用於mRNA擴增的改進的裂解和逆轉錄的製作方法

2023-05-07 04:49:06 2

專利名稱：用於mRNA擴增的改進的裂解和逆轉錄的製作方法
技術領域：
本發明提供了通過進行RT-PCR而監測基因表達的新方法。更精確地，本發明公開 了在培養貼壁細胞的小瓶中裂解貼壁細胞，並且隨後在同一小瓶中將裂解物中包含的RNA 轉錄為單鏈cDNA的可能性。現有
背景技術：
群體中的細胞在很多方面的特徵是獨特的，甚至在看起來均質的培養物或組織中也是 如此。基因表達水平顯示很大的細胞與細胞之間的變異，這是由於各種因素的外部(外在) 和內部(內在)來源。同樣，當暴露於相同刺激時，細胞通常隨機表現。這表示獲自細胞群的 數據不能假定反映單個細胞的行為。已經提示細胞可以通過轉錄活性爆發反應於刺激並作 為二元轉換而運轉；這是以全或無的方式。通常，通過多步程序，在常規基礎上監測RNA水平上的基因表達。首先，從培養容 器取出各自的細胞樣品。在貼壁細胞的情況下，可以通過胰蛋白酶消化(用胰蛋白酶-EDTA 溶液處理)支持收穫，從而使貼壁細胞從固相支持體脫離。其次，沉澱收集的細胞，並且進 行細胞裂解。作為第三步，通常需要至少部分純化存在於樣品中的RNA或mRNA(EP 0 389 063)。此後，用 RNA 依賴性 DNA 聚合酶如 AMV(Roche Applied Science 目錄號 11 495 062) 或MMuLV (Roche 11 062 603)逆轉錄酶進行第一鏈cDNA合成步驟。隨後，通過定量 PCR(Sagner, G. , and Goldstein, C. , BIOCHEMICA 3 (2001) 15-17)，或者，通過擴增和隨後雜交到DNA微陣列上(Kawasaki, Ε. S.，Ann. N. Y. Acad. Sci. 1020 (2004) 92-100)，對產生的cDNA的量進行定量。在PCR的情況下，可以進行一 步RT-PCR，特徵在於通過相同的聚合酶如T. th聚合酶(Roche Applied Science目錄號11 480 014)催化第一鏈cDNA合成和隨後的擴增。在傳統的實時RT-PCR或qRT-PCR中，首先在耗時的程序中從細胞分離RNA，這會導 致材料的損失。使用CellsDirect cDNA合成系統(Invitrogen目錄號11737-030)，在單 個試管中以最少的操作裂解細胞並且從裂解物產生cDNA並且沒有樣品損失。在第一鏈合 成前加入DNA酶I，以消除基因組DNA。合成後，第一鏈cDNA可以直接轉移到qPCR反應中 而沒有中間有機萃取或乙醇沉澱。針對從10，000個細胞低至單個細胞的小的細胞樣品優 化了該試劑盒。相似的流程公開於(W0 08/135197)。在上下文中，本發明的根本技術問題是提供高通量方法和試劑盒，其允許進一步 簡化的基因表達監測分析流程。簡沭
因此，本發明涉及進行用於擴增靶RNA的RT-PCR的方法，該方法包括以下步驟
a)在細胞培養容器中培養貼壁細胞群，
b)在所述樣品容器中用包含0.05M-I M離液劑的裂解緩衝液裂解推測含有所述靶 RNA的所述貼壁細胞群，
c)在所述樣品容器中加入進行逆轉錄反應所必需的試劑，使得所述離液劑在所述樣品 容器中以約10-60 mM的濃度存在，並且將所述靶RNA逆轉錄為第一鏈cDNA，d)通過進行多個循環的熱循環流程，擴增所述第一鏈cDNA。在一個主要的實施方案中，實時監測擴增步驟。優選地，離液劑是硫氰酸胍。同樣優選地，裂解緩衝液包含約0. 2-0. 5 M的離液劑。在本發明方法的步驟c)中，離液劑以約30-50 mM，優選約40 mM的濃度存在。同樣優選地，該新方法的步驟b)在非離子型去汙劑的存在下進行，所述去汙劑例 如可以是NP40。在步驟c)中，所述非離子型去汙劑具有0. 1-2%的V/V。同樣優選地，步驟a)包含加入碳水化合物，其可以是糖或葡聚糖。在一個特定實施方案中，在步驟b)和C)之間或在步驟c中加入DNA酶。優選地， 所述DNA酶主要是雙鏈特異性DNA酶，並且優選是DNA酶I或蝦核酸酶(Shrimp Nuclease)。在另一特定實施方案中(其不與上文公開的實施方案互相排他)，在步驟b)中或在 步驟c)之前加入蛋白酶K。第二方面，本發明也提供了試劑盒，其包含
-用於培養至少一個細胞樣品的一次性容器(disposable)， -裂解緩衝液，和
-包含逆轉錄酶活性的DNA聚合酶。此外，所述試劑盒可進一步包含至少一種另外的組分，所述組分選自非離子型去 汙劑、碳水化合物、DNA酶和蛋白酶。附圖簡述
所有圖包括代表qPCR擴增曲線的上圖和代表解鏈曲線分析的下圖。存在於更左側 位置的擴增曲線對應於重複測量值，而更右側的擴增曲線對應於未加入Transscriptor酶 的對照。右側的解鏈峰對應於重複樣品的特定擴增產物，而更左側的解鏈峰對應於不含 Transcriptor酶的對照中的引物二聚體形成。

圖1如實施例1所具體描述的本發明的小鼠星形膠質細胞中ACTB表達的qPCR和 解鏈曲線分析(1:1樣品稀釋)
圖2如實施例1所具體描述的本發明的小鼠星形膠質細胞中ACTB表達的qPCR和解鏈 曲線分析(1:4樣品稀釋)
圖3如實施例1所具體描述的本發明的小鼠星形膠質細胞中TUBB5表達的qPCR和解 鏈曲線分析(1:1稀釋)
圖4如實施例1所具體描述的本發明的HeLA細胞中ACTB表達的qPCR和解鏈曲線分 析(1:1稀釋) 詳述
根據本發明，可以在特定培養容器中進行貼壁真核細胞或甚至原核細胞的裂解，並且 在同一培養容器中進行逆轉錄反應，從而製備單鏈cDNA。因此，本發明更精確地涉及進行用於擴增靶RNA的RT-PCR的方法，該方法包括以 下步驟
a)在細胞培養容器中培養貼壁細胞群，
b)在所述樣品容器中用包含0.05M-I M離液劑的裂解緩衝液裂解推測含有所述靶 RNA的所述貼壁細胞群，c)在所述樣品容器中加入進行逆轉錄反應所必需的試劑，使得所述離液劑在所述樣品 容器中以約10-60 mM的濃度存在，並且將所述靶RNA逆轉錄為第一鏈cDNA，
d)通過進行多個循環的熱循環流程，擴增所述第一鏈cDNA。因此，細胞培養、裂解和逆轉錄反應，S卩，步驟a) - c)，都在同一容器中進行。因 此，並且與大多數現有技術的方法相反，在進行逆轉錄反應前不需要純化裂解物。也就是 說，步驟c)緊接著步驟b)，無需任何中間的純化步驟。步驟a)，S卩，在細胞培養容器中培養貼壁細胞群，定義為在確定的時間段中使所 述貼壁細胞群在合適的培養條件下生長，使得細胞具有分裂可能性並且活細胞的總數增加 到至少2倍的步驟。此外，重要的是注意本領域使用的流程需要胰蛋白酶消化步驟，這表示為了使貼 壁細胞從固相支持體分離，用含有可商購的胰蛋白酶-EDTA (例如^witrogen目錄號 25200 056，Genaxxon目錄號4260. 0500)的合適緩衝液溫育細胞培養物。相反，本發明 不需要通過胰蛋白酶使細胞從固相支持體分離，因為細胞直接在原位裂解。根據步驟d)的擴增通常以使用特異性擴增引物對的PCR反應的形式進行，所述引 物對設計為允許檢測特異性cDNA種類。本發明的方法可以用於多種不同的定性和定量應用。原則上，任何類型的RNA都 可以被轉錄和擴增。最重要地，本發明的方法適用於以定性和定量方式擴增和檢測mRNA。 因此，本發明特別適用於監測基因表達。為了控制收穫、細胞裂解和逆轉錄的過程，可以將對照RNA摻入樣品。對照RNA優 選是人工RNA，其在逆轉錄步驟中轉錄為能夠與樣品中的RNA區分開的cDNA。在使用用於 逆轉錄步驟的特異性引物的情況下，人工RNA可以來源於基因工程DNA模板的體外轉錄，所 述模板包含插入，或僅部分代表應該要分析的靶序列。生物樣品優選由貼壁真核細胞組成，S卩，通過附著於作為培養容器的部分的固相 支持體而培養所述細胞並使其生長。對於本發明的方法，可以使用任何類型的培養容器。實 例(但是其不限制本發明的範圍)是培養皿和培養瓶，其具有適於作為用於貼壁細胞生長的 固相支持體的內表面。這些類型的培養瓶使得能夠大量製備特定類型的cDNA。其它實例是6孔、M孔、96孔、384孔或1536孔形式的微量滴定板，因為它們是本 領域常用的。在本發明的方法在所述微量滴定板中進行的情況下，可以平行培養、裂解和逆 轉錄多個樣品。更精確地，在同一反應容器中進行細胞培養、細胞裂解、稀釋、任何添加劑的 加入和逆轉錄酶反應。因此，本發明的方法對於自動化過程中多個貼壁細胞樣品的高通量 分析特別有用。如果反應容器根據本領域建立的標準以M、96、384或1536孔微量滴定板 的形式排列在一起，可以通過液體操作自動儀器將裂解試劑、各種添加劑和進行逆轉錄酶 反應所必需的試劑加入樣品中。因此，在一個特定方面，本發明涉及進行用於平行擴增至少一個靶RNA的多個 RT-PCR反應的方法，該方法包括以下步驟
a)在微量滴定板的分開的孔中培養多個貼壁細胞群，
b)在所述微量滴定板的所述孔中用包含0.05 M-I M離液劑的裂解緩衝液裂解推測含 有所述靶RNA的所述多個貼壁細胞群，從而產生多個樣品，
c)在所述孔中的所述多個樣品中的每個樣品中加入進行逆轉錄反應所必需的所有試劑，使得所述離液劑在所述微量滴定板的所述孔中以約10-60 mM的濃度存在，並且將存在 於每個樣品中的所述靶RNA逆轉錄為第一鏈cDNA，
d)通過進行多個循環的熱循環流程，擴增每個樣品中包含的所述第一鏈cDNA。在本發明的範圍內，優選可以平行處理6、M、96、384或甚至1536個群體。同樣，根 據步驟d)的擴增通常以使用特異性擴增引物對的PCR反應的形式進行，設計所述引物對， 使得能夠檢測特異性cDNA種類。在一個實施方案中，所述大量的多個孔可以含有源自不同 細胞系或相同細胞系的不同細胞群，所述細胞群已經在不同條件下進行了預處理。在這種 情況下，用相同的擴增引物對進行多個PCR擴增，從而研究不同條件下特定基因的表達。或者，大部分孔可以含有源自相同來源的相同類型的細胞群。在這種情況下，可以 選擇多個不同的擴增引物對，從而平行研究很多個不同基因的表達。但是，本領域技術人員 可以理解，公開的這兩種方法都不是互相排他的，並且，依賴於要分析的科學問題，本領域 技術人員能夠用合適數目的不同細胞類型和合適數目的不同PCR引物對設計陣列設置，從 而實現各個微量滴定板中存在的全部數目的孔的最佳使用。此外，甚至可以通過多路PCR改進所述平行分析的潛能，所述多路PCR的特徵在於 用於擴增不同cDNA種類的多個引物對被用於相同的樣品。特別是，這樣的設置對於相對 RT-PCR定量實驗是有利的，所述相對RT-PCR定量實驗特徵在於特定基因的表達相對於所 謂的管家基因(其以相同水平組成型表達)的表達進行監測。所述管家基因的突出實例是 PBDG, GAPDH 和 ACTB 以及 18S 和 26S RNA 基因。根據本發明，通過直接加入裂解緩衝液實現貼壁細胞的裂解，而細胞仍然附著於 固相支持體表面。這僅僅在裂解緩衝液包含離液劑時是可能的。根據本領域通常的理解， 離液劑是破壞大分子如蛋白、DNA或RNA中的三維結構並使其變性的物質。離液劑幹擾由 非共價力，如氫鍵、範德華力和疏水作用介導的分子內相互作用的穩定化。離液劑包括但不 限於脲、一些鋰鹽如高氯酸鋰和胍鹽，如氯化胍。在本發明的上下文中，特別優選的試劑是 硫氰酸胍。為了能夠直接在裂解物內進行逆轉錄酶反應而不採用任何中間純化步驟，需要僅 僅使用有限量的所述離液劑來裂解細胞樣品，使得在步驟b)中，逆轉錄酶的活性不會受到 可察覺的影響。因此，在步驟b )中加入的裂解緩衝液優選包含約0.2 - 0.5 M的離液劑。 此外，在步驟c)開始時加入另外的試劑後，離液劑以約30 - 50 mM，優選約40 mM的濃度存在。在一個實施方案中，本發明的步驟b)在非離子型去汙劑如NP40的存在下進行。或 者，如果需要處理僅具有小體積的樣品，步驟b)包括加入PCR相容的溼潤劑，其導致有效避 免蒸發效應。優選地，在本發明的上下文中，碳水化合物如糖或葡聚糖可以用作溼潤劑。如 果加入了 NP40或另一種非離子型去汙劑，則應該選擇去汙劑的量，選擇的方式使得在步驟 c)中，所述去汙劑以0. 1 - 2%的V/V量存在。可以在多種溫度下進行根據本發明的細胞收穫和裂解。本發明方法的步驟b)通 常進行至少5分鐘，即，在16°C 進行。在這些情況下裂解所需的最長時間是大約30 分鐘。類似地，甚至是在低於環境溫度但高於5°C的溫度下，步驟b)可以進行至少10分鐘。 在這些情況下裂解所需的最長時間是大約60分鐘。如果處理非常小體積的樣品，這些條件 對於避免任何蒸發效應是非常有利的。它也消除了對加熱的需要。
但是，為了加速和改進培養的貼壁細胞的裂解，裂解緩衝液可以補充蛋白酶K。在 這種情況下，在濃度為約0.05 - 5 mg/ml，優選0. 1-1 mg/ml的蛋白酶K的存在下，在約 550C - 85°C的溫度下，步驟b)進行至少5分鐘。任選地，可以通過隨後在約80°C - 90°C 的溫度下，在步驟b)和步驟c)之間或步驟c)和步驟d)之間溫育至少5分鐘，通常不超過 30分鐘，將所述蛋白酶K不可逆地滅活。根據本發明，在同一反應容器中進行細胞裂解和逆轉錄，已經證明了如果裂解的 細胞中含有的基因組DNA可以被選擇性除去同時細胞RNA保持完整，則這是高度有利的。實 現這種效果的最有效的可能性是通過引入DNA酶消化步驟而酶促除去。因此，在本發明的 一個主要實施方案中，在雙鏈特異性DNA酶存在下進行步驟b)。優選地，這樣的DNA酶是專 門的雙鏈特異性DNA如DNA酶I (Roche Applied Science目錄號04 716 728)或蝦DNA 酶(US 6，541, 204)，其濃度為每50 μ 反應物約0. 1單位(USB，目錄號73814)。但是， 由於在步驟d)中單鏈cDNA進一步進行DNA聚合酶催化的擴增反應，如PCR反應，在擴增反 應前滅活所述DNA酶是高度有利的。因此，為了滅活DNA酶活性，在特定實施方案中，在約 80°C-90°的溫度下，在步驟b)和步驟c)之間或步驟c)和步驟d)之間，將樣品溫育至少 5分鐘，但不超過60分鐘。或者，如果DNA酶是蝦DNA酶，在步驟d)中PCR反應的第一個循 環中的變性通常是足夠的。對於第一鏈cDNA合成，使用具有反義序列的引物。這些引物是特異性引物，即結 合mRNA的聚腺苷酸尾的寡-dT引物，或隨機引物，如隨機六聚體引物。對於後續PCR，將有 義方向的序列特異性引物用作正向引物。反向引物是可以與第一鏈cDNA合成反應中使用 的特異性引物相同的特異性引物。或者，反向引物與位於已經用於逆轉錄酶反應的引物的 結合側上遊的序列雜交。本發明可適用於進行序列的一步RT-PCR，所述序列可行地具有最多5 kb的任何 擴增子大小。本發明特別可用於進行2步RT 0 ，8卩，在第一反應中，將1 嫩逆轉錄為單鏈(^嫩。 可以用於該步驟的RNA依賴性DNA聚合酶的實例是AMV逆轉錄酶(Roche Applied Science 目錄號 11 495 062) ,MMuLV 逆轉錄酶(Roche Applied Science 目錄號 Oil 062 603)和 重組 iTranscriptor 逆轉錄酶(Roche Applied Science 目錄號 03 531 317)。隨後，加入 通過PCR擴增所產生的單鏈cDNA所需的所有試劑，例如耐熱DNA依賴性DNA聚合酶以及靶 特異性正向和反向擴增引物。本發明的方法也可以用於進行1步PCR，特徵在於在逆轉錄之前，在步驟C) 中加入RT-PCR必需的所有試劑和酶。例如，生氫氧化碳嗜熱菌(Carboxydothermus hydrogenoformans)的 DNA 聚合酶能夠進行 1 步 PCR(Roche Applied Science 目錄號 12016338001)。或者，用酶混合物進行本發明的一步RT-PCR方法，所述酶混合物包含能夠 進行PCR反應的DNA模板依賴性的耐熱DNA聚合酶和能夠進行一步RT-PCR反應的逆轉錄 酶步驟的RNA模板依賴性的DNA聚合酶，如AMV逆轉錄酶。但是，通常，用於培養貼壁細胞的大多數細胞培養容器的材料不是耐熱的，並且各 自的小瓶不能適合熱循環儀。因此，對於1步RT-PCR方案，在逆轉錄步驟後，將產生的第一 鏈cDNA的樣品從培養容器轉移到可以與熱循環儀設備結合使用的反應容器中，而不需要 中間加入另外的試劑。然而，如果用於培養所述貼壁細胞的細胞培養容器的材料是耐熱的，則步驟d)也可以在所述容器中進行。特別是，如果細胞培養容器是以微量滴定板形式安排， 則所述微量滴定板可以直接轉移到配置用於取走所述板的熱循環儀設備中。在一個主要實施方案中，實時監測擴增步驟。所述實時監測的特徵在於所述一步 RT-PCR反應的過程是實時監測的。不同的檢測形式是本領域已知的。已經證明了下面提到 的檢測形式對於RT - PCR有用，因此提供了基因表達分析的容易和直接的可能性。a) TaqMan水解探針形式
用兩種組分標記單鏈雜交探針。當用合適波長的光激發第一組分時，根據螢光共振能 量轉移的原理，將吸收的能量轉移到第二組分，即所謂的猝滅劑。在PCR反應的退火步驟 中，雜交探針與靶DNA結合，並且在隨後的延伸階段中通過Taq聚合酶的5』_3』核酸外切酶 活性降解。結果，激發的螢光組分和猝滅劑在空間上彼此分開，因此可以測量第一組分的熒 光發射。TaqMan探針測定詳細公開於US 5, 210, 015, US 5，538，848和US 5，487，972中。 TaqMan雜交探針和試劑混合物公開於US 5，804, 375中。b)分子信標
這些雜交探針也用第一組分和猝滅劑標記，標記優選位於探針的兩端。由於探針的二 級結構，兩種組分在溶液中空間上鄰近。在與靶核酸雜交後，兩種組分彼此分開，使得在用 合適波長的光激發後，可以測量第一組分的螢光發射(US 5，118，801)。c) FRET 雜交探針
FRET雜交探針測試形式對於所有類型的均相雜交測定特別有用(Matthews，J. Α., and Kricka, L. J.，Analytical Biochemistry 169 (1988) 1-25)。其特徵在於同時使用 並且與擴增的靶核酸的同一鏈的相鄰位點互補的兩個單鏈雜交探針。用不同的螢光組分標 記這兩個探針。當用合適波長的光激發時，根據螢光共振能量轉移的原理，第一組分將吸收 的能量轉移到第二組分，使得當這兩個雜交探針與要檢測的靶分子的相鄰位置結合時能夠 測量第二組分的螢光發射。作為監測FRET受體組分的螢光增加的替代，也可以監測作為雜 交事件的定量測量值的FRET供體組分的螢光減少。特別是，FRET雜交探針形式可以用於實時PCR中，從而檢測擴增的靶DNA。實時 PCR領域已知的所有檢測形式中，已經證明了 FRET-雜交探針形式是高度靈敏、準確和可靠 的(W0 97/46707; WO 97/46712; WO 97/46714)。作為使用兩個FRET雜交探針的替代， 也可以使用螢光標記的引物和僅僅一個標記的寡核苷酸探針(Bernard，P. S., et al., Analytical Biochemistry 255 (1998) 101-107)。在這一點上，它可以任意選擇，無論引 物是用FRET供體還是用FRET受體化合物標記。d) SybrGreen 形式
在用雙鏈核酸結合部分檢測擴增產物的情況下，如果在本發明的添加劑存在下進行實 時PCR，這也在本發明的範圍內。例如，也可以通過螢光DNA結合染料根據本發明檢測各自 的擴增產物，所述染料在用合適波長的光激發後一旦與雙鏈核酸相互作用就發射相應的熒 光信號。已經證明染料SybrGreenI和SybrGold (Molecular Probes)特別適於本申請。可 以替代地使用嵌入染料。但是，對於這種形式，為了區分不同的擴增產物，必須進行各自的 解鏈曲線分析(US 6，174,670)。根據本發明的試劑念
另一方面，本發明也提供了試劑盒，其包含(i)用於培養至少一個細胞樣品的一次性容器，
( )裂解緩衝液，和
(iii)包含逆轉錄酶活性的DNA聚合酶。一次性容器(i)可以是適於培養至少一個細胞群的任何類型的一次性容器。優選 地，所述一次性容器是優選具有6孔、M孔、96孔、384孔或1535孔的微量滴定板。在特定 實施方案中，所述一次性容器是耐熱的，並且與熱循環儀設備相容。裂解緩衝液(ii)是包含0. 05 M-IM離液劑的緩衝液。試劑本身優選是硫氰酸胍。 任選地，試劑盒可以包含蛋白酶K，其以約0.05 - 5 mg/ml，優選0. 1-1 mg/ml的濃度存在 於在裂解緩衝液中，或作為具有至少5倍的原液濃度的單獨的試劑。同樣任選地，試劑盒可 以包含葡聚糖或非離子型去汙劑(其優選是NP)，其以0.1 - 2 %的V/V量存在於裂解緩衝 液中，或以至少5倍的原液濃度存在於分開的小瓶中。同樣任選地，試劑盒可以主要含有雙 鏈特異性DNA酶，例如DNA酶I或蝦核酸酶，其存在於分開的小瓶中，濃度是至少0. 02個單 位。逆轉錄酶(iii)是專門的RNA依賴性DNA聚合酶，如AMV逆轉錄酶(Roche Applied Science 目錄號 11 495 062)、MMuLV 逆轉錄酶(Roche Applied Science 目錄號 Oil 062 603)和重組 Transcriptor 逆轉錄酶(Roche Applied Science 目錄號 03 531 317)。組分 (iii)也可以是1步RT PCR酶，例如，生氫氧化碳嗜熱菌的DNA聚合酶，或逆轉錄酶和耐熱 DNA依賴性DNA聚合酶的混合物。本發明的試劑盒可以包含緩衝液、第一鏈cDNA合成所需的脫氧核苷三磷酸，以及 各自的引物，如寡-dT引物、隨機六聚體引物，或甚至特異性引物。與聚合酶一起，這些試劑 中的一種、幾種或全部，可以組合到一個小瓶中，作為各自的主混合物。此外，本發明的這樣的試劑盒可以包含耐熱DNA聚合酶，如Taq聚合酶，和進行擴 增反應所必需的所有其他試劑，包括但不限於緩衝試劑、另外的脫氧核苷三磷酸，以及序列 特異性擴增引物。此外，試劑盒可以包含在雜交qPCR過程中檢測擴增子所必需的試劑，例 如至少一個螢光標記的雜交探針或雙鏈螢光染料。
實施例實施例1
以每個小瓶大約1000或250個細胞，將小鼠星形膠質細胞以兩種不同的濃度(1:1， 1:4)接種到384孔細胞培養板中。約96小時後，除去培養基，用冷PBS洗滌細胞。加入2μ1 裂解緩衝液，將細胞在室溫下溫育10分鐘。裂解緩衝液的組成如下 0. 2Μ硫氰酸胍 10 ng/ul聚肌苷酸
加入 Transcriptor RT 試劑(Roche Applied Science 目錄號 03 531 317)到終 RT 體 積為20μ1。在無RT對照中，從RT混合物省略了逆轉錄酶。根據以下熱循環流程，溫育含 RT反應的細胞培養板 25°C下10分鐘 55°C下30分鐘 85 °C下5分鐘在冰上冷卻
隨後，在無核酸酶的水中將cDNA稀釋到50μ1。用LightCycler 480 SYBR Green I Master 預混合物(Roche Applied Science 目錄號 04 707 516)和適於擴增 ACTB 和 18S rRNA的弓丨物(TATAA Biocenter,內源對照基因系列(endogenous control gene panel)) 在 10μ1 PCR 中分析 2μ1 cDNA。在 LightCycler 480 實時 PCR 儀(Roche Applied Science 目錄號05 015 278)上對ACTB和18S rRNA基因的表達進行定量，並且根據製造商的說明 書測定Ct值。低Ct值對應高度表達。
表1:獲自1:1稀釋的Ct值
權利要求
1.進行用於擴增靶RNA的RT-PCR的方法，該方法包括以下步驟a)在細胞培養容器中培養貼壁細胞群，b)在所述樣品容器中用包含0.05M-I M離液劑的裂解緩衝液裂解推測含有所述靶 RNA的所述貼壁細胞群，c)在所述樣品容器中加入進行逆轉錄反應所必需的試劑，使得所述離液劑在所述樣品 容器中以約10-60 mM的濃度存在，並且將所述靶RNA逆轉錄為第一鏈cDNA，d)通過進行多個循環的熱循環流程，擴增所述第一鏈cDNA。
2.權利要求1的方法，其中實時監測擴增步驟。
3.權利要求1-2的方法，其中所述離液劑是硫氰酸胍。
4.權利要求1-4的方法，其中所述裂解緩衝液包含約0.2-0. 5M的離液劑。
5.權利要求1-4的方法，其中步驟b)在非離子型去汙劑的存在下進行，所述去汙劑優 選是NP40，並且其中在步驟c)中，所述非離子型去汙劑具有0. 1-2 %&V/V。
6.權利要求1-5的方法，其中在步驟b)和c)之間加入DNA酶。
7.權利要求1-6的方法，其中在步驟b)中或在步驟c)之前加入蛋白酶K。
8.試劑盒，其包含-用於培養至少一個細胞樣品的一次性容器， -裂解緩衝液，其任選包含離液劑 -包含逆轉錄酶活性的DNA聚合酶。
9.權利要求8的試劑盒，進一步包含至少一種另外的組分，所述組分選自非離子型去 汙劑、碳水化合物、DNA酶和蛋白酶。
全文摘要
本發明涉及進行用於擴增靶RNA的RT-PCR的方法，該方法包括以下步驟(i)在細胞培養容器中培養貼壁細胞群，(ii)在所述樣品容器中用包含0.05M-1M離液劑的裂解緩衝液裂解推測含有所述靶RNA的所述貼壁細胞群，(iii)在所述樣品容器中加入進行逆轉錄反應所必需的試劑，使得所述離液劑在所述樣品容器中以約10-60mM的濃度存在，並且逆轉錄所述靶RNA，和(iv)通過使所述樣品進行多個循環的熱循環流程，擴增所述第一鏈cDNA。
文檔編號C12Q1/68GK102112631SQ200980130405
公開日2011年6月29日 申請日期2009年7月30日 優先權日2008年8月1日
發明者L.斯特雷姆博姆, M.庫比斯塔, N.佐裡克 申請人:塔塔生物中心有限公司, 霍夫曼-拉羅奇有限公司