不含葉綠醇的葉綠素衍生物的檢測分析法的製作方法

2023-05-07 17:16:01 2

專利名稱：不含葉綠醇的葉綠素衍生物的檢測分析法的製作方法
技術領域：
本發明涉及檢測樣品中的葉綠素衍生物的方法。該方法可用在測定樣品中葉綠素酶或相關酶的活性的檢測分析法。
背景技術：
葉綠素是在整個植物界廣泛存在的一種綠色色素。葉綠素是光合作用所必需的，並且是地球上發現的最豐富的有機金屬化合物之一。因而許多來自植物的產品(包括食物和飼料)含有相當多的葉綠素。在植物中，葉綠素酶(chlorophyllase或chlase)被認為參與葉綠素降解，並催化葉綠素中酯鍵的水解而生成脫植基葉綠素和葉綠醇。作為另外一種選擇,可通過從卟啉(二 氫卟酚)環失去鎂離子使葉綠素發生降解，形成名為脫鎂葉綠素的衍生物(參見圖5)。在某些條件下，一些葉綠素酶還能水解脫鎂葉綠素，產生脫鎂葉綠酸和葉綠醇。脫鎂葉綠酸也可通過從脫植基葉綠素(即葉綠素水解之後)失去鎂離子而產生(參見圖5)。脫鎂葉綠素可進一步降解為焦脫鎂葉綠素。一種可能的機制是脫鎂葉綠素碳環上甲酯鍵的酶水解，然後不穩定中間體向焦脫鎂葉綠素的非酶轉化。據報導，來自藜(Chenopodium album)的名為脫鎂葉綠酸酶的28_29kDa酶能夠催化脫鎂葉綠酸上類似的反應，產生不含葉綠醇的焦脫鎂葉綠素衍生物，稱為焦脫鎂葉綠酸(參見圖5)。焦脫鎂葉綠素也可由某些酶水解，形成焦脫鎂葉綠酸和葉綠醇。已開發出多種檢測分析法來測定樣品中的葉綠素酶活性(參見例如Khamessanet al. (1994), Journal of Chemical Technology&Biotechnology,Vol.60 (I), pages 73-81 (Khamessan等人,1994年，《化學技術與生物技術雜誌》，第60卷第I期第73-81頁))。測定葉綠素酶活性的最廣泛使用的方法由Klein和Vishniac在J. Biol.Chem. 1961236:2544-2547 (《生物化學雜誌》，1961年，第236卷第2544-2547頁)中進行了描述。該方法涉及在含丙酮的水性緩衝體系中測定酶活性。加入丙酮是為了確保底物(葉綠素)的溶解。酶反應發生後，將殘餘的底物萃取到己烷中。反應產物脫植基葉綠素由於失去了葉綠醇鏈，其親水性比葉綠素更高。因此，脫植基葉綠素仍留在水/丙酮相中，然後便可通過分光光度計測量法進行定量。雖然已對此方法的多種改良方案進行了描述，但所有已公布的方法均涉及反應產物的己烷分提步驟。此步驟是必需的，因為使用光譜技術難以區分葉綠素和脫植基葉綠素。己烷萃取後，底物和反應產物將處於不同的相中，因此對任一者的測量均可用於測定酶的活性。然而，己烷分提過程費力又麻煩，並不非常適合用於葉綠素酶活性的高通量篩選(HTS)方法。Arkus 等人在 Analytical Biochemistry 353 (2006) 93 - 98(《分析生物化學》，2006年，第353卷第93 - 98頁)中報導了嘗試克服在葉綠素酶的高通量篩選中己烷萃取方面的問題。此檢測分析法不再使用葉綠素作為底物，而是採用對硝基苯酯作為葉綠素酶高通量篩選中的人工底物。遺憾的是，此方法並不是很可靠，因為某些葉綠素酶雖然對葉綠素的活性很高，但是對於對硝基苯酯的活性相當低，可能會產生假陰性結果。此外，微生物葉綠素酶往往與其他酯酶共同表達，這些酶可作用於對硝基苯酯但不會作用於葉綠素，因此會得到假陽性結果。因而，仍需要葉綠素酶和相關酶的改進檢測分析法。具體地講，需要一種避免溶劑萃取的不足而又可靠、準確並適於高通量篩選的方法。

發明內容
因此，本發明提供檢測樣品中不含葉綠醇的葉綠素衍生物的方法，該方法包括檢測與不含葉綠醇的葉綠素衍生物相關的螢光信號的步驟，其中與葉綠素或含葉綠醇的葉綠素衍生物相關的螢光信號被猝滅。在一個實施例中，與葉綠素或含葉綠醇的葉綠素衍生物相關的螢光信號通過葉綠素或含葉綠醇的葉綠素衍生物的二聚化而猝滅。優選地，在檢測步驟中所用的條件下，葉綠素或含葉綠醇的葉綠素衍生物比不含葉綠醇的葉綠素衍生物優先二聚化。 在一個實施例中，不含葉綠醇的葉綠素衍生物包括脫植基葉綠素、脫鎂葉綠酸或焦脫鎂葉綠酸。在一個實施例中，葉綠素或含葉綠醇的葉綠素衍生物包括葉綠素、脫鎂葉綠素或焦脫鎂葉綠素。可在含表面活性劑、醇和鹼的檢測溶液中執行檢測步驟。優選地，該醇包括異丙醇，更優選地為12至20重量％的醇。在一個實施例中，該表面活性劑的含量按檢測溶液的總重量計為O. 01至O. 03重量％，優選地包括4-(1，1,3, 3-四甲基丁基)苯基-聚乙二醇。在一個實施例中，該檢測步驟在20至25°C並優選地在大於10. O的pH值下進行。可在例如約670nm處檢測突光信號。在一個實施例中，葉綠素或含葉綠醇的葉綠素衍生物以二聚體和/或其他非膠態多聚體的水溶液形式存在。在一個實施例中，該檢測步驟在不存在脂質體的情況下進行。在一個實施例中，表面活性劑包括4- (1，1，3，3-四甲基丁基)苯基-聚乙二醇，醇包括異丙醇，而鹼包括氫氧化鈉。在另一方面，本發明提供定量樣品中的酶活性的檢測分析方法，其中該酶能夠水解葉綠素或含葉綠醇的葉綠素衍生物，該檢測分析方法包括a)將樣品與葉綠素或含葉綠醇的葉綠素衍生物接觸；和b)通過上述方法檢測不含葉綠醇的葉綠素衍生物的產生情況。在一個實施例中，步驟(a)包括將樣品與葉綠素或含葉綠醇的葉綠素衍生物在含有表面活性劑、丙酮和/或緩衝液的反應溶液中進行溫育。優選地，在步驟(a)之後並在步驟(b)之前，將反應溶液加到如上所定義的檢測溶液中以終止酶活性。在一個實施例中，該酶在步驟(a)中具有活性，而在步驟(b)中無活性。在另一個方面，本發明提供用於定量樣品中的酶活性的試劑盒，其中該酶能夠水解葉綠素或含葉綠醇的葉綠素衍生物，該試劑盒包含a)反應溶液，該酶在其中具有活性；b)底物，其包含葉綠素或含葉綠醇的葉綠素衍生物；以及c)檢測溶液,該底物在其中比該酶產生的不含葉綠醇的葉綠素衍生物優先發生二聚化。在一個實施例中，該反應溶液包含表面活性劑、丙酮和緩衝液。優選地，該底物包括葉綠素、脫鎂葉綠素或焦脫鎂葉綠素。該檢測溶液可為如上所述的檢測溶液。優選地，該酶在該檢測溶液中無活性。在一個實施例中，試劑盒還包含一種或多種標準溶液，每種標準溶液均包含已知濃度的不含葉綠醇的葉綠素衍生物。


圖I示出了由兩個脫鎂葉綠素分子形成二聚體的過程。二聚化通過卟啉(二氫卟酚)環發生，並導致670nm處的螢光猝滅。圖2示出了相對螢光(RFU)與焦脫鎂葉綠酸濃度(PM)的標準(校準)曲線。圖3示出了相對螢光(RFU)與脫鎂葉綠酸濃度(PM)的標準(校準)曲線。圖4示出了脫鎂葉綠素在脫鎂葉綠素酶的催化作用下水解生成脫鎂葉綠酸和葉
綠醇。圖5示出了涉及葉綠素和衍生物的反應以及可通過本發明進行檢測的酶活性。
具體實施例方式在一個方面，本發明涉及檢測樣品中不含葉綠醇的葉綠素衍生物的方法。通過猝滅樣品中衍生自葉綠素或含葉綠醇的葉綠素衍生物的螢光信號，可直接檢測不含葉綠醇的葉綠素衍生物。該方法可用於定量，即，可使用該方法來測定樣品中不含葉綠醇的葉綠素衍生物的水平或濃度。因此，該方法尤其可用於測定樣品中葉綠素酶或相關酶的活性，因為它無需進行物理分離便可將產物與底物區分開(即，無需對底物和產物進行己烷萃取或其他溶劑分提)。葉綠素和葉綠素衍牛物所謂「含葉綠醇的葉綠素衍生物」通常是指包含卟啉(二氫卟酚)環和葉綠醇基團(尾)的化合物，包括不含鎂含葉綠醇的衍生物，諸如脫鎂葉綠素和焦脫鎂葉綠素。葉綠素和含葉綠醇的葉綠素衍生物的顏色通常為綠色,這是因為有卟啉(二氫卟酹)環存在於分子中。優選地，葉綠素或含葉綠醇的葉綠素衍生物為葉綠素、脫鎂葉綠素或焦脫鎂葉綠素，更優選地為脫鎂葉綠素或焦脫鎂葉綠素。葉綠素或含葉綠醇的葉綠素衍生物在本文所述的檢測分析方法中通常用作底物。所謂「不含葉綠醇的葉綠素衍生物」通常是指含葉綠醇的葉綠素衍生物的酶水解產物。葉綠素酶或相關酶可水解葉綠素和含葉綠醇的葉綠素衍生物以從二氫卟酚環裂解葉綠醇尾。這些化合物仍包含有色卟啉環，其中脫植基葉綠素呈綠色而脫鎂葉綠酸和焦脫鎂葉綠酸則呈紅棕色。優選地，不含葉綠醇的葉綠素衍生物為脫植基葉綠素、脫鎂葉綠酸或焦脫鎂葉綠酸，更優選地為脫鎂葉綠酸或焦脫鎂葉綠酸。不含葉綠醇的葉綠素衍生物通常為本文所述的檢測分析方法中的反應產物。葉綠素或葉綠素衍生物可為例如a、b或d形式。如本文所用，術語「葉綠素」包括葉綠素a、葉綠素b和葉綠素d。類似地,當提及脫鎂葉綠素、焦脫鎂葉綠素、脫植基葉綠素、脫鎂葉綠酸和焦脫鎂葉綠酸時，兼指a、b和d形式。如本文所述的檢測方法通常允許將葉綠素或含葉綠醇的葉綠素衍生物與其相應的不含葉綠醇的葉綠素衍生物區分開。例如，該方法可以使得能夠將葉綠素酶或相關酶的底物和反應產物彼此區分開。在特定實施例中，底物/產物(含葉綠醇/不含葉綠醇)對可以為(a)葉綠素和脫植基葉綠素；(b)脫鎂葉綠素和脫鎂葉綠酸；或(C)焦脫鎂葉綠素和焦脫鎂葉綠酸。樣品本方法可用於檢測存在於樣品中的不含葉綠醇的葉綠素衍生物。樣品可以(例如)包括衍生自任何類型的植物、藻類或細菌(例如藍細菌)的植物源製備樣、藻類製備樣或細菌源製備樣。在一個實施例中，樣品包含植物材料、植物油或植物提取物。例如，樣品可包含諸如菜油的植物油，包括由含油種子或含油果實加工得到的油(例如，諸如低芥酸菜子(油菜籽)油的種子油和諸如棕櫚油的果油)。如本文所述，在一些實施例中，該方法用於測定樣品中酶(例如葉綠素酶、脫鎂葉綠素酶和/或焦脫鎂葉綠素酶)的活性。在此類實施例中，樣品可包括任何疑似含有相關酶活性的製備樣。樣品可以(例如)包含植物、藻類或細菌製備樣或提取物，或者可以包含要測試葉綠素酶或相關酶活性的純化或重組蛋白質。在這些實施例中，不含葉綠醇的葉綠素衍 生物在檢測分析方法的接觸步驟之前可不存在於樣品中，即不含葉綠醇的衍生物可在添加合適的酶底物後產生。檢測費光信號在本發明的實施例中，檢測與不含葉綠醇的葉綠素衍生物相關的螢光信號。例如，可以檢測、測量或定量不含葉綠醇的衍生物所衍生的或發射的螢光信號，優選地在沒有衍生自葉綠素或含葉綠醇的葉綠素衍生物的螢光信號的情況下進行。用於檢測螢光信號的方法是本領域中所熟知的。例如，衍生自不含葉綠醇的葉綠素衍生物的螢光信號可以由任何合適的檢測器檢測，例如螢光分光光度計、螢光酶標儀或分光螢光計。檢測器通常包括光源，其產生用於激活螢光材料的適當波長的光；以及光學元件，其引導光源穿過檢測窗口至容納在通道或腔室中的材料。可以使用各種光源作為激發源，包括雷射器、光電二極體和氙氣燈或汞汽燈。光可透過濾光器(例如衍射光柵)或單色儀，以便在穿過樣品之前選擇固定的波長。可讓發射光透過濾光器或單色儀，而光電檢測器檢測的特定波長通常與激發光成90度角。光電檢測器可包括(例如)光電倍增管、光電二極體或電荷耦合器件(CCD)檢測器。光電檢測器通常提供螢光信號的強度值。信號可以作為數字或模擬輸出進行處理。在本發明的實施例中，選擇適於檢測葉綠素衍生物螢光的激發和發射波長，例如約410nm的激發波長和約670nm的發射波長。通常，所測螢光信號的強度與樣品中不含葉綠醇的葉綠素衍生物的濃度成正比。猝滅葉綠素或含葉綠醇的葉綠素衍生物發出的螢光信號在本發明的實施例中，樣品中與葉綠素或含葉綠醇的葉綠素衍生物相關的螢光信號被猝滅。所謂「猝滅」是指衍生自樣品中的葉綠素或含葉綠醇的葉綠素衍生物的螢光信號強度下降、受到抑制或遏制。在一個優選的實施例中，與葉綠素或含葉綠醇的葉綠素衍生物相關的螢光信號通過二聚化猝滅。所謂「二聚化」是指至少兩個含葉綠醇的葉綠素衍生物分子關聯起來以形成至少一個二聚體。因而，在此所用的「二聚化」包括形成含有三個或更多個含葉綠醇的葉綠素衍生物分子的更高級結構，諸如三聚體、四聚體或其他多聚體，前提條件是這些結構發出的螢光信號被猝滅並且二聚體或其他多聚體仍保留在溶液中(例如二聚體或多聚體是水溶液中的溶質)。也就是說，通常而言，葉綠素或含葉綠醇的葉綠素衍生物在檢測溶液中不形成固體顆粒，例如葉綠素或含葉綠醇的葉綠素衍生物在檢測溶液中不沉澱或不形成固體膠態聚集體。「二聚作用」和「多聚作用」因此可互換使用，並且也應相應地理解「二聚化」、「二聚化的」、「使形成二聚體」、「形成二聚體」。通過HPLC分析(FoodResearch International 38 (8-9) : 1067-1072 (2005))(《國際食品研究》，第38卷第8-9期，第1067-1072頁，2005年)已知的是，含葉綠醇的化合物諸如葉綠素、脫鎂葉綠素和焦脫鎂葉綠素通過410nm處的激發和667nm處的發射產生非常強的螢光信號。在某些條件下，葉綠素、脫鎂葉綠素和焦脫鎂葉綠素的卟啉環能夠形成二聚體，其強烈地猝滅螢光信號(參見 J. Photochem. Photobiol. B:Biol. 54(2000) 194 - 200(《光化學與光生物學雜誌，B輯生物學》，第54卷，2000年，第194 - 200頁))。不含葉綠醇的葉綠素衍生物諸如脫植基葉綠素、脫鎂葉綠酸和焦脫鎂葉綠酸也能夠通過卟啉環二聚化，導致類似的螢光強度下降。然而，含葉綠醇和不含葉綠醇的葉綠素衍生物發生二聚化的條件可不同。在本發明的實施例中，可以對這種差異進行研究，以便選擇專門檢測不含葉綠醇的衍生物發出的螢光的條件。因此，在一個實施例中，檢測步驟在使得葉綠素或含葉綠醇的葉綠素衍生物相比 不含葉綠醇的葉綠素衍生物優先二聚化的條件下進行。所謂「優先二聚化」是指在這些條件下葉綠素或含葉綠醇的葉綠素衍生物二聚化的比例大於不含葉綠醇的葉綠素衍生物二聚化的比例。在一些實施例中，至少50%、至少70%、至少90%或至少95%的衍生自葉綠素或含葉綠醇的葉綠素衍生物的螢光信號被猝滅，優選地通過二聚化猝滅。也就是說，在所用的檢測條件下，衍生自葉綠素或含葉綠醇的葉綠素衍生物的螢光信號強度與不發生猝滅的對照條件下(例如在葉綠素或含葉綠醇的葉綠素衍生物未發生顯著二聚化的條件下)衍生自葉綠素或含葉綠醇的葉綠素衍生物的螢光信號相比下降指定的比例。例如，無猝滅條件可以包括高(例如>0. 1%)濃度的表面活性劑。優選地，衍生自不含葉綠醇的葉綠素衍生物的螢光信號不顯著猝滅，或與衍生自葉綠素或含葉綠醇的葉綠素衍生物的螢光信號相比，被猝滅的程度較低。例如，在一些實施例中，與不發生猝滅的對照條件下(例如在不含葉綠醇的葉綠素衍生物未發生顯著二聚化的條件下)衍生自不含葉綠醇的葉綠素衍生物的螢光信號相比，低於50%、低於25%或低於10%的衍生自不含葉綠醇的葉綠素衍生物的螢光信號被猝滅。檢測條件本發明的檢測步驟可在使得樣品中與葉綠素或含葉綠醇的葉綠素衍生物相關的螢光信號被猝滅的條件下進行，優選地通過二聚化被猝滅。通過改變檢測信號的溶液的組成，本領域技術人員可以選擇適當的條件用以猝滅螢光信號，例如葉綠素或含葉綠醇的葉綠素衍生物顯著二聚化而不含葉綠醇的葉綠素衍生物未二聚化的條件。通常，檢測步驟在水溶液中進行。執行檢測步驟的溶液在本文中稱為「檢測溶液」。已經發現的是，可改變檢測溶液的組成以影響葉綠素衍生物的二聚化和螢光信號的猝滅。具體地講，檢測溶液中表面活性劑的濃度、溫度、PH和溶劑的類型與濃度可影響二聚化並且可以改變以便為檢測步驟選擇合適的條件。優選地，檢測溶液包含表面活性劑、溶劑和/或鹼。溶劑通常為諸如醇的極性質子溶劑，優選地為低級醇(例如C1-C5或C1-C3),更優選地為脂族一元醇。在特定實施例中，醇包括甲醇、乙醇、丙醇、異丙醇或丁醇，更優選地為乙醇或異丙醇，最優選地為異丙醇。檢測溶液可包含5至25重量％的醇，例如5至20重量％、5至15重量％、10至20重量％、12至20重量％、13至17重量％或約15重量％的醇，例如乙醇或異丙醇。溶劑(例如醇)的適當濃度可基於具體的醇和其他條件(即表面活性劑濃度、pH、溫度等)進行選擇。如果其他反應條件保持不變，則增加溶劑濃度通常會減少二聚化並因此減少螢光信號的猝滅。在一些實施例中，可以調整溶劑濃度(例如逐步增加同時保持其他條件不變)直至達到不含葉綠醇的葉綠素衍生物不再二聚化的濃度，但在此濃度下葉綠素或含葉綠醇的葉綠素衍生物仍處於二聚化狀態。此時，葉綠素或含葉綠醇的葉綠素衍生物發出的螢光信號仍然猝滅，而不含葉綠醇的衍生物發出的信號不猝滅。溶劑的這一濃度可隨後用於檢測步驟。對表面活性劑的性質沒有特別限制。在特定實施例中，表面活性劑可以為(例如)陰離子表面活性劑、陽離子表面活性劑、兩性離子表面活性劑或非離子表面活性劑。
合適的陰離子表面活性劑包括(例如)羧酸鹽，諸如皂和聚烷氧基羧酸鹽；磺酸鹽，諸如烷基苯磺酸鹽、烷基芳基磺酸鹽、萘磺酸鹽、α -烯烴磺酸鹽、具有酯、醯胺或醚鍵的磺酸鹽(包括醯胺基磺酸鹽、脂肪酸2-磺乙基酯和脂肪酸酯磺酸鹽)；硫酸鹽，諸如醇硫酸鹽、乙氧基化和硫酸化醇、乙氧基化和硫酸化烷基酚、硫酸化酸、硫酸化醯胺、硫酸化酯和硫酸化天然油和脂肪；磷酸酯，諸如磷酸丁酯、磷酸己酯、2-乙基己基磷酸酯、磷酸辛酯、磷酸癸酯、磷酸辛癸酯、混合烷基磷酸酯、多磷酸己酯、多磷酸辛酯、混合脂肪酸的甘油單酯(磷酸化)、2-乙基己醇(乙氧基化和磷酸化)、十二烷基醇(乙氧基化和磷酸化)、十三烷基醇(支化)、9_十八烷基醇(乙氧基化和磷酸化)、多元醇(乙氧基化和磷酸化)、酚(乙氧基化和磷酸化)、辛基酚(乙氧基化和磷酸化)、壬基酚(乙氧基化和磷酸化)、十二烷基酚(乙氧基化和磷酸化)和二壬基酚(乙氧基化和磷酸化)；以及膦酸酯。合適的陽離子表面活性劑包括(例如)胺，諸如不含氧的胺(包括單胺、二胺和多胺)、含氧的胺(包括氧化胺、乙氧基化烷基胺、I- (2-羥基乙基)-2-咪唑啉和乙二胺的烷氧基化物、乙二胺烷氧基化物)以及具有醯胺鍵的胺；以及季銨鹽，諸如二烷基二甲基銨鹽、氯化烷基苄基二甲基銨、烷基三甲基銨鹽、烷基吡啶鎗滷化物和季銨酯。兩性離子表面活性劑的例子包括烷基甜菜鹼、醯胺丙基甜菜鹼、烷基二甲胺、咪唑啉衍生物和胺基酸及其衍生物。可以使用的非離子表面活性劑包括羧酸酯，諸如甘油酯和聚氧乙烯酯；失水山梨醇酯，諸如乙氧基化失水山梨醇酯；聚氧乙烯表面活性劑，諸如醇乙氧基化物和烷基酚乙氧基化物；天然乙氧基化脂肪、油和蠟；脂肪酸乙二醇酯；烷基聚葡萄糖苷；羧醯胺，諸如二乙醇胺縮合物、單烷醇胺縮合物(包括椰油酸、月桂酸、油酸和硬脂酸單乙醇醯胺)和單異丙醇醯胺、聚氧乙烯脂肪酸醯胺；脂肪酸葡糖醯胺；以及聚氧化烯嵌段共聚物。許多合適的表面活性劑可商購獲得，包括=PluiOnii^系列的聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物；可以商品名Cremoplior#購得的聚乙二醇氫化蓖麻油，例如Cremophor RH40 ;可以商品名Nikkd 購得的產品(例如Nikkolf HC0-40和HC0-60);可以商品名Tagat 購得的聚氧乙烯甘油脂肪酸酯(例如Tagat RH 40和Tagat το);聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯，例如可以商品名Tweeni"商購獲得的單和三月桂基、棕櫚基、硬脂基和油烯基酯(例如Tween 20>Tween5 40或Tweenw 80);磷脂,尤其是卵磷脂,諸如大醜卵磷脂；可以商標Span 商購獲得的山梨糖醇酐脂肪酸酯，例如Span 20 (山梨糖醇酐單月桂酸酯)或Span 80 (山梨糖醇酐單油酸酯)。在一個實施例中，表面活性劑為聚氧乙烯表面活性劑,優選地具有約5至約50個聚氧乙烯部分聚合數，例如8至12個。更優選地，表面活性劑包括烷芳基乙氧基化物，諸如烷基酚乙氧基化物，例如與環氧乙烷聚合的辛基酚。在一個實施例中，表面活性劑包括4-辛基酚聚乙氧基化物(4-(1，1，3，3-四甲基丁基)苯基-聚乙二醇)，例如可以商品名Triton X-100從密蘇裡州聖路易斯市西格瑪奧德裡奇公司(Sigma-Aldrich, SaintLouis, MO)購得。優選地，檢測溶液包含O. 01至O. I重量％，例如O. 01至O. 05重量%、0· 01至O. 04
重量％、0. 01至O. 03重量％或O. 01至O. 02重量％的表面活性劑。表面活性劑的適當濃度可基於具體的表面活性劑和其他條件(即溶劑濃度、pH、溫度等)進行選擇。如果其他反應條件保持不變，則增加表面活性劑的濃度通常會減少二聚化並因此導致螢光信號的增強。在一些實施例中，可以調整表面活性劑濃度(例如逐步增加同時保持其他條件不變)直至達到不含葉綠醇的葉綠素衍生物不再二聚化的濃度，但在此濃度下葉綠素或含葉綠醇的葉綠素衍生物仍處於二聚化狀態。表面活性劑的這一濃度可隨後用於檢測步驟。檢測步驟可以在任何合適的溫度下進行。然而，如果其他反應條件保持不變，則升高溫度通常會減少二聚化並因此減少螢光信號的猝滅。因此，可將反應溫度選擇為使得在所用其他條件(例如溶劑和表面活性劑濃度、PH等)下葉綠素或含葉綠醇的葉綠素衍生物比不含葉綠醇的葉綠素衍生物優先二聚化。在特定實施例中，檢測步驟可以在10至50°C、15至40°C、15至30°C或優選地在室溫(例如20至25°C)下進行。檢測步驟可以在任何pH下進行。優選地，檢測步驟以鹼性pH (即大於7的pH，優選8. O或以上、9. O或以上、10. O或以上或者11. O或以上)進行。所需pH可通過向檢測溶液添加適量的鹼(例如氫氧化鈉)而實現。在一個實施例中，檢測溶液不含脂質體。有利的是，本發明的檢測方法無需脂質體來增強不含葉綠醇的葉綠素衍生物發出的螢光就可以執行。定量樣品中不含葉綠醇的葉綠素衍牛物的水平由於葉綠素或含葉綠醇的葉綠素衍生物發出的螢光在檢測步驟中被猝滅，因此螢光強度值可被視為等於樣品中不含葉綠醇的葉綠素衍生物的特定水平或濃度。通常，通過添加已知濃度的不含葉綠醇的葉綠素衍生物(例如脫植基葉綠素、脫鎂葉綠酸或焦脫鎂葉綠酸)並獲得螢光值而生成標準(校準)曲線。隨後可以將包含未知量的不含葉綠醇的葉綠素衍生物的樣品螢光值與標準曲線進行比較，以提供樣品中不含葉綠醇的葉綠素衍生物的濃度值。檢測分析方法在本發明的一個方面，上述檢測方法可用於定量樣品中酶活性的檢測分析方法。具體地講，該方法可通過監測不含葉綠醇的葉綠素衍生物的產生情況，用於測量葉綠素或含葉綠醇的葉綠素衍生物的酶水解。
任何能夠水解葉綠素或含葉綠醇的葉綠素衍生物的酶都可以用此方法進行測定。通常「水解葉綠素或含葉綠醇的葉綠素衍生物」是指水解葉綠素或含葉綠醇的葉綠素衍生物中的酯鍵，例如從葉綠素或葉綠素衍生物中的二氫卟吩環上裂解葉綠醇基團。因此該酶通常具有酯酶或水解酶活性。酶可為(例如)葉綠素酶、脫鎂葉綠素酶或焦脫鎂葉綠素酶。通常，該檢測分析方法包括使樣品與葉綠素或含葉綠醇的葉綠素衍生物接觸的步驟。因而，可將樣品與期望檢測酶活性的底物接觸。例如，在具體的實施例中，可讓樣品與以下底物接觸葉綠素(以便檢測葉綠素酶活性)、脫鎂葉綠素(以便檢測脫鎂葉綠素酶活性)或焦脫鎂葉綠素(以便檢測焦脫鎂葉綠素酶活性)。該方法還可以通過添加一種以上的底物用於檢測上述活性的任何組合。接觸步驟可以通過在反應溶液中用葉綠素或含葉綠醇的葉綠素衍生物溫育樣品而進行。所謂「反應溶液」是指允許樣品中的酶作用於底物的任何溶液，即在檢測步驟之前。可以將樣品直接加到反應溶液和底物中，隨後溫育酶活性發生的預定時間段。
接觸步驟可以在酶具有水解活性的任何條件下進行。葉綠素酶和相關酶具有活性的條件在(例如)Khamessan et al. (1994), Journal of Chemical Technology&Biotechnology, 60 (I), pages 73-81 (Khamessan等人，1994年，《化工技術和生物技術雜誌》，第60 卷第 I 期，第 73-81 頁)；Khamessan et al. (1996), Journal of Biotechnology, 45 (3)pages 253-264 (Khamessan等人，1996年，《生物技術雜誌》，第45卷第3期，第253-264頁)；Klein and Vishniac (1961), J. Biol. Chem. 236:2544-2547 (Klein 和 Vishniac，1961年，《生物化學雜誌》，第 236 卷，第 2544-2547 頁)；McFeeters et al. , Plant Physiology47:609-618(1971) (McFeeters等人，《植物生理學》，第47卷，第609-618頁，1971年)；以及 McFeeters et al. , Plant Physiology 55:377-381 (1975) (McFeeters 等人，《植物生理學》，第55卷，第377-381頁，1975年)中結合已知的檢測分析方法進行了描述。優選地，反應溶液包含表面活性劑、溶劑和/或緩衝液。表面活性劑和溶劑有助於溶解溶液中的底物(例如葉綠素、脫鎂葉綠素或焦脫鎂葉綠素)。表面活性劑可為上文關於檢測溶液描述的任何表面活性劑，例如聚氧乙烯表面活性劑，諸如Triton X-100。然而，反應溶液通常包含比檢測溶液中所存在的更高濃度的表面活性劑。例如，反應溶液可包含0. 05至0. 5重量％、0. I至0. 5重量％或0. I至0. 3重量％的表面活性劑。反應溶液可包含有機溶劑，諸如丙酮、乙醇、丙醇、丁醇等。葉綠素酶在各種有機溶劑中的活性在(例如)Khamessan et al. (1995)Process Biochemistry 30 (2), pages159-168 (Khamessan等人，1995年，《過程生物化學》，第30卷第2期，第159-168頁)中有所描述。優選地，反應溶液包含丙酮作為溶劑。在一些實施例中，反應溶液包含I至10重量％，例如3至7重量％或約5重量％的丙酮。反應溶液可以包含任何合適的緩衝液。可用的緩衝液包括(例如)磷酸鹽或HEPES(4-2-羥乙基-I-哌嗪乙磺酸)緩衝液。優選地，反應溶液的pH範圍為6. O至8. 0，例如6. 5至7. 5或約7，並且本領域技術人員可以很容易地選擇適合所需pH的緩衝液。反應溶液可包含一種或多種另外的鹽，諸如氯化鉀。可將樣品用底物和反應溶液溫育適當的時間段，以便允許可檢測量的產物的水解。典型的溫育時間包括(例如)10秒至120分鐘，例如I至60分鐘、I至30分鐘或5至20分鐘。溫育步驟可以在酶具有活性的任何溫度下進行，例如於10至50°C、15至45°C、20至25°C或35至45°C，優選地約40°C。在接觸步驟之後，通常在檢測螢光信號前將酶活性終止。酶活性可以通過(例如)提高溶液的pH，優選地提高到至少pH 10或至少pH 11而終止。在一個實施例中，在溫育步驟之後添加鹼(例如氫氧化鈉)以便終止酶反應。便利地，酶活性可以通過將反應溶液添加到上述檢測溶液中而終止，例如其中所述檢測溶液包含諸如氫氧化鈉的鹼。通常，將反應溶液按至少5倍、10倍、50倍或100倍稀釋到檢測溶液中。酶促反應之後，檢測分析方法包括用上述方法檢測不含葉綠醇的葉綠素衍生物產生情況的步驟。通常，測定檢測溶液中不含葉綠醇的葉綠素衍生物的濃度。如此，便可確定每單位時間的底物水解速率(在接觸步驟中)，其提供樣品中酶活性的度量。一單位酶活性可以定義為例如採用本文所述的檢測分析方法，在40°C下每分鐘水解一微摩爾底物(例如葉綠素、脫鎂葉綠素或焦脫鎂葉綠素)的酶的量。由於底物和產物是等摩爾的，因此作為另外一種選擇，一單位可以定義為在40°C下每分鐘產生一微摩爾產物(例如脫植基葉綠素、脫鎂葉綠酸或焦脫鎂葉綠酸)的酶的量。
有利的是，如上所述，本發明的檢測分析方法包括兩個分立的步驟酶具有活性的反應步驟，以及酶無活性的檢測步驟。由於反應和檢測步驟分別進行，因此它們可以在不同的溶液中和不同的條件下進行。這允許優化每個步驟的條件。因此，在一個實施例中，酶在反應溶液中具有活性，但在檢測溶液中無活性。例如，反應步驟可以採用酶具有活性的任何條件(例如pH 4至8)進行。相反，檢測步驟可採用被優化為有利於葉綠素或含葉綠醇的葉綠素衍生物發生選擇性二聚化，但酶無活性的條件(例如pH為10或更大)進行。試劑盒在另一個方面，本發明提供適用於執行如本文所述的方法或檢測分析方法的試劑盒。此類試劑盒可包含本文所述用於這些方法的試劑，具體地講為如本文所述的反應溶液、檢測溶液和底物。每種組分可連同合適的包裝和/或執行該方法的說明容納在合適的小瓶或其他容器內。反應溶液通常為酶具有活性的任何溶液。反應溶液可包含表面活性劑、溶劑和緩衝液，或可以為任何上述與檢測分析方法有關的其他反應溶液。優選地，底物包含葉綠素或含葉綠醇的葉綠素衍生物，諸如葉綠素、脫鎂葉綠素或焦脫鎂葉綠素。可在試劑盒中以單獨的容器或以組合形式提供一、二或三種或更多種底物。例如，在一些實施例中，兩種或更多種底物可存在於同一容器中，例如，如果需要測定兩種或更多種酶活性。通常，底物以水溶液形式提供。在一些實施例中，反應溶液和底物可按單一溶液提供。試劑盒可以包含如本文所述的任何檢測溶液。優選地，在檢測溶液中葉綠素或含葉綠醇的葉綠素衍生物發出的螢光被猝滅，而不含葉綠醇的葉綠素衍生物發出的螢光不猝滅，例如選擇檢測溶液使得底物相比於酶水解產物優先二聚化。在一個實施例中，檢測溶液包含表面活性劑、醇(例如異丙醇)和鹼(例如氫氧化鈉)。通常，酶在檢測溶液中無活性。在一個優選的實施例中，試劑盒還包含例如用於構建檢測分析方法中使用的標準(校準)曲線的一個或多個標準品。通常，此類標準品為各自包含已知濃度的產物(即不含葉綠醇的葉綠素衍生物)的容器形式。可提供一個、兩個或更多個標準品，其包含不同的產物(例如脫植基葉綠素、脫鎂葉綠酸或焦脫鎂葉綠酸)和/或不同濃度的每種產物。
現在將結合以下非限制性實例進一步說明本發明。實M在這些實例中，開發了測量葉綠素酶、脫鎂葉綠素酶和焦脫鎂葉綠素酶活性的檢測分析方法。在該檢測分析法的第一步中，製備了在緩衝液中由葉綠素、脫鎂葉綠素或焦脫鎂葉綠素組成的底物。將該底物加到酶溶液中，在40°C反應10分鐘。經過10分鐘的反應時間後，將一部分樣品轉移到檢測緩衝液中。測量酶活性所依賴的原理是檢測緩衝液中的葉綠素、脫鎂葉綠素或焦脫鎂葉綠素形成二聚體(參見圖I)。二聚體的形成將猝滅葉綠素、脫鎂葉綠素或焦脫鎂葉綠素的螢光信號。配製檢測緩衝液使得產生的脫植基葉綠素、脫鎂葉綠酸或焦脫鎂葉綠酸不形成二聚體，並因而可通過螢光光譜法檢測。實例I-開發焦脫鎂葉綠素酶活性的檢測分析 法配製IOOmM pH 7的磷酸鹽緩衝液用作反應緩衝液，其含有50mMKCl、0. 2%TritonX-IOO和5. 17%丙酮。配製以下包含焦脫鎂葉綠素、焦脫鎂葉綠酸或其混合物的溶液，然後將其加到反應緩衝液中I)焦脫鎂葉綠素溶液500 μ I反應緩衝液+50 μ I水+30 μ I焦脫鎂葉綠素(Img/ml的丙酮溶液)2)焦脫鎂葉綠酸溶液500 μ I反應緩衝液+50 μ I水+15 μ I焦脫鎂葉綠酸(2mg/ml的丙酮溶液)+15 μ I丙酮。3)焦脫鎂葉綠素焦脫鎂葉綠酸的I: I溶液500 μ I反應緩衝液+50 μ I水+15 μ I焦脫鎂葉綠素(lmg/ml的丙酮溶液)+7. 5 μ I焦脫鎂葉綠酸(2mg/ml的丙酮溶液)+7. 5 μ I丙酮。配製了包含不同濃度的Triton X-100 (表面活性劑)和乙醇或異丙醇(溶劑)的多種檢測溶液(A-G)，如下表I和2所示。將10 μ I溶液1、2或3加到1000 μ I的各檢測溶液A-G中，在Whirley混合機上混合，然後取200 μ I轉移到黑色微孔板。混合後10分鐘，在室溫測量了螢光信號(激發波長410nm，發射波長670nm)。對測量值進行了分析，以便確定底物(葉綠素、脫鎂葉綠素或焦脫鎂葉綠素)發出的螢光被猝滅但反應產物(脫植基葉綠素、脫鎂葉綠酸或焦脫鎂葉綠酸)發出的螢光未被猝滅並能通過螢光檢測而測量的條件。最初，測試了作為檢測溶液的乙醇、Triton X-100與50mM NaOH的組合。結果在下表I中顯示錶I
權利要求
1.ー種檢測樣品中不含葉綠醇的葉綠素衍生物的方法，包括檢測與所述不含葉綠醇的葉綠素衍生物相關的螢光信號的步驟，其中所述樣品中與葉綠素或含葉綠醇的葉綠素衍生物相關的螢光信號被猝滅。
2.根據權利要求I所述的方法，其中與葉綠素或所述含葉綠醇的葉綠素衍生物相關的所述螢光信號通過葉綠素或所述含葉綠醇的葉綠素衍生物的ニ聚化而粹滅。
3.根據權利要求I或2所述的方法，其中葉綠素或所述含葉綠醇的葉綠素衍生物與所述不含葉綠醇的葉綠素衍生物相比優先ニ聚化。
4.根據前述任一項權利要求所述的方法，其中所述不含葉綠醇的葉綠素衍生物包括脫鎂葉綠酸或焦脫鎂葉綠酸，和/或所述含葉綠醇的葉綠素衍生物包括脫鎂葉綠素或焦脫鎂葉綠素。
5.根據前述任一項權利要求所述的方法，其中在包含表面活性剤、醇和/或鹼的檢測溶液中執行所述檢測步驟。
6.根據權利要求5所述的方法，其中所述醇包括異丙醇或こ醇。
7.根據權利要求6所述的方法，其中所述檢測溶液包含12至20重量％的醇。
8.根據權利要求5至7任一項所述的方法，其中所述表面活性劑包括4-(1，I,3，3-四甲基丁基)苯基-聚こニ醇。
9.根據權利要求5至8任一項所述的方法，其中所述檢測溶液包含O.01至O. 03重量％的表面活性剤。
10.根據前述任一項權利要求所述的方法，其中所述檢測步驟在20至25°C進行。
11.根據前述任一項權利要求所述的方法，其中所述檢測步驟在大於10.0的pH值進行。
12.根據前述任一項權利要求所述的方法，其中檢測約670nm波長的螢光信號。
13.一種對樣品中的酶活性進行定量的檢測分析方法，其中所述酶能夠水解葉綠素或含葉綠醇的葉綠素衍生物，所述檢測分析方法包括 a)將所述樣品與葉綠素或含葉綠醇的葉綠素衍生物接觸；以及 b)通過前述任一項權利要求所述的方法檢測不含葉綠醇的葉綠素衍生物的產生情況。
14.根據權利要求13所述的檢測分析方法，其中步驟(a)包括將所述樣品與葉綠素或含葉綠醇的葉綠素衍生物在含表面活性剤、丙酮和/或緩衝液的反應溶液中進行溫育。
15.根據權利要求13或14所述的檢測分析方法，包括在步驟(a)之後並在步驟(b)之前通過將所述反應溶液加到如權利要求5至9任ー項所定義的檢測溶液中而終止酶活性。
16.一種對樣品中的酶活性進行定量的試劑盒，其中所述酶能夠水解葉綠素或含葉綠醇的葉綠素衍生物，所述試劑盒包括 a)反應溶液，所述酶在其中具有活性； b)底物，所述底物包括葉綠素或含葉綠醇的葉綠素衍生物；以及 c)檢測溶液，所述底物在其中與由所述酶產生的不含葉綠醇的葉綠素衍生物相比優先ニ聚化。
17.根據權利要求16所述的試劑盒，其中所述反應溶液包含表面活性剤、丙酮和緩衝液。
18.根據權利要求16或權利要求17所述的試劑盒，其中所述底物包括脫鎂葉綠素或焦脫鎂葉綠素。
19.根據權利要求16至18任一項所述的試劑盒，其中所述檢測溶液如權利要求5至9中任ー項所定義。
20.根據權利要求16至19任一項所述的試劑盒，其中所述酶在所述檢測溶液中無活性。
21.根據權利要求16至20任一項所述的試劑盒，還包括一種或多種標準溶液，每ー種包含已知濃度的所述不含葉綠醇的葉綠素衍生物。
22.根據權利要求I至12任一項所述的方法，其中葉綠素或所述含葉綠醇的葉綠素衍生物以ニ聚體和/或其他非膠態多聚體的水溶液形式存在。
23.根據權利要求I至12和22任一項所述的方法，其中所述檢測步驟在不存在脂質體的情況下進行。
24.根據權利要求5至12任一項所述的方法，其中所述表面活性劑包括4-(1, 1，3，3-四甲基丁基)苯基-聚こニ醇，所述醇包括異丙醇以及所述鹼包括氫氧化鈉。
25.根據權利要求13至15任一項所述的檢測分析方法，其中所述酶在步驟(a)中具有活性，而所述酶在步驟(b)中無活性。
全文摘要
本發明提供檢測樣品中不含葉綠醇的葉綠素衍生物的方法，所述方法包括檢測與所述不含葉綠醇的葉綠素衍生物相關的螢光信號，其中所述樣品中與葉綠素或含葉綠醇的葉綠素衍生物相關的螢光信號被猝滅。所述方法可用於對樣品中的葉綠素酶和相關酶的活性進行定量，而不用對底物和產物進行溶劑分提。
文檔編號C12Q1/44GK102858994SQ201180018072
公開日2013年1月2日 申請日期2011年4月6日 優先權日2010年4月8日
發明者R.米克爾森, T.約根森, J.B.索厄 申請人:杜邦營養生物科學有限公司