氣單胞菌屬鑑定培養基及其製備方法
2023-04-30 14:28:26
專利名稱：氣單胞菌屬鑑定培養基及其製備方法
技術領域：
本發明涉及一種菌種培養基及其製備方法，特別是一種氣單胞菌屬鑑定培養基及其製備方法。
氣單胞菌廣泛分布於河水、池水、汙水及河道和近陸地海灣的泥沙中，甚至在植物的根、莖和土壤中也可檢出，常存在於魚、蝦、貝、青蛙、蛇等冷血動物和兩棲動物的體腔。氣單胞菌是冷血動物、某些溫血動物和人的重要致病菌。因此，快速、準確地對氣單胞菌進行鑑定，對該菌所致臨床感染的臨床診斷及指導合理用藥有重要意義。目前，我國雖已建立了較系統的檢驗方法，但尚無一種特異性強的菌屬鑑定培養基，它直接影響了氣單胞菌的檢出率和延長了確認鑑定的時間。氣單胞菌發現已90多年的歷史，長期以來，對該菌的檢驗都採用腸桿菌科細菌的檢驗程序，因此，其陽性檢出率偏低。國外為了提高對該菌的檢出率，除用SS和麥康開瓊脂進行初分離外，據據氣單胞菌對青黴素等耐藥的特性，研製出在初分離培養基中加青黴素，先鋒黴素或新生黴素，製成選擇性初分離培養基，以提高陽性檢出率。多年來我國對氣單胞菌的初分離也採用SS和麥康開瓊脂，初篩鑑定用腸桿菌科細菌指定的TSI瓊脂。由於多數氣單胞菌分解蔗糖，少數種遲緩分解乳糖並分解葡萄糖產酸或產酸產氣。因此，氣單胞菌在此培養基上的反應與腸桿菌科中的大腸埃希氏菌屬、腸桿菌屬、克雷伯氏菌屬、變形菌屬、沙雷氏菌屬等相一致，往往將它作為非致病菌給與拋棄。1979年，國外研製出一種嗜水氣單胞菌的初篩鑑定培養基(AH)，在此培養基上，氣單胞菌中的嗜水氣單胞菌呈現表層紫色，底層黃色反應，並結合吲哚、動力、硫化氫試驗，可排除腸桿菌科中與氣單胞菌生化反應關的菌屬，使嗜水氣單胞菌屬的陽性檢出率大大提高，但是這種檢驗方法，程序複雜、檢驗範圍只是一個菌種，檢驗範圍較小，檢驗成本較高。
本發明的目的是提供一種簡單、特異並且可以實現快速、準確的對氣單胞菌進行鑑定的氣單胞菌屬鑑定培養基。
本發明的另一個目的是提供一種簡單、方便的配製氣單胞菌屬鑑定培養基的製備方法。
本發明的目的是通過以下技術方案實現的本發明為一種氣單胞菌屬鑑定培養基，它的組成成份及其組成成份水溶液在百分比濃度下的有效範圍是L-鳥氨酸0.4-0.5、甘露醇0.07-0.10、肌醇0.5-1.0、瓊脂0.30-0.35、溴用酚紫0.0025-0.0035。
本發明的另一個發明目的是通過以下方法實現的按照組成成份取肝蛋白腖0.45-0.55、酵母浸膏0.25-0.35、蛋白腖0.85-0.95，色氨酸0.09-0.11、L-鳥氨酸0.4-0.5、甘露醇0.07-0.10肌醇0.5-1.0、硫代硫酸鈉0.035-0.045、檸檬酸鐵銨0.04-0.06、瓊脂3.0-3.5g，以上成份混合，加蒸餾水1000ml，加熱溶化，調整PH值6.7，加入溴甲酚紫0.025g，分裝到小試管，每管2ml，膠塞封口，121℃高壓滅菌1.2分鐘，4℃冰箱保存備用。
本發明所述的培養基是鑑於氣單胞菌鳥氨酸陰性(除維羅那氣單胞菌外)，發酵甘露醇(除舒氏氣單胞菌外)，不發酵肌醇的生化特徵而製備的。在反應原理上，加入肝腖、酵母浸膏，硫代硫酸鈉、檸檬酸鐵銨以測定硫化氫的存在，加入蛋白腖、色氨酸以觀察吲哚反應，加入適量的瓊脂以觀察細菌的運動性，加入溴甲酚紫指示劑以顯示酸鹼度，它的變色範圍是PH值5.2-6.8，顏色由黃到紫。本培養基配方的關鍵是L-鳥氨酸、肌醇、甘露醇的劑量。鳥氨酸脫羧產鹼，肌醇、甘露醇發酵產酸。當鳥氨酸陰性時，如果肌醇陰性、甘露醇陽性，由於甘露醇的量較少，發酵產酸就少，只有底層變黃(K/A)，如果肌醇陽性，由於肌醇的量是甘露醇的10倍，所以產酸較多，表層和底層均變黃(A/A)，當鳥氨酸陽性時，如果肌醇陰性，鳥氨酸脫羧產鹼量要遠遠大於甘露醇發酵產酸量，因此無論甘露醇陽性與否，培養基的表層和底層均為紫色(K/K)，如果肌醇陽性，鳥氨酸脫羧產鹼量與肌醇發酵產酸量相差不多，無論甘露醇是否陽性，其培養基的PH值在5.2-6.5之間，會顯示一種黃色和紫色之間的過渡顏色(K/N或N/N)。另外，變形菌屬的細菌在該培養基上會產生一種特殊的生化反應，生成代謝產物靛基質丙酮酸，使培養基的表層變成紅色(R/K或R/A)。
根據標準菌株測試結果，氣單胞菌在該培養基上出現表層為紫色、底層為黃色、動力陽性、硫化氫陰性、吲哚陽性的特異反應模式，其他腸桿菌科、弧菌科的相關菌，除少數菌外，均不產生這樣的生化反應模式。為提高培養基的敏感程度，降低了蛋白腖用量，增加了色氨酸，使吲哚反應加快並容易觀察。為了使顏色反應明顯、穩定，調整了各主要成份的用量並增加了指示劑的含量。
應用本發明培養基，共檢查嗜水氣單胞菌、溫和氣單胞菌、簡氏氣單胞菌264株，符合氣單胞菌反應模式的262株，符合率為99.24％。另2株反應不符，經進一步檢查為鳥氨酸陽性、肌醇陰性、甘露醇陽性的氣單胞菌1株，鳥氨酸陰性、肌醇陰性、甘露醇陰性的氣單胞菌1株，它們是否是維羅那氣單胞菌和舒氏氣單胞菌或少見的嗜水氣單胞菌有待進一步鑑定。由標本經SS或麥康開初分離，可疑菌落直接接種本培養基，呈現氣單胞菌反應模式的197株。
經鑑定為氣單胞菌190株，符合率為96.54％，另7株複查為大腸艾希氏菌5株(2.54％)，成團腸桿菌2株(1.01％)。
在該培養基上，氣單胞菌的反應為表層紫色，底層黃色，根據顏色反應可排除腸桿菌科中的克雷伯氏菌、耶爾森氏菌、變形菌、普羅威登斯菌、摩根氏菌、沙雷氏菌等6個菌屬的細菌，結合動力、吲哚、硫化氫試驗結果，可進一步排除志賀氏菌、沙門氏菌、檸檬酸桿菌等3個菌屬的細菌。在艾希氏菌屬中，多數大腸艾希氏菌與氣單胞菌反應不一致。文獻中報告，大腸艾希氏菌有35％的菌株為烏氨酸陰性。因此，使用該培養基作菌屬鑑定，會遇到同氣單胞菌反應模式相同的大腸艾希氏菌。在腸桿菌屬的12個種中，除成團腸桿菌鳥氨酸陰性(87-99％)，在該培養基中出現與氣單胞菌相同的反應外，其他幾個種不會出現這種反應。我們鑑定的36株大腸艾希氏菌中有6株及所收集的4株成團腸桿菌與氣單胞菌有一致的反應模式。為排除這兩種菌、可挑取其表面培養基，做氧化酶試驗，若為陰性，即為腸桿菌科細菌，陽性即為氣單胞菌屬細菌。
該培養基可鑑別鄰單胞菌和弧菌屬中的常見細菌。由於該培養基未含有氯化鈉，除霍亂弧菌生長好，各項反應明顯外，副溶血弧菌等3個種生長較差，生化反應較遲緩。其中河弧菌的反應與氣單胞菌相類似，根據初分離用培養基的不同，結合耐鹽試驗，可做出初步鑑別。同時可以排除銅綠假單胞菌等非發酵革蘭氏陰性桿菌，該類細菌在本培養基上的生化反應，因對甘露醇氧化完全(或不氧化)，酸性產物少，培養基的顏色變化不大，且動力僅在表層可以觀察，與氣單胞菌容易鑑別。
為保證該培養基的各項反應特異、敏感，結果判定規範，建立了該培養基的質控菌株嗜水氣單胞菌，在培養基上為表層紫色，底層黃色，動力陽性，吲哚陽性，硫化氫陰性，肺炎克雷伯氏菌，在培養基表層、底層均為黃色，動力、吲哚、硫化氫陰性，弗氏檸檬酸桿菌，測定硫化氫反應為陽性。
總之，氣單胞菌屬鑑定培養基對氣單胞菌具有獨特的生化反應模式，對臨床上常見的氣單胞菌有特異的鑑定作用，對腸桿菌科、弧菌科臨床上常見的菌有明顯的鑑別作用，並可排除銅綠假單胞菌，僅與腸桿菌科的成團腸桿菌和部分大腸艾希氏菌有相似反應，與弧菌屬的河弧菌有類同反應，這些菌可結合初分離用培養基、氧化酶和耐鹽試驗加以鑑別。因此，該培養基作為氣單胞菌屬的鑑定培養基是較理想的。同時，對腸桿菌科各菌屬之間也有一定的初步鑑別作用。該培養基組成合理，特異性強，性能穩定，各項反應明顯，使用方便，製作工藝簡單。它的研製成功，對氣單胞菌所致腹瀉、食物中毒及多種感染的實驗診斷、流行病調查和指導臨床合理用藥有實用價值，對氣單胞菌的準確、快速鑑定和進一步提高陽性檢出率提供了可靠的方法。該培養基系國內首創，全部採用國產試劑，成本低，可節約外匯，使用方便、操作簡單，結果容易判定，推廣應用有一定的社會效益，適用於我國醫療、衛生防疫、商檢、獸檢等部門的廣泛應用。
下面結合實施例對本發明作進一步詳述。
實施例1本發明為一種氣單胞菌屬鑑定培養基，它的組成成份及其組成成份水溶液在百分比濃度下的有效範圍是L-鳥氨酸4.0-5.0、甘露醇0.07-0.10、肌醇0.5-1.0、瓊脂0.30-0.35、溴用酚紫0.0025-0.0035，肝蛋白腖0.45-0.55、酵母浸膏0.25-0.35、蛋白腖0.85-0.95、色氨酸0.09-0.11、硫代硫酸鈉0.035-0.045、檸檬酸鐵銨0.04-0.06。
所述的組成成份及其組成成份水溶液在百分比濃度下的最佳數值為蛋白腖0.5％、酵母浸膏0.3％、蛋白腖0.9％、色氨酸0.1％、L-鳥氨酸0.5％、甘露醇0.1％O 肌醇1.0％、硫代硫酸鈉0.04％、檸檬酸鐵銨0.05％、瓊脂3.2％，加蒸餾水96.27的水，調整PH值6.7，加入溴甲酚紫0.030％。
一種氣單胞菌屬鑑定培養基的製備方法，按照組成成份取肝蛋白腖0.45-0.55、酵母浸膏0.25-0.35、蛋白腖0.85-0.95、色氨酸0.09-0.11、L-鳥氨酸0.4-0.5、甘露醇0.07-0.10 肌醇0.5-1.0、硫代硫酸鈉0.035-0.045、檸檬酸鐵銨0.04-0.06、瓊脂3.0-3.5g，以上成份混合，加蒸餾水1000ml，加熱溶化，調整PH值6.7，加入溴甲酚紫0.025g，分裝到小試管，每管2ml，膠塞封口，121℃高壓滅菌1.2分鐘，4℃冰箱保存備用。
接種將收集的氣單胞菌和相關菌，用營養瓊脂純化培養後，挑取典型菌落，接種該培養基，37℃培養18-24h。氣單胞菌在該培養基上表層為紫色(鹼性)，底層為黃色(酸性)觀察動力和硫化氫後，加Kovacs試劑，觀察吲哚反應。臨床標本用SS或麥康開分離，挑取可疑單個菌落，穿刺接種該培養基，培養和結果觀察同上述。
數值鑑定按文獻操作和判定結果。
培養基的特異性用氣單胞菌屬細菌和相關細菌的標準菌株接種於該培養基，氣單胞菌在其表層為紫色(鹼性)、底層為黃色(酸性)、動力陽性、吲哚陽性、硫化氫陰性的獨特的生化反應模式，它與腸桿菌科、弧菌科中相關菌鑑別特徵見表1。
表1氣單胞菌及相關菌的標準菌株在本培養基上的反應特徵菌種株數表層 底層 硫化氫 動力 吲哚噴水氣單胞菌 7 KA- + +肺炎克雷伯氏菌2 AA- - -小腸結腸炎耶爾森氏菌 1 KN- - -弗氏檸檬酸桿菌a2 KA+ + -陰溝腸桿菌2 NN- + -大腸艾希氏菌 3 KK- + +粘質沙雷氏菌 2 NN- + -普通變形菌a1 RK+ + +摩氏摩根氏菌 1 RK- + +豬霍亂沙門氏菌a1 KK+ + -類志賀鄰單胞菌3 KK- + +霍亂弧菌 2 KK- + +銅綠假單胞菌b1 KK- + -注K紫色，A黃色，R褐紅色，N界於黃色和紫色之間，+陽性反應，-陰性反應，a硫化氫產生量大時，呈黑色，其反應易被掩蓋，b近原培養基顏色，動力在表面層觀察，(下同)。
培養基的穩定性各批培養基在使用前分別用嗜水氣單胞菌、肺炎克雷伯氏菌、弗氏檸檬酸桿菌測定其對鳥氨酸、動力、硫化氫、吲哚、肌醇、甘露醇的反應。對4℃冰箱保存至1個月、2個月、3個月、6個月的定型培養基，用嗜水氣單胞及其他幾種質控株檢驗其各項生化反應特徵。結果表明各批培養基生化性穩定，4℃保存6個月無異常反應出現。
臨床菌株鑑定實驗和考核嗜水氣單胞菌、溫和氣單胞菌、簡氏氣單胞菌共264株，符合氣單胞菌反應模式的262株，符合率99.24％，另2株菌的表層和底層均產鹼(K)，佔0.76％。對這2株菌進一步鑑定結果表明，一株為鳥氨酸陽性，另一株為甘露醇陰性。為進一步了解該培養基對氣單胞菌屬的鑑定效果，我們直接由初分離於SS或麥康開瓊脂上挑取的可疑菌落接種該培養基，符合氣單胞菌反應模式的197株(管)，經數值鑑定190株為嗜水氣單胞菌，符合率為96.45％，另7株(佔3.55％)經數值法鑑定5株為大腸艾希氏菌，2株為成團腸桿菌。氣單胞菌與臨床上常見的腸桿菌科中的11個菌屬、弧菌科的2個菌屬及銅綠假單胞菌在該培養基上的反應結果見表2。表2 臨床分離的氣單胞菌及相關菌在本培養基上的反應結果菌名 株數(386) 表層 底層 硫化氫 動力 吲哚 注嗜水氣單胞菌 261 KA(259) - ++(243) 2株底層為K溫和氣單胞菌 2 K A + --簡氏氣單胞菌 1 K A - -+肺炎克雷伯氏菌5 N A - --安鼻克雷伯氏菌1 A - - --小腸結腸炎耶爾森氏菌 2 K N - - 37℃培養，動力陰性大腸艾希氏菌 36 KK(30)- ++6株底層為A福氏志賀氏菌 13 K A - -- 紫色僅出現在表面宋內氏志賀氏菌3 K N - --普通變形菌2 R K + ++ 硫化氫量大時均變黑奇異變形菌3 R K + ++ 硫化氫量大時，均變黑彭氏變形菌1 R K + ++斯氏普羅威登斯菌 2 R K - ++摩氏摩根式菌 3 R K - ++粘質沙雷氏菌 1 N N - +-居泉沙雷氏菌 1 K N - +-深紅沙雷氏菌 2 N N - +-鼠傷寒沙門氏菌2 K K + -- 硫化氫量大時，均變黑乙型副傷寒沙門氏菌1 K K - +- 硫化氫量大時，均變黑傷寒沙門氏菌 1 K A + +- 硫化氫量少腸炎沙門氏菌 1 K K + +-產氣腸桿菌2 K N - +-成團腸桿菌4 K A - ++ (3)弗氏檸檬酸桿菌4 K A + +- 硫化氫量大時，均變黑霍亂弧菌 8 K K - ++副溶血弧菌6 K K - ++生長不良解藻酸弧菌1 K K - ++生長不良河弧菌3 K A - +-生長不良類志賀鄰單胞菌8 K K - ++銅綠佩單胞菌 6 K K - ++注內數字為符合該反應的株數實施例2本發明在能夠保證質量的前提下，成本最低，最容易推廣的配方蛋白腖0.45％、酵母浸膏0.25％、蛋白腖0.85％、色氨酸0.10％、L-鳥氨酸0.40％、甘露醇0.07％肌醇0.55％、硫代硫酸鈉0.04％、檸檬酸鐵銨0.045％、瓊脂0.32％，加蒸餾水96.27的水，調整PH值6.7，加入溴甲酚紫0.0030％用胰蛋白腖(0.9-1.1)可以替換蛋白腖(0.85-0.95)和色氨酸(0.09-0.11)，但是吲哚實驗顏色較淺，且成本高。
可以用檸檬酸鐵替換檸檬酸鐵銨，但是硫化氫產量小，不夠穩定。
本發明還可以採用另一種方法進行生產將上述原料混合後，烘乾、研磨至粒度為200-300目，避光、避潮封裝。
氣單胞是弧菌科的一個屬。該屬含8個中，即嗜水氣單胞、溫和氣單胞菌、豚鼠氣單胞菌、殺鮭氣單胞菌(無動力，含4個亞種)、中間氣單胞菌、舒氏氣單胞菌、嗜泉氣單胞菌和維羅那氣單胞菌。近年，國外學者又報告了尺骨氣單胞菌、簡氏氣單胞菌和異常嗜糖氣單胞菌3個新種。其中以嗜水氣單胞菌為優勢菌，其次是溫和氣單胞菌，其它幾個種少見。除維羅那氣單胞菌為鳥氨酸陽性外，其他的種均鳥氨酸陰性，除舒氏氣單胞菌外其他幾個種均發酵甘露醇。
本發明經中國科學院微生物研究所做技術鑑定，遼寧省衛生防疫站等四個單位的考核應用，一致認為該培養基對氣單胞菌屬細菌有獨特的生化反應模式，對腸桿菌科、弧菌科的相關菌屬可做出屬的鑑別，具有應用和推廣價值。
權利要求
1.一種氣單胞菌屬鑑定培養基，其特徵是它的組成成份及其組成成份水溶液在百分比濃度下的有效範圍是L-鳥氨酸0.4-0.5、甘露醇0.07-0.10、肌醇0.5-1.0、瓊脂0.30-0.35、溴用酚紫0.0025-0.0035。
2.根據權利要求1所述的一種氣單胞菌屬鑑定培養基，其特徵是所述的組成成份及其組成成份水溶液在百分比濃度下的有效成分還包括肝蛋白腖0.45-0.55、酵母浸膏0.25-0.35、蛋白腖0.85-0.95、色氨酸0.09-0.11、硫代硫酸鈉0.035-0.045、檸檬酸鐵銨0.04-0.06。
3.根據權利要求1所述的一種氣單胞菌屬鑑定培養基，其特徵是所述的組成成份及其組成成份水溶液在百分比濃度下的最佳有效值為肝蛋白腖0 5％、酵母浸膏0.3％、蛋白腖0.9％、色氨酸0.1％、L-鳥氨酸0.5％、甘露醇0.1％0 肌醇1.0％、硫代硫酸鈉0.04％、檸檬酸鐵銨0.05％、瓊脂3.2％，加蒸餾水96.27的水，調整PH值6.7，加入溴甲酚紫0.0030％。
4.一種氣單胞菌屬鑑定培養基的製備方去，其特徵是按照組成成份取肝蛋白腖0.45-0.55、酵母浸膏0.25-0.35、蛋白腖0.85-0.95、色氨酸0.09-0.11、L-鳥氨酸0.4-0.5、甘露醇0.07-0.10 肌醇0.5-1.0、硫代硫酸鈉0.035-0.045、檸檬酸鐵銨0.04-0.06、瓊脂3.0-3.5g，以上成份混合，加蒸餾水1000ml，加熱溶化，調整PH值6.7，加入溴甲酚紫0.025g，分裝到小試管，每管2ml，膠塞封口，121℃高壓滅菌1.2分鐘，4℃冰箱保存備用。
全文摘要
本發明涉及一種氣單胞菌屬鑑定培養基及其置備方法，它的組成成份及其組成成份水溶液在百分比濃度下的有效範圍是肝蛋白腖、酵母浸膏、蛋白腖、色氨酸、L－鳥氨酸、甘露醇、肌醇、硫代硫酸鈉、檸檬酸鐵銨、瓊脂，加蒸餾水，調整pH值6.7，加入溴甲酚紫。以上成份混合，加蒸餾水，加熱溶化，調整pH值6.7，加入溴甲酚紫，分裝到小試管，膠塞封口，高壓滅菌，4℃冰箱保存備用。本發明經中國科學院微生物研究所做技術鑑定，遼寧省衛生防疫站等四個單位的考核應用，一致認為該培養基對氣單胞菌屬細菌有獨特的生化反應模式，對腸桿菌科、弧菌科的相關菌屬可做出屬的鑑別，具有應用和推廣價值。
文檔編號C12N1/20GK1238383SQ9911300
公開日1999年12月15日 申請日期1999年6月9日 優先權日1999年6月9日
發明者劉彤, 刁映紅, 張波, 張萍, 姜媛 申請人:哈爾濱市道外區衛生防疫站