ApoAI細胞靶標ELISA篩藥系統篩選抗心血管病藥的方法
2023-05-07 11:23:51
專利名稱：ApoAI細胞靶標ELISA篩藥系統篩選抗心血管病藥的方法
技術領域：
本發明涉及細胞靶標篩藥系統篩選藥物方法，具體涉及ApoAI的ELISA測定方法及ApoAI細胞靶標ELISA篩藥系統篩選第三代升HDL抗動脈粥樣硬化心血管病藥的方法。
ApoAI細胞靶標ELISA篩藥系統是篩選新一代抗動脈粥樣硬化心腦血管病升高密度脂蛋白(HDL)藥中的核心技術工具，包括篩藥用細胞株的選擇，細胞培養系統，ApoAI ELISA測定方法和高通量篩藥方法等部分。我們已建立的篩選抗動脈粥樣硬化升HDL藥系統是根據動脈粥樣硬化心腦血管疾病的發病機理，找出並以控制該疾病發生，發展和治療的關鍵蛋白ApoAI為靶標，選擇以與ApoAI產生和代謝密切有關的細胞株HepG2為篩選細胞株，建立測定靈敏度高，測定濃度範圍大，操作簡單，便宜的ApoAI ELISA間接測定法。再以ApoAI ELISA測定法為主體，建立高通量升HDL藥篩藥方法。通過測定被篩選化合物激發細胞產生ApoAI蛋白的程度來篩選新一代抗動脈粥樣硬化升HDL藥。
動脈粥樣硬化心腦血管疾病(如冠心病，中風)是中國和西方國家致死疾病中的主要殺手。其主要病因是高血清總膽固醇(Gordon et al.1981；Stamleret al.1986；Pooling Project Research Group 1978；Anderson etal.1987)。流行病學調查揭示，血清總膽固醇每增加1％，冠心病危險因素增加2％(NCEPR1991)。臨床研究發現，降低血清膽固醇水平可以減少冠心病的發病率，阻滯動脈粥樣硬化的發展(LPCP 1984；Frick 1987)。膽固醇不溶於水，不能在血液裡轉運。它們必需與脂蛋白結合才能在血液裡運轉。人血液裡有四種脂蛋白負責膽固醇的運載。它們是低密度脂蛋白(LDL)，高密度脂蛋白(HDL)，極低密度脂蛋白(VLDL)和中間密度脂蛋白(IDL)。在正常人中，三分之二的總膽固醇由LDL運載。LDL攜帶內源或外源膽固醇，穿過血管壁，進入內皮下(subendothelium)。在內皮下，LDL膽固醇被氧化成氧化型LDL膽固醇，並通過清道夫受體被巨噬細胞以膽固醇酯的形式在細胞內積聚。大量膽固醇酯積聚在巨噬細胞內形成了泡沫細胞。積聚了大量膽固醇酯的泡沫細胞沉積在血管內皮下，形成了動脈粥樣硬化斑塊核心。資料表明，由LDL運載的膽固醇是導致動脈粥樣硬化冠心病的主要根源(Goldstein1989；Vega 1986；Innerarity 1990；Rauth 1992)。所以LDL膽固醇被稱為壞膽固醇。膽固醇引起的動脈粥樣硬化不但是冠心病的主要根源，同時也是腦血管疾病，如腦血栓形成，中風的重要病因。此外人腦細胞內積聚的高膽固醇酯還可能和老年性痴呆症的形成有關。體內膽固醇來源有內源和外源。外源膽固醇來自於飲食，內源膽固醇是自體合成的結果。內源膽固醇合成亢進和家族性高膽固醇血症在西方國家較為普遍。這種疾病必須通過藥物控制。在美國，40％以上的成年人的LDL膽固醇(壞膽固醇)含量超過正常水平。由於膽固醇在形成心腦血管疾病中的重要作用，近十多年來，美國及歐洲藥廠都把其抗動脈粥樣硬化藥的研究和開發放到降低血清總膽固醇及LDL膽固醇上。這些藥中療效最顯著的有Merck藥廠的Zocor和Warner-Lambert/Parke-Davis去年上市的Lipitor。這些藥的作用機理都是抑制人體膽固醇合成的關鍵酶HMG-CoA-還原酶。雖然HMG-CoA-還原酶抑制藥能顯著的降低血清總膽固醇，防止、阻止及降低動脈粥樣硬化和冠心病發病，發展和死亡，但它只能減少內源性膽固醇合成及降低家族性高膽固醇血症引起的冠心病的發展或惡化。對於治療外源性膽固醇增多引起的動脈粥樣硬化，對於消除已進入巨噬細胞內的膽固醇和抑制由此導致的動脈粥樣硬化形成，對於去除動脈粥樣硬化斑塊中積聚的膽固醇，使動脈粥樣硬化血管回復正常，則作用不大或無能為力。換句話說，目前歐美市場流行的抑制內源性膽固醇生成藥物不能從根本上治療廣義的動脈粥樣硬化心腦血管疾病。
醫學研究證明，巨噬細胞吞噬和積聚膽固醇，轉換成泡沫細胞，沉積在血管壁內皮下是動脈粥樣硬化斑塊形成的基礎。清除積聚在血管壁巨噬細胞/泡沫細胞內的膽固醇，將其轉運到肝臟分解，是治療單純降血清膽固醇所不能達到的，根治動脈粥樣硬化心腦血管疾病的最新的有效手段，清除巨噬細胞/泡沫細胞及動脈粥樣硬化斑塊內膽固醇的唯一的有效武器是HDL。近年來，西方心血管疾病研究人員及製藥公司開始把研究方向放到新一類抗動脈粥樣硬化藥，升高密度脂蛋白(HDL)藥上來。高密度脂蛋白(HDL)是一重要的膽固醇載體，它在運載膽固醇方面的功能與LDL截然相反。HDL可以刺激血管內皮下巨噬細胞內膽固醇酯水解，並將水解的非酯化膽固醇從巨噬細胞內轉運至肝臟分解。更為重要的是，HDL能刺激沉積於血管壁和血管壁動脈粥樣硬化斑塊中巨噬細胞/泡沫細胞內膽固醇酯水解。非酯化膽固醇被HDL從泡沫細胞轉運至肝臟分解(Alan et al.1996)。從而去除了動脈粥樣硬化賴以形成的基礎。所以HDL的重要功能被稱為膽固醇逆相轉運(Reverse Cholesterol Transportation)。膽固醇逆相轉運的結果是①抑制膽固醇酯在巨噬細胞內累積，阻止其轉化為泡沫細胞，從而防止了動脈粥樣硬化的形成；②因為HDL具有獨特的轉運動脈粥樣硬化斑塊內泡沫細胞裡膽固醇至肝臟分解的作用，從而使動脈粥樣硬化血管壁逐步回復正常。HDL的此二項功能一直是西方醫學界在治療動脈粥樣硬化病中夢寐以求的效果。此外，HDL含有paraoxonase，可以抑制低密度脂蛋白氧化，防止LDL被巨噬細胞吞噬，產生泡沫細胞。HDL還可以刺激內皮細胞釋放前列環素(PI)增加膽固醇酯水解和膽固醇轉運出細胞。HDL的作用對象不分內源或外源膽固醇。基礎及臨床研究證實，每增加1mg/dl HDL膽固醇，冠心病死亡危險即下降2.5％(Alan et al.1996)。低血漿HDL是比高血漿膽固醇更重要的致動脈粥樣硬化及冠心病的危險因子(Alan et al.1996)。
提高血漿HDL含量的機理是什麼呢？簡單地說是激活合成HDL活性成份的有關基因及HDL合成過程中有關酶的基因，使其表達和合成HDL，同時抑制不利HDL合成的因素的活性。與HDL合成及其轉運膽固醇功能密切有關的活性成份和酶有載脂蛋白A-I(ApoAI)，卵磷脂乙醯膽固醇轉移酶(LCAT)，脂蛋白脂酶(LPL)，膽固醇酯轉移蛋白(CETP)，載脂蛋白C-III(apoC-III)。ApoAI的主要功能是①組成HDL最重要的結構成份(Chapman etal.1980；Sastry et al.1988)；②激活HDL合成關鍵酶，LCAT(Fielding et al.1972；Soutar et al.1975)；③促進細胞內膽固醇外流(Glomset et al.1968；Scampfer et al.1991)。從人ApoAI流動率和靈長類HDL水平的研究認為，ApoAI的合成速率決定了血漿HDL水平(Schaefer et al.1978，1982；Sorci-Thomas et al.1988)。LPL的功能是催化血漿VLDL和乳糜微粒脂解，產生膽固醇和磷脂供合成HDL的關鍵酶LCAT合成HDL的中心成份，膽固醇酯所用。apo C-III會抑制LPL活力，導致HDL合成原料饋乏。而CETP則催化膽固醇酯從HDL轉移到VLDL，並將三酸甘油酯從VLDL轉至HDL，使HDL分解，同時導致ApoAI在轉移中流失。apo C-III和CETP是HDL合成中的二個負性因子，所以要提高血漿HDL含量，必需升高①ApoAI，②激活LPL和③LCAT，④減少apo C-III和⑤抑制CETP活力。以上五項因素中，最重要一項是ApoAI水平。
流行病和轉基因動物實驗研究結果證實，血漿ApoAI可以抑制動脈粥樣硬化的形成和發展(Castelli et al.1977；Rutin et al.1991)。ApoAI含量降低，動脈粥樣硬化發病率升高(Castelli et al.1986；Rutin et al.1991)。升高ApoAI本身對消除動脈粥樣硬化斑塊，治療動脈粥樣硬化作用顯著。所以ApoAI成為一個重要的篩藥靶標。
本發明目的是提供了建立一種全新的ApoAI ELISA測定方法。
本發明的另一目的是提供ApoAI ELISA細胞靶標篩藥系統篩選第三代升HDL抗動脈粥樣硬化心血管病藥的方法。
待測抗原(ApoAI)與過量抗體混合孵育，反應平衡時抗體以兩種形式存在抗原-抗體複合物及游離抗體；將此平衡混合物加入預先經抗原包被的酶標板中，混合物中的游離抗體被板上的抗原捕獲，抗原-抗體複合物則經洗板除去；最後加入辣根過氧化物酶底物，經顯色反應檢測板上抗體的濃度，由此可推知待測抗原濃度。
HrpAb2+Ab+Ag→HrpAb2-Ab-Ag+HrpAb2-Ab↓進板HrpAb2-Ab-Ag+HrpAb2-Ab-Ag-Plate↓洗板HrpAb2-Ab-Ag-Plate↓底物(OPD)酶標儀492nm檢測HrpAb2—辣根過氧化物酶標記二抗Ab —一抗Ag —抗原Plate —酶標板步驟1)抗原包板ApoAI稀釋至200ng/ml，加入Nunc酶標板中，每孔50μl，置溼盒中，包板條件為37℃ 2小時或4℃ 16小時，蒸餾水洗板3次，每孔加入封閉液100μl，室溫放置1小時以上，用前再洗板3次。
2)孵育在普通96孔板中，混合一抗，二抗和待測培液或標準標準濃度配製ApoAI等比梯度稀釋，最終濃度為400，200，100，50，25，12.5，6.25，3.12ng/ml；抗體稀釋一抗1∶50000，二抗1∶20000；空白孔100μl緩衝液；最大結合孔50μl抗體混合液，50μl緩衝液；標準/樣品孔每孔加入抗體混合液50μl，ApoAI標準或待測培液50μl；振蕩混勻，37℃ 2小時或4℃ 16小時孵育以上。
3)抗體捕獲將96孔板中的孵育液轉移至包被好的Nunc酶標板中，室溫反應30分鐘，其間緩緩搖動。
4)檢測以蒸餾水洗板3次，每孔加入100μl新配製的底物顯色液，避光放應30分鐘，加入25μl終止液終止反應，與酶標儀波長492nm處測定吸光值。
數據處理1)標準曲線(見
圖1)標準濃度讀數減去空白值後，按以下公式計算x=lnB/Bmax1-B/Bmax]]>B-標準濃度吸光值Bmax-最大結合吸光值y＝lg CONCCONC標準濃度(ng/ml)Y對X作線性回歸，標準曲線如圖1。
回歸方程y＝-0.478x+1.628(R2＝0.9964)(注實驗條件變化時，斜率和截距會有變化)2)樣品濃度計算樣品讀數與標準作同樣處理，根據以上回歸方程計算樣品中ApoAI抗原濃度。
以下羅列了本發明與目前正在使用的ELISA法測定ApoAI的方法比較及其優勢分析。
1.雙抗夾心法雙抗夾心法以其靈敏度高(可達10-12g)(Anderson N，Chalatow KM，Castelli WP，Levy DL.(1987)Zentralbl Allg Pathol Pathol Anat 241-9.及Chiba H，Mitamura T，Matsuno K，and Kobayashi K，A sensitive sandwichenzyme-linked immunosorgent assay of rat apoliprotein A-1.Biochem MedMetabol Biol，1991；46380-390)而被廣泛使用，主要過程為抗體包板→加入待測液，待測抗原與包被抗體結合→加入第二種酶標抗體，形成夾心複合物→加入酶底物檢測此法要求使用兩種不同的抗體，成本較高。在測定如ApoAI這樣的小分子量蛋白時(28kD)，雙抗夾心法對兩種抗體抗原識別簇(epitope)的空間位置有較嚴格的要求，二者之間必須有足夠的空間距離，否則由於位阻效應無法得到結果。另外，雙抗夾心法線性範圍較小，一般不超過一個數量級。
2.直接競爭法直接競爭法簡單快速，應用也較廣泛，主要過程為抗原包板→待測液與標記抗體同時加入→板上包被抗原與待測液中游離抗原競爭標記抗體→平衡後，洗板除去未結合抗原→加入酶底物檢測此法使用的酶標抗體需根據不同抗原分別標記，製備成本高。此外，直接競爭法靈敏度不高，線性範圍一般也只有一個數量級(10-100ng)(Gaver A，Weedy NK，Maldonado BR et al，Procedure for developmet of an enzyme-linkedimmunosorbent assay.Development of an assay for human apolipoprotein AI.Clinica Chimica Acta，1992；20823-27及Galban B，Macri J and Adeli K，Anamplified enzyme-linked immunosorbent assay for rapid and sensitivedetermination of apolipoprotein AI in plasma and tissue culture media.Ann ClinBiochem，1993；30404-406)。
3.相比之下，本方法有如下優點(1)成本低。只使用一種一抗，且一抗不需標記；酶標二抗相對價格低廉，容易製備。大規模、高通量篩選時成本降低顯著。
(2)靈敏度高。本方法引入放射免疫法中的數學模型，改善了標準曲線低濃度區域的先行，靈敏度達3ng，最低可至1.5ng，比常規直接競爭法高3倍以上。
(3)線性範圍大。標準曲線從3ng到400ng都有很好的線性(R2＝0.996)，適於進行高通量藥物篩選等樣品濃度變化較大的工作。
ApoAI細胞靶標用於藥物篩選方法(1)取5×104HepG2細胞(ATCC公司)接種於48孔培養板中，每孔含0.5ml成分為10％胎牛血清，青黴素100U/ml，鏈黴素100μg/ml的MEM培液，於37℃，5％CO2細胞培養條件下培養24小時。
(2)加被篩選物質(不同來源的化合物或混合物溶於DMSO中)於細胞培養液內和細胞共同培養60小時。
(3)取50μl培養液測定ApoAI含量。測定方法見上述間接競爭ELISA法測定細胞培液中ApoAI濃度。
(4)中選化合物的選擇通過與40μg/ml Gemfibrozil培養後產生ApoAI量進行比較來達到。被篩化合物所激發ApoAI蛋白產生超過Gemfibrozil激發產生量的50％以上者則為中選化合物。
應用ApoAI細胞靶標ELISA篩藥系統篩選抗動脈粥樣硬化升HDL的藥物。
本發明的ApoAI細胞靶標ELISA篩藥系統可用於篩選單個或複合的合成化合物，可用於篩選植物提取的單個化合物或混合物及可用於篩選各種微生物代謝產物中的升高ApoAI的物質，最終用於篩選升HDL藥之目的。
下面結合具體實施例和附圖對本發明作進一步說明。
圖1是ApoAI標準曲線圖。
圖2是已知ApoAI激發劑Gemfibrozil激發HepG2細胞產生ApoAI蛋白圖。
圖3是已知ApoAI激發劑Finofibrate激發HepG2細胞產生ApoAI蛋白圖。
實施例1材料與試劑(1)Ultra Pure Human Apolipoprotein AI蛋白，(Cat #11P-UP108，AcademyBio-Medical Company，Inc.)(2)Goat anti-human ApoAI，(Cat.#11A-G2-2b，Academy Bio-MedicalCompany，Inc.)(3)Peroxidase-conjugated AffiniPure Rabbit Anti-Goat IgG(H+L)，(Cat.#305-035-003，Jackson ImmunoResearch)
(4)96-well Nunc-ImmunoTMPlates，MaxiSorpTM，(Cat.#439454，NalgeNunc International)(5)普通96孔板(6)鄰苯二胺(O-Phenylenedimine，OPD)(7)牛血清白蛋白(BSA)(8)抗體稀釋和封閉緩衝液10mM磷酸鹽緩衝液，含1％(w/v)BSA，pH7.4；(9)底物緩衝液0.1mol/L檸檬酸，0.2mol/LNa2HPO4，用前每100ml加入30％ H2O20.15ml，OPD 60mg。
(10)顯色終止液2mol/L H2SO4。
(11)自動洗板機Wellwash Ascent，Labsystem，Finland(12)酶標儀318-Microplate Reader，SANCO，Shanghai，China1)5×104HepG2細胞(ATCC公司)接種於48孔培養板中，每孔含0.5ml成分為10％胎牛血清，青黴素100U/ml，鏈黴素100μg/ml的MEM培液，於37℃，5％CO2細胞培養條件下培養24小時。
2)不同濃度的已知ApoAI激發劑Gemfibrozil和Fenofibrate溶於DMSO中，於細胞培養液內和細胞共同培養60小時。
3)取50μl培養液測定ApoAI含量。測定方法見上述間接競爭ELISA法測定細胞培液中ApoAI濃度。
4)測定結果見圖2和3。表1、ApoAI回收率表1
組1細胞培液組2樣品組1加入5μl 200ng/ml ApoAI純品
權利要求
1.一種酶聯免疫法(ELISA)，是間接競爭酶聯免疫法測定ApoAI待測抗原ApoAI與過量抗體混合孵育，反應平衡時抗體以抗原-抗體複合物及游離抗體兩種形式存在；將此平衡混合物加入預先經抗原包被的酶標板中，混合物中的游離抗體被板上的抗原捕獲，抗原-抗體複合物則經洗板除去；最後加入辣根過氧化物酶底物，經顯色反應檢測板上抗體的濃度，由此可推知待測抗原濃度，HrpAb2+Ab+Ag→HrpAb2-Ab-Ag+HrpAb2-Ab↓進板HrpAb2-Ab-Ag+HrpAb2-Ab-Ag-Plate↓洗板HrpAb2-Ab-Ag-Plate↓底物(OPD)酶標儀492nm檢測HrpAb2—辣根過氧化物酶標記二抗Ab —一抗Ag —抗原Plate —酶標板。
2.根據權利要求1的酶聯免疫法，具體方法如下1)抗原包板ApoAI稀釋至200ng/ml，加入酶標板中，每孔50μl，置溼盒中，包板條件為37℃ 2小時或4℃ 16小時，蒸餾水洗板，每孔加入封閉液100μl，室溫放置1小時以上，用前再洗板；2)孵育在普通96孔板中，混合一抗，二抗和待測培液或標準標準濃度配製ApoAI等比梯度稀釋；抗體稀釋一抗1∶50000，二抗1∶20000；空白孔100μl緩衝液；最大結合孔50μl抗體混合液，50μl緩衝液；標準/樣品孔每孔加入抗體混合液50μl，ApoAI標準或待測培液50μl；振蕩混勻，37℃ 2小時或4℃ 16小時孵育以上；3)抗體捕獲將96孔板中的孵育液轉移至包被好的酶標板中，室溫反應30分鐘，其間緩緩搖動；5)檢測以蒸餾水洗板，每孔加入100μl新配製的底物顯色液，避光放應30分鐘，加入25μl終止液終止反應，與酶標儀波長492nm處測定吸光值。
3.根據權利要求1的酶聯免疫法，其中檢測後按以下公式分析計算(1)標準曲線標準濃度讀數減去空白值後，按以下公式計算x=lnB/Bmax1-B/Bmax]]>B-標準濃度吸光值 Bmax-最大結合吸光值y＝lg CONCCONC 標準濃度(ng/ml)Y對X作線性回歸，回歸方程y＝-0.478x+1.628(R2＝0.9964)2)樣品濃度計算樣品讀數與標準作同樣處理，根據以上回歸方程計算樣品中ApoAI抗原濃度。
4.ApoAI細胞靶標ELISA篩藥系統篩選藥物的方法，(1)HepG2細胞接種培養，選擇以與ApoAI產生和代謝密切有關的細胞株HepG2為供篩選細胞株；(2)溶於DMSO中的被篩選物質加於細胞培養液內和細胞共同培養60小時；(3)取50μl培養液測定ApoAI含量。按權利要求1至3之一的方法測定細胞培液中ApoAI濃度；(4)被篩化合物所激發ApoAI蛋白產生超過Gemfibrozil激發產生量的50％以上者則為中選化合物。
5.根據權利要求4的方法，其中被篩物質為單個或複合的合成化合物，植物提取的單個化合物或混合物及各種微生物代謝產物中的升高ApoAI的物質。
6.根據權利要求4或5的方法篩選升HDL藥物的應用。
全文摘要
本發明公開了一種ApoAI ELISA間接測定法,該方法靈敏度高,測定濃度範圍大,操作簡單,便宜的ApoAI ELISA間接測定法。以該ApoAI ELISA測定法為主體,建立高通量升HDL藥篩藥系統。通過測定被篩選化合物激發細胞產生ApoAI蛋白的程度來篩選新一代升HDL抗動脈粥樣硬化藥。
文檔編號A61P9/10GK1366182SQ0110523
公開日2002年8月28日 申請日期2001年1月17日 優先權日2001年1月17日
發明者龔邦強 申請人:龔邦強