野生茄子耐鹽基因StNHX1及其抗除草劑植物表達載體的製作方法

2023-09-18 00:56:50

專利名稱：野生茄子耐鹽基因StNHX1及其抗除草劑植物表達載體的製作方法
技術領域：
本發明屬於分子生物學和生物技術領域，涉及了 一個野生茄子 iTorvumVigor' (Solanum torvum Swartz)耐鹽基因StNHXl基因及其抗除草劑植物表達載 體。
背景技術：
土壤鹽漬化對農業生產的威脅是一個全球性的熱點問題，也是當前我國農業經濟 發展所面臨的生態危機之一。鹽對於植物的毒害作用主要是由於水分虧缺導致的滲透脅 迫以及過量的Na+對重要生化過程的毒害。植物克服鹽脅迫的機制是Na+的外排和液泡 區室化。質膜Na+/H+反向轉運蛋白利用質膜H+-ATPase產生的跨膜質子梯度將Na+排出 細胞，減少Na+向葉片中的長距離轉運而保護光合組織免受鹽的毒害。液泡膜Na+/H+反向 轉運蛋白則利用液泡膜質子泵(H+-ATPase和H+-PPase)產生的跨膜質子梯度將Na+區室 化進入液泡，不僅減輕了過多Na+的累積對細胞質的毒害，而且可以利用NaCl作為溶質維 持滲透勢以驅動水分進入細胞。因此，Na+/H+反向轉運蛋白在植物耐鹽性中發揮著重要作 用。利用Na+/H+反向轉運蛋白耐鹽機理，將NHXl基因構建成植物表達載體轉化植物以提 高其耐鹽性，至2009年止，已獲得多種轉NHXl基因植物，如水稻(①Zhao F, Guo S，Zhang H, Zhao Y. Expression of yeast S0D2 in transgenic rice results in increasedsalt tolerance. Plant Sci. 2006,170 :216_224 ；② Verma D, Singla-Pareek SL, Rajagopal D, Reddy MK, Sopory SK. Functional validation of a novel isoform ofNa./H+antiporter from Pennisetum glaucum for enhancing salinity tolerance in rice.JBiosci. 2007, 32 :621-628)、小麥(Xue ZY，Zhi DY，Xue GP，Zhao YX, Xia GM. Enhanced salt tolerance of transgenic wheat(Triticum aestivum L.)expressing avacuolar Na./H+antiporter gene with improved grain yield in saline soils in the fieldand a reduced level of IeafNa+. Plant Sci. 2004，167 :849_859)、番茄(Zhang HX, Blumwald Ε.Transgenic salt-tolerant tomato plants accumulate salt in foliage but notin fruit. Nat Biotechnol. 2001，19 :765_768)、玉米(Yin XY, Yang AF, Zhang Kff, Zhang JR. Production and analysis of transgenic maize with improved salt toleranceby the introduction of AtNHXl gene. Acta Bot Sin. 2004，46 :854_861)等農作物，這些轉基因 植株在耐鹽性方面都有了很大的提高(Ashraf M,Akram NA. Improvingsalinity tolerance of plants through conventional breeding and genetic engineering Ananalytical comparison. Biotechnology Advances. 2009,27 :744_752)。bar 基因(bialaphos resistance gene)最早從 口及 7_K 鏈 β 菌 (Streptomycehygroscopicus)中分離得到的，其編碼產物膦絲菌素N-乙醯 轉移酶(phosphinothricin acetyltransferase, PAT)能使草丁膦有效成分 PPT(phosphinothricin)降解成乙醯化衍生物而失活。目前，已創製出一系列耐除草劑(如 草甘膦)作物，如大豆(Zhang Ζ,Xing A, Staswick P,Clemente Τ. The use of glufosinateas aselective agent in Agrobacterium—mediated transformation of soybean. Plant CellTissue Organ Culture, 1999，56 :37_46)、水稻(Toki S, Takamatsy S, Nojiri C. Expression of a maize ubiquitin gene promoter-bar chimeric gene in transgenic riceplants. Plant Physiol. 1992，100 :1503_1507)、小麥(梁輝，唐順學，張馳.提高小 麥基因槍法轉化頻率的研究.遺傳學報.1999，26 :643-648)、甘薯(Yi G，Shin YM, Choe G, Shin B, Kim YS, Kim M. Production of herbicide-resistant sweetpotatoplants transformed with the bar gene. Biotechnol Lett. 2007, 29 :669_675)等。

發明內容
本發明的目的是為解決提高農作物耐鹽性的問題，提供一種新的野生茄子耐鹽基 因 StNHXl。本發明的另一目的是為同時解決農作物耐鹽性及抗除草劑的問題，提供該耐鹽基 因StNHXl的抗除草劑植物表達載體及其構建方法。構建的野生茄子耐鹽基因StNHXl抗除 草劑植物表達載體可直接用於農桿菌介導的鹽敏感或除草劑敏感農作物遺傳轉化，創製耐 鹽、抗除草劑新種質，提高鹽敏感農作物的耐鹽性、賦予除草劑敏感農作物抗除草劑特性， 可用於農作物品種改良。本發明的技術問題可通過如下技術方案解決野生茄子耐鹽基因StNHXl (Na+/H+反向轉運蛋白基因)，該基因的序列為SEQ ID N0. 1。野生茄子耐鹽基因StNHXl抗除草劑植物表達載體，由本發明所述的野生茄子耐 鹽基因StNHXl與抗除草劑植物表達載體構成。其中，所述的抗除草劑植物表達載體優選中間載體PCAMBIA3301-121，該載體是通 過分別用 Hind III/EcoR I 雙酶切 pBI121 和 pCAMBIA3301,回收 pBI121 中 3005bp 的小片 段與PCAMBIA3301中11251bp的大片段，連接所述兩個片段得到的。野生茄子耐鹽基因StNHXl及其抗除草劑植物表達載體的構建方法，包括如下步 驟1)野生茄子耐鹽基因StNHXl的克隆選用野生茄子『Torvum Vigor'作為試驗材料，取幼嫩葉片，提取總RNA，取其2μ g 反轉錄cDNA，用RNase消化cDNA產物，根據NCBI上公布的番茄(Solanum lycopersicum) 耐鹽基因NHXl序列信息設計特異引物，在合成的野生茄子葉片cDNA中擴增StNHXl，PCR產 物純化後連接到PMD19-T載體上，命名為pMD19-StNHXl，BamH I/Sac I雙酶切、測序驗證；2)中間載體 pCAMBIA3301-121 的構建pBI121 和 pCAMBIA3301 分別 Hind III/EcoR I 雙酶切，回收 pBI121 中 3005bp 的 小片段與和PCAMBIA3301中11251bp的大片段(含有bar基因)，T4DNA連接酶連接，連接產 物轉化DH5a感受態細胞，質粒用AxyPr印質粒DNA小量試劑盒提取純化，Hind III/EcoR I雙酶切驗證，得到構建成功的中間載體PCAMBIA3301-121 (含有bar基因)；3) StNHXl 植物表達載體 pCAMBIA3301_StNHXl 的構建pMD19-StNHXl 與中間載體 pCAMBIA3301_121 分別 BamH I/Sac I 雙酶切，回收 pMD19-StNHXl 中 1605bp 的小片段與 pCAMBIA3301_121 中 12445bp 的大片段，用 T4DNA 連接酶連接，連接產物轉化DH5A感受態細胞，質粒用AxyPrep質粒DNA小量試劑盒提取純化，分 別BamH I/Sac I雙酶切、Hindlll/EcoR I雙酶切、Xho I單酶切驗證，得到構建成功的植物 表達載體pCAMBIA3301-StNHXl (含有bar基因)。有益效果1.本發明提供的野生茄子耐鹽基因StNHXl是一種新的耐鹽基因，該基因可提高 農作物耐鹽性。2.本發明將野生茄子耐鹽基因StNHXl克隆至含抗除草劑基因bar的中間載體 PCAMBIA3301-121中，構建的野生茄子耐鹽基因SNHXl抗除草劑植物表達載體為茄子中首 次報導，可直接用於農桿菌介導的鹽敏感或除草劑敏感農作物遺傳轉化，使轉基因農作物 具有抗除草劑特性並提高其耐鹽性，創製農作物耐鹽及耐除草劑新種質，對於進一步培育 耐鹽新品系提供重要理論基礎。野生茄子耐鹽基因StNHXl抗除草劑植物表達載體的構建 方法在創製耐鹽、耐除草劑作物方面具有廣闊的應用前景。


圖 lpMD19-StNHXl 質粒 BamH I/Sac I 雙酶切檢測，1 =DL 2，000DNA Marker (TaKaRa),2 :pMD19-StNHXl 質粒，3 :pMD19-StNHXl/BamH I/Sac I。圖 2pCAMBIA3301-121 中間載體 Hind III/EcoR I 雙酶切檢測，1 :DL 2，000DNA Marker (TaKaRa),2 1Kb Ladder DNA Maker (AXYGEN)，3 :pCAMBIA3301 質粒，4、5 :pCAMBIA3301-121/Hind III/EcoR I，6 :pBI121/Hind III/EcoR I,7、pCAMBIA3301/Hind III/EcoR I，8 :1Kb Ladder DNA Maker (AXYGEN)。圖 3pCAMBIA3301-StNHXl 質粒 BamH I/Sac I 雙酶切、Hind III/EcoR I 雙酶切及 Xho I單酶切檢測，1 :DL 2，000DNA Marker (TaKaRa),2、3、4、5 :pCAMBIA3301-StNHXl/BamH I/Sac I，6、7 :pCAMBIA3301-StNHXl/Xho I，8、9 :pCAMBIA3301-StNHXl/Hind III/EcoR I，10 =IKbp DNA Ladder Maker (TaKaRa)。圖4pCAMBIA3301-StNHXl植物表達載體質粒圖譜。
五具體實施例方式實施例1野生茄子耐鹽基因StNHXl的克隆選用野生茄子『Torvum Vigor，(Solanum torvum Swartz ；日本砧木品種，購自日 本Takii種苗株式會社)作為試驗材料，幼苗長至八片真葉時，IOOmmol · L^lNaCl脅迫處理3天，取幼嫩葉片，按照Total RNA提取試劑盒(TaKaRa)說明提取總RNA，取2 μ g總RNA 反轉錄cDNA(ReverTra Ace-a-TMcDNA合成試劑盒，東洋紡(上海)生物技術有限公司)； 根據 NCBI 上公布的番茄 NHXl 的序列信息(Access NO. :AJ306630. 1 ；Venema K, Belver A, Marin-Manzano MC, Rodriguez-Rosales MP, Donaire JP.A novel intracellular K+/ H+antiporter related toNa./H+antiporters is important for K+ionhomeostasis in plants. J Biol Chem. 2003，278 :22453_22459)，用 01igo6. O 引物設計軟體(德國 Merck 公 司)設計特異引物，上遊引物(F)序列為SEQ ID NO. 2，下遊引物(R)序列為SEQ ID NO. 3， 進行PCR反應，在野生茄子葉片cDNA中擴增StNHXl基因①利用上、下遊引物(F、R)以野生茄子cDNA為模板進行PCR反應，反應體系 (20 μ L) :ddH20 10. 2 μ L, 5 X Buffer 4μ L, dNTP (2. 5mmol · L-1) 1· 6 μ L，F (SEQID Ν0· 2)、 R(SEQ ID NO. 3)弓丨物(20 μ mol · L-1)各 1 μ L，cDNA( < 1 μ g) 1 μ L，DNA STAR 1 μ L ；PCR 擴增程序95°C預變性4min，93°C變性30s, 56. 8°C退火30s，72°C延伸100s，30個循環，再 72°C延伸 IOmin ；②PCR產物產物用凝膠回收試劑盒(AXYGEN，愛思進生物技術(杭州)有限公 司)純化後連接到PMD19-T載體(TaKaRa，寶生物工程(大連)有限公司)上，連接體系 (IOyL) :pMD19-T 載體 lyL，PCR產物 4yL，Solution I 5 μ L ;4°C過夜連接；連接產物(命 名為pMD19-StNHXl)轉化DH5 α感受態細胞(南京天為生物科技有限公司)，進行BamH I/ Sac I雙酶切驗證(圖1)和序列測定，序列如SEQ ID NO. 1所示，後續試驗中備用；實施例21)野生茄子耐鹽基因StNHXl的克隆同實施例1。2)中間載體 pCAMBIA3301-121 的構建pBI121 (Promega，普洛麥格(北京)生物技術有限公司)和pCAMBIA3301 (CAMBIA, 澳大利亞)分別Hind III/EcoR I雙酶切，回收pBI121中的小片段(3005bp)與 PCAMBIA3301中的大片段(11251bp)，按4 1的比例用T4DNA連接酶(TaKaRa)連接，命名 為PCAMBIA3301-121，連接產物轉化DH5a感受態細胞，提取質粒進行Hind III/EcoR I雙 酶切驗證，具體步驟如下①取pBI121 和 pCAMBIA3301 質粒各 10μ L，分別用 Hind III/EcoR I 雙酶切， 酶切反應體系(50 μ L) :ddH20 31. 5 μ L, IOXBuffer E 5 μ L, BSA 0· 5 μ L，ρΒΙ121 或 PCAMBIA3301 plasmid 10 μ L，Hind III(Promega)1. 5 μ L, EcoR I(Promega)1. 5 μ L ;37°C, 反應2h;酶切產物用凝膠回收試劑盒(AXYGEN)回收pBI121中的小片段(3005bp)與 PCAMBIA3301 中的大片段(Il25Ibp)。②回收得到的pBI121中的小片段(3005bp)與pCAMBIA3301中的大片段 (11251bp)按4 1的比例用T4DNA連接酶(TaKaRa)連接，連接體系(IOyL) :ddH20 3 μ L， ρΒΙ121 中的小片段(3005bp)4y L, pCAMBIA3301 中的大片段(11251bp) 1 μ L, IOXBuffer luL, T4連接酶IyL ;4°C，過夜連接；連接產物(命名為pCAMBIA3301_121)轉化DH5 α感 受態細胞，提取質粒後，Hind III/EcoR I雙酶切驗證(圖2)，得到構建成功的中間載體ρ PCAMBIA3301-121。3)植物表達載體 pCAMBIA3301-SNHXl 的構建pMD19-StNHXl 與中間載體 pCAMBIA3301_121 分別 BamH I/Sac I 雙酶切，回收 pMD19-StNHXl 中的小片段(1605bp)與 pCAMBIA3301_121 中的大片段(12445bp)，按 4 1的比例用T4DNA連接酶連接，連接產物轉化DH5 α感受態細胞，提取質粒後進行酶切驗證①取質粒pMD19-StNHXl 與中間載體 pCAMBIA3301_121 各 10 μ L，分別用 BamH I/Sac I 雙酶切，酶切反應體系(50 μ L) :ddH20 31. 5 μ L, IOXBuffer E 5 μ L, BSA 0·5 μ L，pMD19-StNHXl 或 pCAMBIA3301_121 plasmid 10 μ L, BamH I/(Promega)1· 5 μ L， Sac I (Promega) 1. 5 μ L ;37 °C，反應2h ；酶切產物用凝膠回收試劑盒(AXYGEN)回收 pMD19-StNHXl 中的小片段(1605bp)與 pCAMBIA3301_121 中的大片段(12445bp)。②回收得到的pMD19-StNHXl中的小片段(1605bp)與pCAMBIA3301_121中的 大片段(12445bp)按4 1的比例用T4DNA連接酶(TaKaRa)連接，連接體系(IOyL) ddH20 3 μ L, pMD19-StNHXl 中的小片段(1604bp)4y L, pCAMBIA3301_121 中的大片段 (12445bp)lyL,10XBuffer IyL, T4連接酶1 μ L ;4 °C，過夜連接；連接產物(命名為 PCAMBIA3301-StNHXl)轉化DH5 α感受態細胞，提取質粒後，分別BamH I/Sac I雙酶 切、Hind III/EcoR I雙酶切、Xho I單酶切驗證(圖3)，得到構建成功的植物表達載體 pCAMBIAl301-StNHXl (圖 4)。綜上所述，本發明構建的野生茄子耐鹽基因StNHXl基因及該基因的抗除草劑植 物表達載體pCAMBIA3301-StNHXl為茄子中首次報導，可直接用於農桿菌介導的鹽敏感或 除草劑農敏感作物遺傳轉化，提高鹽敏感農作物耐鹽性和賦予除草劑敏感農作物抗除草劑 特性，消除鹽鹼地逆境和除草劑對農作物的危害，可進行農作物品種改良。
權利要求
野生茄子耐鹽基因StNHX1，其特徵在於該基因的序列為SEQ ID NO.1。
2.野生茄子耐鹽基因StNHXl抗除草劑植物表達載體，其特徵在於由權利要求1所述的 野生茄子耐鹽基因StNHXl與抗除草劑植物表達載體構成。
3.根據權利要求2所述的野生茄子耐鹽基因StNHXl抗除草劑植物表達載體，其特 徵在於所述的抗除草劑植物表達載體為分別用Hind III/EcoR I雙酶切質粒pBI121和 PCAMBIA3301,回收pBI121中的3005bp的小片段與pCAMBIA3301中的11251bp的大片段， 連接所述的兩個片段得到的中間載體PCAMBIA3301-121。
4.權利要求3所述的野生茄子耐鹽基因SNHXl抗除草劑植物表達載體的構建方法，其 特徵在於包括如下步驟1)野生茄子『TorvumVigor』耐鹽基因StNHXl的克隆選用野生茄子『Torvum Vigor』作為試驗材料，取葉片，提取總RNA，反轉錄得到cDNA， 用RNase消化cDNA產物，根據NCBI上公布的番茄耐鹽基因NHXl序列信息設計特異引物， 在合成的野生茄子葉片cDNA中擴增StNHXl，PCR產物純化後連接到pMD19_T載體上，命名 為 pMD19-StNHXl，BamH I/SacI 雙酶切、測序驗證；2)中間載體pCAMBIA3301-121的構建PBI121 和 pCAMBIA3301 分別 Hind III/EcoR I 雙酶切，回收 pBI121 中 3005bp 的 小片段和PCAMBIA3301中11251bp的大片段，T4DNA連接酶連接，連接產物轉化DH5 α感 受態細胞，質粒經提取純化後，Hind III/EcoR I雙酶切驗證，得到構建成功的中間載體 PCAMBIA3301-121 ；3)StNHXl植物表達載體pCAMBIA3301-StNHXl的構建pMD19-StNHXl 與中間載體 pCAMBIA3301_121 分別 BamH I/Sac I 雙酶切，回收 pMD19-StNHXl 中 1605bp 的小片段與 pCAMBIA3301_121 中 12445bp 的大片段，用 T4DNA 連接酶連接，連接產物轉化DH5 α感受態細胞，質粒經提取純化後，分別BamH I/Sac I 雙酶切、Hind III/EcoR I雙酶切、Xho I單酶切驗證，得到構建成功的植物表達載體 PCAMBIA3301-StNHXl ο
全文摘要
本發明屬於分子生物學領域，公開了野生茄子耐鹽基因StNHX1及其抗除草劑植物表達載體。本發明所述的野生茄子耐鹽基因StNHX1序列為SEQIDNO.1。該基因的抗除草劑植物表達載體是將StNHX1基因插入到中間載體pCAMBIA3301-121的BamHI/SacI酶切位點間得到的。該植物表達載體轉化農作物後將會使其具有抗除草劑特性並可提高其耐鹽性，對提高我國農作物分子育種的技術水平具有重要理論和實踐意義。
文檔編號C12N15/66GK101974538SQ20101052257
公開日2011年2月16日 申請日期2010年10月28日 優先權日2010年10月28日
發明者朱月林, 楊立飛, 蓋鈞鎰, 陳國戶 申請人:南京農業大學