低分子量褐藻多糖硫酸酯在糖尿病腎病藥物中的用途的製作方法

2023-05-07 12:25:16 2

專利名稱：：低分子量褐藻多糖硫酸酯在糖尿病腎病藥物中的用途的製作方法
技術領域：
：本發明涉及低分子量褐藻多糖硫酸酯的製藥用途，特別涉及低分子量褐藻多糖硫酸酯在製備治療糖尿病腎病藥物方面的用途。
背景技術：
：褐藻多糖硫酸酯是一類硫酸化多糖，存在於褐藻中，首先由Kylin在1913年用稀酸從掌狀海帶中提取出來。Kylin將提取物水解後分離出L-巖藻糖，他將這種多糖命名為fucoidin，現根據多糖的命名原則一般定名為fucoidan，中文名稱為墨角藻多糖、巖藻多糖、巖藻聚糖、巖藻聚糖硫酸酯、褐藻糖膠或褐藻多糖硫酸酯。現在人們對褐藻多糖硫酸酯的組成有較為清晰的了解，它是一類化學組成和結構非常複雜的多糖，以巖藻糖和硫酸基為主，隨著藻的種類不同還含有半乳糖、木糖、糖醛酸等其他成分。海帶Fucoidan由巖藻糖、半乳糖、木糖、葡萄糖醛酸、阿拉伯糖等單糖組成。以巖藻糖和半乳糖為主，巖藻糖與半乳糖大概在3:1。褐藻多糖硫酸酯化學結構非常複雜，不同褐藻中分離到的褐藻多糖硫酸酯其結構有很大差異。到目前為止，對來源於墨角藻(Fucusvesiculosus)和泡葉藻(Ascophyllumnodosum)的揭藻多糖硫酸酯的結構研究最多，墨角藻褐藻多糖硫酸酯主要以a(1—3)糖苷鍵連接，硫酸化主要發生在C4位。對泡葉藻褐藻多糖硫酸酯的多項研究都表明其中存在大量的a(1—3)和a(1—4)糖苷鍵。此外還有幾種褐藻褐藻多糖硫酸酯的結構被報導。昆布(Eckloniakurome)褐藻多糖硫酸酯主要為a(1—3)連接，硫酸化在C"立。來源於枝管藻(Cladosiphonokamuranus)和繩藻(Chordafil咖)的褐藻多糖硫酸酯主鏈均為a(1—3)的巖藻糖，硫酸化在Q位，而且，二者均有少量的2-0-乙醯化。formulaseeoriginaldocumentpage3墨角藻、泡葉藻褐藻多糖硫酸酯結構昆布褐藻多糖硫酸酯結構formulaseeoriginaldocumentpage4繩藻褐藻多糖硫酸酯結構formulaseeoriginaldocumentpage4關於海帶褐藻多糖硫酸酯的結構，多數的研究資料表明海帶褐藻多糖硫酸酯主要是以a-(1—3)連接的L-巖藻糖組成，硫酸化發生在C4或C2位，而且部分研究顯示存在部分(1—2)連接的L-巖藻糖作為側鏈。與上圖中繩藻褐藻多糖硫酸酯結構有相似之處。但繩藻中有部分乙醯基。而且不同取代基團所佔的比例也不一樣。當然分子中還存在半乳糖、木糖、鼠李糖等單糖，半乳糖可能參與了主鏈的組成，而木糖、鼠李糖等是以側鏈的形式存在。已有多篇文獻公開了褐藻多糖硫酸酯以及低分子量褐藻多糖硫酸酯的製備方法及其製藥用途。閂本專利昭46-2248採用十六垸氯化吡啶或十六烷三甲基溴化銨與褐藻多糖硫酸酯反應成季胺鹽複合物，再利用該複合物對鹽的溶解度差異，用乙醇、甲醇和離子交換樹脂處理，純化除去褐藻膠、中性多糖和其它雜質，而得到比較純化的褐藻多糖硫酸酸酯。CN1129109A則公開了由幹海帶浸泡、數次過濾、二次乙醇提取、一次乙醇洗滌、配合調節ra範圍等的鹼凝析法。CN1344565A則公開了另一種製備方法，包括原料預處理、控溫攪拌浸提、離心、濃縮、乙醇沉澱、無水乙醇脫水等步驟。CN1517356A則將巖藻聚糖硫酸酯配製成水溶液，加入過氧化氫、次氯酸或亞硝酸及其鹽，將所得混合溶液加熱，用截留分子量3000-5000的膜超濾，得到巖藻聚糖硫酸酯低聚糖。CN1560086A則公開了一種高硫酸根含量巖藻聚糖硫酸酯的製備方法，用熱水或酸水浸提褐藻，製得含褐藻聚糖硫酸酯的提取液，將該提取液濃縮至多糖的重量百分數為2-io%，調ra5-8，加入殼聚糖溶液攪拌，離心或過收集沉澱，將沉澱用於5-10倍鹽溶液提取2-4次，離心或過濾收集清液，將該清液透析或超濾脫鹽。CN1616494A以天然海藻硫酸多糖為原料，將海藻硫酸糖溶液中加入抗壞血酸和過氧化氫，控制反應溫度，恆溫降解時間為0.5-3hr，再透析或超濾，減壓濃縮，製得4-100KDa的低分子量海藻硫酸多糖產物。另外，CN1670028A、CN1392160A、CN1197674A也分別公開了採用絮凝等方法製備海藻多糖。在本發明中，以上發明公開的內容均被全文引入本文作為參考。此外，以上發明還公開了褐藻多糖硫酸酯以及低分子量褐藻多糖硫酸酯具有抗凝血、提高免疫力、抗腫瘤、抗菌素病毒、降血糖、抗輻射、抑制腹水瘤等活性，CN1547478A則公丌了其在治療粘連、關節炎和牛皮癬中的用途。糖尿病腎病(diabeticn印hropathy，DN)是糖尿病(DM)的三大微血管併發症之一，多數研究表明30%60%糖尿病患者合併糖尿病腎病。在歐美，糖尿病己成為導致終末期腎病(ES2RD)的首位病因；國內隨著DM患病率每年以O.1%的速度增加，因糖尿病導致的腎衰竭亦逐年增高且已成為影響糖尿病患者生存質量和致死的主要原因。同時由於本病伴有代謝紊亂及常合併較嚴重的心腦血管等併發症,其治療遠較一般腎病複雜。糖尿病腎病起病隱匿，早期常缺乏明顯的臨床表現,一旦發展到臨床階段，其病理和功能障礙不可逆轉，並呈進行性發展,最終導致終末期腎病。蛋白尿是糖尿病腎病最主要的臨床表現。有研究表明，I型糖尿病患者病程15年以上者有30%40%發生腎病，n型糖尿病患者病程25年以上者有21%26%出現微量蛋白尿。有效治療糖尿病腎病，延緩腎功能的減退速度，是提高患者生活質量的重要措施。任東升，李海劍，陶雅非等報導褐藻多糖硫酸酯對對處於氮質血症期的糖尿病腎病患者具有顯著改善蛋白尿、糾正低蛋白血症、改善腎功能作用(任東升，李海劍，陶雅非.褐藻多糖硫酸酯對糖尿病腎病患者的影響.醫藥論壇雜誌2007年，28(4):66-67)。但低分子褐藻多糖硫酸酯是褐藻多糖硫酸酯降解而製得的硫酸化多糖或寡糖類物質，經降解後的低分子褐藻多糖硫酸酯與褐藻多糖硫酸酯相比，其藥理活性將產生較大變化。目前尚未有文獻表明低分子量褐藻多糖硫酸酯在治療糖尿病腎病方面的用途。
發明內容本發明的目的是提供低分子量褐藻多糖硫酸酯在治療糖尿病腎病方面的用途。另一方面，本發明提供了含低分子量褐藻多糖硫酸酯的藥物組合物。所述組合物中包含治療有效量的低分子量褐藻多糖硫酸酯和至少一種藥學上可接受的輔料。該組合物的給藥方式可以是但不限於經靜脈注射、口服、肌肉、皮下、皮膚表面、直腸內、局部注射等方式給藥，其劑型可以但不限於是注射液、凍乾粉針劑、注射微球、脂質體、片劑、膠囊劑、水劑、散劑、糊劑、噴霧劑、顆粒劑、軟膠囊、滴丸劑、凝膠劑、貼片、膏劑等，其中優選注射液和凍乾粉針劑。本領域技術人員根據現有技術以及製劑領域的公知常識可以方便地製備出所需劑型。本發明中的低分子量褐藻多糖硫酸酯，是指將褐藻多糖硫酸酯通過某種合適的方式(降解方式包括但不限於酸降解法、鹼降解法、酶降解法、物理降解法、自由基氧化降解法等)降解而製得的硫酸化多糖或寡糖類物質，其分子量較未降解褐藻多糖硫酸酯分子量低，具體的分子量範圍可以是8000100000，優選是800060000，更優選是800012000以及2000040000,其中最佳為800012000。褐藻多糖硫酸酯可以來源於人工養殖的海帶，也可以是野生褐藻馬尾藻、裙帶菜、羊棲菜、鼠尾藻、海黍子、昆布、泡葉藻或墨角藻。優選來源於海帶。本發明的組合物中，低分子量褐藻多糖硫酸酯的含量>50%，優選為》70%，更優選為》90%，最佳是》95%。單位製劑中褐藻多糖硫酸酯的含量可以是lmg1000mg,優選10mg800mg，更優選20mg500mg，最優選20mg300mg，最佳是30mg100mg。本發明的褐藻多糖硫酸酯可以按以下方式提取和純化、分級1.提取褐藻多糖硫酸酯可以用水、稀酸或氯化鈣溶液提取，然後向提取液中加入氫氧化鉛、氫氧化鋁、乙醇或季胺鹽類陽離子表面活性劑，都可使褐藻多糖硫酸酯沉澱出來，為了減少色素、蛋白質等的溶出，提取之前可以先以高濃度醇類或甲醛溶液處理藻體。近年來也陸續有人採用微波提取、超聲波提取以及高分子絮凝沉澱提取等方法。2純化製備的粗褐藻多糖硫酸酯通常會含有部分水溶性褐藻膠、蛋白質、褐藻澱粉、色素等，需要進一步純化，純化方法有以下幾種乙醇重沉澱西出英一(西出英一等，閂本水産學會誌，1982，48(12):1771)對熱水提取的粗褐藻多糖硫酸酯水溶液在0.05MMgCl2存在時，以20%乙醇沉澱除去作為雜質的水溶性褐藻膠。王作芸、趙學武(王作芸.趙學武.銅藻的褐藻糖膠、褐藻澱粉和褐藻膠的分離及提純.水產學報.1985;9(1):71)在研究銅藻中褐藻多糖硫酸酯時，將製得的粗褐藻多糖硫酸酯溶於水後，先後以4MCaCl2和30。/。乙醇沉澱去除褐藻膠，然後用80%乙醇沉出純化的褐藻多糖硫酸酯。季胺鹽類沉澱法利用陽離子表面活性劑如十六烷基氯化吡啶(CPC)或十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)能與高分子電解質產生沉澱的性質使褐藻多糖硫酸酯沉澱下來。在提取和純化過程中，為除去溶液中的離子和小分子物質一般都採用透析的方法。也有人採用超濾分離方法以排除分子量較小的物質。有時為除去混雜在提取液中的褐藻澱粉和蛋白質，可採取酶消化法。Feury等(FleuryNandLahayeM.Studiesonby-productsfromtheindustrialextrationofalginate2.Chemiealstructureanalysisoffucansfromthe1each-water.JApplPhycol，1993，5:605-610)在研究法國褐藻膠工業的副產品時就採用葡聚糖酶和alcalase來清除其中的褐藻澱粉和蛋白質。分離褐藻澱粉和褐藻多糖硫酸酯還可以採用離子交換樹脂法，因為前者是電中性的，而後者為多聚陰離子形式。3分級由於褐藻多糖硫酸酯化學組分相當複雜，對製備出的粗褐藻多糖硫酸酯的色譜和電泳檢查一般都呈現不均一性，因此人們逐步使用分級方法將混雜的多糖分成不同級分以進行深入研究常用的分級方法有兩種一種是乙醇分級沉澱，即利用不同的乙醇濃度沉澱出不同的級分，另一種是層析法，利用凝膠過濾柱層析和離子交換層析進行分級。離子交換層析法能將多糖分成荷電性不同的級分，凝膠過濾層析法則將多糖按照分子量大小進行分級。還可以採用超濾技術對褐藻多糖硫酸酯進行分級。將褐藻多糖硫酸酯降解從而製備低分子量褐藻多糖硫酸酯的方法則可採用以下幾種1.酸降解，在酸性條件下，酸性溶液能引起多糖中糖苷鍵的斷裂，使多糖降解為低分子片段。控制酸的濃度、溫度及時間可獲得不同分子量大小的降解產物。多糖降解產品分子量分布較難控制，硫酸根含量變化較大。2.鹼解法，在鹼性條件下，往往引起酸性多糖的改性及硫酸根的脫落，影響產品的活性，因此不適用於海藻硫酸多糖。3.酶解法，酶解法是利用專一性糖苷酶通過開裂多糖中的某一糖苷鍵來達到降解的目的。酶降解反應因其高度的專一性、高效性以及降解條件及過程易於控制，無副反應等，在多糖降解中已逐漸受到重視。但由於酶的專一性強，因此不具有廣泛的適用性，而且酶生產周期長，容易失去活性，成本高。這些缺點都使得該法目前無法推廣應用。丄物理降解法，包括超聲波和微波等方法。這兩種方法由於能耗高,儀器設備條件要求高,樣品處理量小，目前無法應用於工業生產。超聲波輻射的結果表明，無論輻射時間長短，解聚分子量有個低限；而且，解聚物具有相當窄的分子量分布，5.自由基氧化降解例如以過氧化氫降解法肝素所得產物的硫酸化程度較高，成本較低，具有較大的應用價值。另外，本文中所引用專利公開的提取方法以及由這些方法製備的產品也可以被本領域技術人員任意地採用。在本發明的一個具體實施方式中，低分子褐藻多糖硫酸酯是採用以下製備方法製備將海帶粉碎後以甲醛溶液浸泡過夜，添加蒸餾水沸水提取，提取液以硅藻土助濾過濾，濾液先以自來水流水透析一天，然後以蒸餾水透析一天，將透析液濃縮，加乙醇至濃度為75%沉澱，沉澱乾燥得粗褐藻多糖硫酸酯。將粗品重溶於水，在0.05mol/LMgCL存在下20%乙醇沉澱除去水溶性褐藻膠，濾液透析、濃縮後75%乙醇沉澱，乾燥後即得到純化的褐藻多糖硫酸酯。取適量海帶褐藻多糖硫酸酯，溶於蒸餾水中；向該溶液中加入適量抗壞血酸和過氧化氫，混合均勻，在室溫下攪拌反應，對反應液進行透析或超濾，除去殘存的抗壞血酸和過氧化氫，將透析液或超濾液，進行減壓濃縮，將濃縮液冷凍千燥。以下通過具體實施方式對本發明進行進一步說明。這裡想要指出的是，下面的具體實施方式僅用來說明本發明，本領域技術人員在理解本發明精神的前提下，可以根據本
技術領域：
的現有技術和公知知識對本發明進行相應變換，這些技術方案均落入本發明的範圍之內。具體實施例方式實施例l褐藻多糖硫酸酯的製備將海藻粉碎後以3.7%甲醛溶液浸泡過夜，然後添加蒸餾水沸水提取，提取液以硅藻土助濾過濾，濾液先以自來水流水透析一天，然後以蒸餾水透析一天，將透析液濃縮，加乙醇至濃度為75%沉澱，沉澱乾燥得粗褐藻多糖硫酸酯。將粗品重溶於水，在O.05mol/LMgCL存在下20%乙醇沉澱除去水溶性褐藻膠，濾液透析、濃縮後75%乙醇沉澱，乾燥後即得到純化的褐藻多糖硫酸酯。按照上述方法製備四種海藻褐藻多糖硫酸酯，其化學組分分析如下表所示:tableseeoriginaldocumentpage9低分子量褐藻多糖硫酸酯的製備(以下簡稱為"樣品A")稱取150g海帶褐藻多糖硫酸酯，溶於10L蒸餾水中配成濃度為1.5%的溶液；向該溶液中加入抗壞血酸和過氧化氫，使它們的濃度分別達到5mmol/L，混合均勻，在室溫下攪拌反應2小時，反應完畢後，對反應液進行透析並超濾，除去殘存的抗壞血酸和過氧化氫，將超濾液進行減壓濃縮，再將濃縮液冷凍乾燥；製得低分子量褐藻多糖硫酸酯A;經檢測該產物的數均分子量15kD，峰位分子量19kD，重均分子量30kD，分子量範圍為20KD-40KD。化學組分分析結果巖藻糖含量28.8%，硫酸根含量29.1%。低分子量褐藻多糖硫酸酯的製備(以下簡稱為"樣品B")稱取150g海帶褐藻多糖硫酸酯，溶於10L蒸餾水中配成濃度為1.5%的溶液；向該溶液中加入抗壞血酸和過氧化氫，使它們的濃度分別達到30mmol/L，混合均勻，在室溫下攪拌反應2小時，反應完畢後，對反應液進行透析和超濾，除去殘存的抗壞血酸和過氧化氫，將超濾液進行減壓濃縮，再將濃縮液冷凍乾燥；製得低分子量褐藻多糖硫酸酯B;經檢測該產物的數均分子量6.9kD，峰位分子量7.7kD，重均分子量llkD,分子量範圍為8KD-12KD。化學組分分析結果巖藻量28.3%，硫酸根含量28.7%。實施例2低分子量褐藻多糖硫酸酯注射劑的製備取低分子量褐藻多糖硫酸酯50g，加入注射用水500ml，甘露醇50g，調PH值至7.0，分裝，冷凍千燥。實施例3低分子量褐藻多糖硫酸酯片劑的製備取低分子量褐藻多糖硫酸酯50g，加入微晶纖維素，聚乙烯吡咯烷酮，混合，加入適量水，制軟材，制粒，乾燥。粒子加入交聯羧甲基纖維素鈉、硬脂酸鎂，混合，壓片，每片含低分子量褐藻多糖硫酸酯10-200mg。實施例4低分子量褐藻多糖硫酸酯對糖尿病腎病的治療作用選用健康雄性Wistar種大鼠110隻，體重190-220g，戊巴比妥鈉40mg/kg腹腔麻醉，消毒後經背部切開皮膚，分離肌肉，完整摘除右側腎臟(IO只假手術組只進行手術操作，不摘除右側腎臟)，然後縫合肌肉和皮膚，常規飼養2周後，用鏈尿佐菌素50mg/kg腹腔注射，48小時後，測定空腹血糖及尿糖。選用空腹血糖1325mmol/L及尿糖強陽性的動物進行分組給藥。把符合規定的大鼠隨機均衡分為7組，除假手術對照組10隻外，模型對照組、低分子量褐藻多糖硫酸酯(樣品A)高劑量組(300mg/kg)、中劑量組(150mg/kg)、低劑量組(75呢/kg)、陽性藥對照組(糖適平15mg/kg+洛丁新1.5mg/kg),洛汀新(l.5mg/kg)組，均為12隻，進行灌胃給藥，灌胃容積均為lml/100g體重，模型對照組、假手術對照組均灌胃給予等容量0.5%CMC，每天一次，每周7次，連續10周，觀察並測定以下指標包括一般觀察、24小時尿蛋白定量、血糖、血液尿液生化、微量成分以及腎臟臟器係數。所有實驗數據以均值土標準差(S土s)表示，應用t檢驗判斷組間均數差異顯著性。試驗結果假手術組大鼠體重增長明顯，精神狀態良好，動作自如，毛色正常；模型組大鼠明顯消瘦，反應遲鈍，豎毛，有4隻出現白內障；低分子量褐藻多糖硫酸酯300和150mg/kg劑量組精神狀態好於模型對照組，較少豎毛，反應較好，無白內障，75mg生藥/kg劑量組和模型對照組比較，無明顯差異，有l白內障出現；洛汀新組精神狀態好於模型組，有2例白內障出現；洛汀新+糖適平組也明顯好於模型對照組，l只動物有白內障。與模型對照組比較，各實驗組動物體重未見明顯差異。與假手術組比較，給藥後l、4、6、8、10周，模型組大鼠尿24小時尿量、尿蛋白定量均明顯增加；給藥後0、2、4、6、8、10周，模型組大鼠血糖明顯升高；與模型組比較，低分子量褐藻多糖硫酸酯75、150和300mg/kg劑量組及各陽性對照組均從第六周開始明顯減少24小時尿量，明顯降低尿蛋白定量。低分子量褐藻多糖硫酸酯各治療組在第8、IO周明顯降低大鼠血糖，糖適平+洛汀新組於第6、8、IO周明顯降低大鼠血糖，其它給藥組對大鼠血糖均無明顯影響。與假手術組比較，模型組肌酐、尿素氮明顯升高，各給藥組對血肌酐均無明顯影響，低分子量褐藻多糖硫酸酯各給藥組對尿素氮、肌酐均有明顯降低作用。低分子量褐藻多糖硫酸酯150、300mg/kg劑量組對尿肌酐有顯著降低作用，並明顯提高肌酐清除率。腎臟係數與假手術組比較，模型組大鼠腎臟肥大，臟器係數明顯增大；與模型對照組比較，低分子量褐藻多糖硫酸酯300mg/kg和糖適平+洛汀新劑量組腎臟臟器係數明顯減小。具體實驗結果見表1一6。tableseeoriginaldocumentpage12表2低分子量褐藻多糖硫酸酯對糖尿病腎病大鼠24小時尿量的影響(Z±SD)(n)tableseeoriginaldocumentpage13與假手術組比較P<0.01、與模型組比較P<0.05"P<0.01200810103375.5轉溢齒被11/1355表3低分子量褐藻多糖硫酸酯對糖尿病腎病大鼠尿蛋白的影響(？±SD)tableseeoriginaldocumentpage14與假手術組比較P〈0.Q1、與模型組比較P<0.05MP<0.01表4低分子量揭藻多糖硫酸酯對糖尿病腎病大鼠血糖的影響(f±SD)tableseeoriginaldocumentpage145AA與假手術組比較P<0.01':與模型組比較P<0.05WP<0.01表5低分子量褐藻多糖硫酸酯對糖尿病腎病大鼠血肌酐、尿素氮的影響(X土SD)(n)tableseeoriginaldocumentpage15與模型組相比，P<0.05**P<0.01表6低分子量褐藻多糖硫酸酯對糖尿病腎病大鼠腎臟臟器係數的影響(I土SD)tableseeoriginaldocumentpage15與假手術組比較P<0.05AAP<0.01:與模型組比較P<0.05"P<0.0權利要求1低分子量褐藻多糖硫酸酯在製備治療糖尿病腎病的藥物中的用途，其中所述的低分子量褐藻多糖硫酸酯是將褐藻多糖硫酸酯通過降解而製得的硫酸化多糖或寡糖類物質。2根據權利要求1中任一項權利要求的用途，其中所述的低分子量褐藻多糖硫酸酯分子量為15000200000。3根據權利要求2的用途，其中所述的低分子量褐藻多糖硫酸酯分子量為15000100000。4根據權利要求3的用途，其中所述的低分子量褐藻多糖硫酸酯分子量為1500080000。5根據權利要求4的用途，其中所述的低分子量褐藻多糖硫酸酯分子量為1500030000。6根據權利要求1的用途，其中所述的降解方式選自酸降解法、鹼降解法、酶降解法、物理降解法、自由基氧化降解法。7根據權利要求1的用途，其中的褐藻多糖硫酸酯來源於海帶。8根據權利要求1的用途，其中的低分子量褐藻多糖硫酸酯的劑型為注射劑、口服製劑、局部給藥製劑或鼻腔給藥製劑。全文摘要本發明公開了分子量為15000-200000的低分子量褐藻多糖硫酸酯在製備糖尿病腎病的藥物中的用途。本發明中的低分子量褐藻多糖硫酸酯可以從海帶、墨角藻、泡葉藻、昆布或繩藻中提取得到的褐藻多糖硫酸酯降解而得。文檔編號A61P13/12GK101306014SQ20081010337公開日2008年11月19日申請日期2008年4月3日優先權日2008年4月3日發明者靜李,郝守祝申請人:北京世紀博康醫藥科技有限公司