求保護的試劑盒，其還包含一種或多種選自皂苷、膽紅素氧化酶和蛋白酶N的試劑。
12.一種酶電極，其具有固定在電極上的如在權利要求1-3的任一項中定義的果糖基肽基氧化酶。
13.如權利要求12中要求保護的酶電極，其中使用具有疊氮化物單元側基的水溶性光聚合物(AWP)將果糖基肽基氧化酶固定在電極上。
14.如權利要求12或13中要求保護的酶電極，其還包含固定在電極上的N，N-雙羥乙基-4-亞硝基苯胺。
15.一種用於測定果糖基纈氨酸、果糖基纈氨醯組氨酸、果糖基六肽或HbAlc的酶傳感器，其包含權利要求12-14中任一項的酶電極作為工作電極。
全文摘要
公開了來源於芽殖酵母小麥穎枯病菌(Phaeosphaerianodorum)的果糖基肽基氧化酶用於測定樣品中的糖化蛋白質的用途。本發明的果糖基肽基氧化酶具有對果糖基纈氨酸以及果糖基纈氨醯組氨酸的較高的活性，並以較高的靈敏度和特異性用於測定HbA1c。還公開了包含這種酶的電極傳感器。
文檔編號C12Q1/26GK102575278SQ201080033796
公開日2012年7月11日 申請日期2010年8月2日 優先權日2009年8月3日
發明者K.伊克布庫羅, K.索德 申請人:究極酵素國際股份有限公司, 霍夫曼-拉羅奇有限公司