用於蛋白質純化的吸附劑的製作方法

2023-04-29 22:50:31

專利名稱：：用於蛋白質純化的吸附劑的製作方法
技術領域：
：本發明涉及化合物及其作為親和配體用於蛋白質純化的用途。
背景技術：
：抗體是具有基本單體結構單元的免疫球蛋白糖蛋白。所述單體是由四條多肽鏈(其中兩條是相同的重鏈，兩條是相同的輕鏈，通過二硫橋相連)組成的Y形蛋白質。存在五種不同類型的重鏈(Y、ft、《、s和5)，它們可用於區分免疫球蛋白的種類(分別是IgG、IgM、IgA、IgD和IgE)。還存在由不同基因產物所產生的兩種不同類型的輕鏈U和K)。IgG(大小約150kD的單體免疫球蛋白)提供了對抗入侵病原體的基於抗體的免疫性，由於IgG在體內對特異性抗原具有高度特異性，因此它是免疫學研究和臨床診斷中最常用的試劑。單克隆抗體(本文中稱為Mab)是對單一抗原具有相同特異性的抗體，其由單一克隆細胞所形成的細胞系所產生。Mab構成了生物藥品產業中增長最迅速的部分，估計到2010年其銷售額將達到300億美元(美國)。在近20年來，來自哺乳動物細胞培養物的抗體效價持續增加，需要可替代的下遊技術和色譜吸附劑來解決Mab處理中的方法瓶頸。抗體片段(整個抗體分子的部分)提供了優於整個抗體的幾個優點。它們更易於生產且更具成本效益，由於缺乏Fc(重鏈)區，它們通過降低細胞因子釋放的風險以及與之相關的毒性而在患者中具有較少的副作用，可將其進行修飾以包含治療性有效負載。存在幾種類型的抗體片段，其或者是通過特異性內肽酶的酶消化而製備的IgG結構域或者其是在細胞系中通過基因工程而得到的。這些抗體片段包括單價片段如Fab，、Fab和scFv;二價片段如F(ab，)2二聚體抗體(diabody)和微型抗體(minibody);以及多價片段如三聚體抗體(triabody)和四聚體抗體(tetrabody)。有多種抗體片段產品正處在用作治療劑或用於診斷的開發當中。預塊成象應用)中60億美元(美國)的重要份額(Holliger,P.,&HudsonP.J"iV化醜/Wedi23(9;2005)1126-1136)。大多數抗體片段產品缺乏蛋白A結合位點，因此與完整鏈的抗體不同，其不能通過蛋白A親和色鐠進行純化。在大多數情況下，常規色鐠技術用於純化抗體片段。蛋白L是一種源自大消化鏈球菌(i^/7toW/^/^ococcws附"gwMS)屬細菌的分子量為35000道爾頓的蛋白質，已知其與抗體輕鏈結合，並且已對其用於純化一些抗體片段進行了研究，但並不認為蛋白L是有成本效益的，且其不能以商業量而得到。WO97/10887公開了可用作親和吸附劑的式I的基於三溱的化合物其中R是H、烷基、羥烷基、環己基、NH2、苯基、萘基、l-苯基吡唑、吲唑、苯並噻唑、苯並嗯唑或苯並咪唑，其中任一所述芳族基團均可被烷基、烷氧基、醯氧基、醯氨基、氨基、NH2、OH、C02H、磺醯基、氨基甲醯基、氨磺醯基(sulphamoyl)、烷基磺醯基和卣素中的一個或多個所取代；一個X是N，另一個X是N、C隱C1或C-CN;Y是O、S或NRsZ是O、S或,；R2和R3各自是H、烷基、羥烷基、爺基或p-苯基乙基；Q是苯、萘、苯並噻唑、苯並嗯唑、l-苯基吡唑、吲唑或苯並咪唑；R4、Rs和R6各自是H、OH、烷基、烷氧基、氨基、NH2、醯氧基、醯基氨基、C02H、磺酸、氨基曱醯基、氨磺醯基、烷基磺醯基或卣素；n是06jp是020;和A是任選地通過間隔基(spacer)連接到含有X的環上的載體基質。公開了式I化合物對蛋白質(比如免疫球蛋白、胰島素、VII因子或人生長激素)具有親和力。在WO00/67卯0和WO03/097112中公開了具有相關結構的化合物。它們對內毒素具有親和力。WO97/10887中所公開的某些基於三溱的化合物對免疫球蛋白具有親和力。顯示這種親和力的化合物的一個實例是式II的化合物例如II的化合物能夠從複雜混合物或原料(比如人血漿)中特異性地除去免疫球蛋白。另一種類型的常見的原料是工業上生產的細胞培養上清，其中單克隆抗體以高達5g/l上清的濃度而存在。例如II的化合物還可用於從這些混合物中特異性地除去單克隆抗體，儘管已知其性能因細胞培養添加劑(比如普流尼克F-68(PluronicF-68))的存在而受到影響。普流尼克F-68是哺乳動物細胞培養中常用的消泡劑。其為聚氧乙烯和聚氧丙烯的嵌段共聚物，分子量為約8000道爾頓。普流尼克F-68用於保護細胞免受剪切和氣泡的損傷，通常以量為1g/L用於細胞培養上清中。其存在可降低或消除例如II的化合物除去這些原料中的免疫球蛋白的能力，這代表了利用這些配體從哺乳動物細胞培養基中直接捕獲單克隆抗體的相當大的障礙。
發明內容出乎意料地，發現某些化合物(其中許多均是新的)甚至在存在化合物比如普流尼克F-68的情況下可用於免疫球蛋白(包括但不限於單克隆抗體和抗體片段)的基於親和力的純化。用於本發明的化合物是式III的化合物其中A是H、烷基、芳基、羥烷基、環己基、氨基或雜環基，例如萘基、l-苯基吡唑、吲唑、苯並噻唑、苯並嗯唑或苯並咪唑，其中任一所述芳族基團均可包含另一個稠合的環並且可被烷基、芳基、烷氧基、芳氧基、醯氧基、醯氨基、氨基、OH、C02H、磺醯基、氨基曱醯基、氨磺醯基、烷基磺醯基和卣素中的一個或多個所取代；一個X是N，另一個X是N、C-C1或C-CN;Y是O、S或NR2;Z是O、S或NRs;R2和R3各自是H、烷基、羥烷基、苄基或p-苯基乙基；Q是苯、萘、苯並噻唑、苯並嗯唑、l-苯基吡唑、吲唑或苯並咪唑；R4、Rs和R6各自是H、OH、烷基、芳基、雜環基、烷氧基、芳氧基、氨基、醯氧基、醯氨基、C02H、磺酸、氨基甲醯基、氨磺醯基、烷基磺醯基或卣素，或者R4、Rs和R6中的兩個或多個相連接形成環狀結構；U和V是相同或不同的d-K)直鏈亞烷基，其任選地被羥基、烷基、芳基、羥烷基、p-苯基乙基和卣素中的一個或多個所取代，比如CHOH;以及A是任選地通過間隔基連接到含有X的環上的載體基質。此外，本發明的化合物包括對應的配體，其中A被直接或間接與三喚環相連的官能團所替代，所述官能團可被固定到載體基質上。在下文中，術語"配體"和"吸附劑"可互換使用。實施方式WO97/10887、WO00/67卯0和WO003/097112公開了如何在固體栽體上構建配體組合文庫。它們的公開內容(包括與本發明共同的實施方案和方法的實施例)通過參考併入本文。在利用含有白蛋白、免疫球蛋白和普流尼克F-68的原料篩選一套這些組合文庫的過程中，多種配體被鑑定為能夠選擇性結合和洗脫免疫球蛋白。可通過本領域技術人員公知的方法製備用於本發明的式III化合物。這些方法描述於上述的3篇PCT公開文獻中；可容易地採用它們來製備新化合物。在用於本發明的化合物中，優選&和/或QR4R5R6是環狀結構或者包含環狀結構；任一個或每個環狀結構優選具有OH或S03H取代基。優選地，每個X均是N。另夕卜，優選U和/或V被取代，例如是CHOH。這些被取代的化合物均是新的。本發明優選的結合免疫球蛋白的配體或吸附劑是式IV-XIII的那些formulaseeoriginaldocumentpage10本文中所述的結合免疫球蛋白的配體可用於從複雜混合物中純化免疫球蛋白，所述複雜混合物包括但不限於人血漿和重組發酵上清。下述實施例2中利用多種原料通過色鐠實驗證實了該實用性。本文中使用術語"免疫球蛋白"來描述完整的免疫球蛋白本身(包括IgG、IgA、IgM和IgE)以及具有免疫球蛋白的功能或結構特性(例如根據與本文中所述給定化合物的親和力)的類似物。因此，分析物可以是作為免疫球蛋白的功能片段的蛋白質，或具有一個、多個或全部相同結合位點的結構類似物，或融合蛋白。任選的連接子可包括將本發明的配體與載體基質相連接並使所述配體與所述載體基質表面間隔開的任何方式。所述載體基質可包含任何材料，可溶性或不溶性的、顆粒或非顆粒(包括纖維和膜)、多孔或非多孔的。其提供了一種將本發明的配體從接觸溶液的溶質中分離出來的便利方法。載體基質和任選的連接子A的實例包括碳水化合物基質(比如瓊脂糖、纖維素、葡聚糖、澱粉、藻酸鹽或角叉菜膠)、合成聚合物基質(比如聚苯乙烯、苯乙烯-二乙烯基苯共聚物、聚曱基丙烯酸酯(例如聚(羥乙基甲基丙烯酸酯))、聚乙烯醇、聚醯胺或全氟化碳)、無機基質(比如玻璃、二氧化矽或金屬氧化物)以及複合材料。以下實施例舉例說明本發明。實施例1-吸附劑的合成所述類型吸附劑的合成在WO97/10887、WO00/67卯0和WO003/097112中做了i兌明。描述了吸附劑XI的合成，該合成具有代表性。將6%交聯PuraBead瓊脂糖凝膠(650g，置於RO水中)與RO水(650mL)、10M氫氧化鈉(NaOH)(88mL)和表氯醇(124mL)一起調漿。攪拌所述漿19小時以上。然後再加入10M氫氧化鈉(NaOH)(22mL)、表氯醇(37mL)，並攪拌所述漿1.5小時以上。在取出樣品供分析後，過濾漿，然後以RO水(12xlL)洗滌。環氧基的分析表明每g已沉降凝膠被21.6nmol環氧基衍生化。在加入RO水(780mL)和0.88比重的氨水溶液(200mL)之前將所述凝膠的溶劑排空。將混合物攪拌並加熱至40'C，然後在此溫度下攪拌16小時以上。在取出樣品供分析後，過濾漿，然後以12xlLRO水洗滌(12xlL)。胺基的TNBS分析表明每g已沉降凝膠被20.8nmol胺基衍生化。將已沉降的胺化凝膠(475g)在1M磷酸鉀(475mL)中調漿並使之沉降。然後加入1M磷酸鉀(140mL),劇烈攪拌混合物，加入丙酮(70mL)。在一次性地全部加入在冷丙酮(120mL)中的氰尿醜氯(11.9g)之前，將混合物在冰鹽浴中冷卻至0'C。將漿在0-4。C攪拌1小時以上，之後排水，然後用50%v/v丙酮水溶液(5x500mL)、RO水(5x500mL)、50%v/v丙酮7JC溶液(5x500mL)和RO7JC(10x500mL)洗滌。分析表明每g已沉降凝膠上連接了25nmol二氯三嗪基。將二氯三溱基瓊脂糖(50g)在RO水(55mL)中調漿。將鹽酸去甲苯福林(1.99g)溶於RO水(15mL)中，加入10MNaOH(0.95mL)，在將所述混合物加入到二氯三溱基瓊脂糖中之前，在冰上冷卻混合物。使混合物在60'C反應19小時以上。在將凝膠貯存於冷室中20%乙醇水溶液中之前，用50%DMF(5x100mL)、ROK(5x100mL)、0.1MHC1(5x100mL)、30%IPA/0.2MNaOH(5x100mL)、RO水(10x100mL)、和20%乙醇水溶液(3x100mL)洗滌凝膠。實施例2-色鐠法利用表l中列出的每種吸附劑進行色譜實驗。對所有實驗來說，使用床高5.5cm、柱體積(CV)4.3mL、直徑1cm的柱，其中線性流速為300cm/小時。最初用10CV的pH7.4的磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)平衡吸附劑，然後負載下述樣品純IgG、IgG原料1(1g/LIgG、1g/L普流尼克F-68、以及其它蛋白質以模擬細胞培養上清)或IgG原料2(1g/LIgG、1g/L普流尼克F-68並含有5%胎牛血清)、或濃度高達30g/L吸附劑的鼠IgGi原料。然後在用5CVpH3.5的50mM檸檬酸洗脫IgG之前，用10CVpH7.4的PBS洗滌吸附劑。然後將吸附劑用5CV0.5M氫氧化鈉進行原位清洗(CIP)，然後用7CVpH7.4的PBS進行重新平衡。在色鐠實驗後，通過濁度法、A280、HPLC或GPC評價負載物(load)、負載後洗滌液、洗脫液和CIP級分中的IgG含量以評價結合能力和洗脫能力，通過SDSPAGE分析以評價純度。結合能力和洗脫能力歸納於表l中。純IgG原料在pH7.4的PBS中含有1g/L多克隆IgG，並且存在或不存在1g/L普流尼克F-68。模擬品原料1含有在CHO細胞培養基中的1g/L多克隆IgG、1g/L馬肌紅蛋白、5g/L人血清白蛋白和1g/L普流尼克F-68。模擬品供料原料2含有在CHO細胞培養基中的1g/L多克隆IgG、5%胎牛血清和1g/L普流尼克F-68。表ltableseeoriginaldocumentpage14洗脫緩沖液50niMpH3.5的檸檬酸,含有30%乙二醇和Na('l為評價所述材料的純化能力，還研究了吸附劑XI的色鐠性能。使用床高2.5cm、柱體積(CV)2.0mL、直徑1cm的柱完成實驗，其中線性流速為50cm/小時(保留時間3分鐘)。最初用10CVpH7.4的磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)平衡吸附劑。向柱上加載60mL在CHO(中國倉鼠卵巢)細胞培養上清中的IgGi至濃度為54g/L吸附劑。然後在用5CVpH3.0的50mM杼檬酸鈉洗脫IgG之前，用10CVpH7.4的PBS洗滌吸附劑。然後將吸附劑用5CV0.5M氫氧化鈉進行原位清洗(CIP),然後用7CVpH7.4的PBS進行重新平衡。在整個色語過程中收集級刺2mL)並分析IgG含量(蛋白AHPLC)、DNA含量(Picogreen分析)和總蛋白質(Bradford總蛋白質測定)。IgG!對吸附劑XI的突破曲線(breakthroughprofile)表明結合能力為21.6g/L，洗脫能力為20.9g/L。利用凝膠滲透色譜，被洗脫的IgG的純度測定為92.8%，吸附劑XI的DNA清除率為2個對數級。利用吸附劑XI，使用通過酶(胃蛋白酶)消化而製備的抗體片段完成色譜實驗。胃蛋白酶是僅在酸性PH下有活性而在中性或鹼性pH下則不可逆地變性的非特異性內肽酶。胃蛋白酶消化導致形成一個F(ab，)2片段和Fc片段的幾個小肽。通過使IgG與胃蛋白酶在pH4.0下於37。C接觸1小時而製備人、綿羊和牛多克隆抗體的片段(混合的抗體群)。通過調節pH到7.0以上而停止消化，通過凝膠過濾分離F(ab，)2片段。研究吸附劑XI的色鐠性能以評價用於抗體片段的材料的純化能力。使用床高2.511、柱體積(CV)2.0mL、直徑1cm的柱完成實驗，其中線性流速為50cm/小時(保留時間3分鐘)。最初用10CVpH7.4的磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)平衡吸附劑。每mL吸附劑負栽約20mgF(ab，)2片段。然後在用5CVpH3.0的50mM檸檬酸鈉洗脫所述片段之前，用10CVpH7.4的PBS洗滌吸附劑。然後將吸附劑用5CV0.5M氫氧化鈉進行原位清洗(CIP)，然後用7CVpH7.4的PBS進行重新平衡。所有實驗的對照均是蛋白質L吸附劑(使用與吸附劑XI相同的實驗條件)。收集來自色鐠柱的每個級分並利用Western印跡技術進行分析。該技術表明吸附劑XI與人的k和X輕鏈以及綿羊和牛的F(ab，)2片段結合；蛋白質L僅與人的k輕鏈結合而不與綿羊和牛的片段結合。權利要求1.親和吸附劑用於蛋白質物質的分離、去除、離析、純化、表徵、鑑定或定量的用途，其中所述親和吸附劑是式III的化合物其中R1是H、烷基、芳基、羥烷基、環己基、氨基或雜環基，其任選地被烷基、芳基、烷氧基、芳氧基、醯氧基、醯氨基、氨基、OH、CO2H、磺醯基、氨基甲醯基、氨磺醯基、烷基磺醯基和滷素中的一個或多個所取代；一個X是N，另一個X是N、C-Cl或C-CN；Y是O、S或NR2；Z是O、S或NR3；R2和R3各自是H、烷基、羥烷基、苄基或β-苯基乙基；Q是苯、萘、苯並噻唑、苯並噁唑、1-苯基吡唑、吲唑或苯並咪唑；R4、R5和R6各自是H、OH、烷基、芳基、雜環基、烷氧基、芳氧基、氨基、醯氧基、醯氨基、CO2H、磺酸、氨基甲醯基、氨磺醯基、烷基磺醯基或滷素，或者R4、R5和R6中的兩個或多個相連接形成環狀結構；U和V是相同的或不同的C1-10直鏈亞烷基，其任選地被羥基、烷基、芳基、羥基烷基、β-苯基乙基和滷素中的一個或多個所取代；並且A是任選地通過間隔基連接到含有X的環上的載體基質。2.權利要求l的用途，其中&和/或QR4RsR6是環狀結構或者包含環狀結構。3.權利要求2的用途，其中任一個或每個環狀結構具有OH或S03H取代基。4.根據前述權利要求中任一項的用途，其中U和V中任一個或每一個是CHOH。5.根據前述權利要求中任一項的用途，其中每個X均是N。6.權利要求l的用途，其中所述吸附劑是式III化合物。7.權利要求l的用途，其中所述吸附劑是式IV化合物。8.權利要求l的用途，其中所述吸附劑是式V化合物。9.權利要求l的用途，其中所述吸附劑是式VI化合物。10.權利要求l的用途，其中所述吸附劑是式VII化合物。11.權利要求l的用途，其中所述吸附劑是式VIII化合物。12.權利要求l的用途，其中所述吸附劑是式IX化合物。13.權利要求l的用途，其中所述吸附劑是式X化合物。14.權利要求l的用途，其中所述吸附劑是式XI化合物。15.根據前述權利要求中任一項的用途，其中所述蛋白質物質是免疫球蛋白、免疫球蛋白片段或蛋白質。16.權利要求15的用途，其中所述物質是單克隆抗體。17.權利要求15的用途，其中所述物質是選自Fab、Fab，、F(ab，)2、scFV、二聚體抗體、微型抗體、三聚體抗體和四聚體抗體片段的免疫球蛋白片段。18.根據前述權利要求中任一項的用途，其中所述蛋白質物質處於細胞培養物中。19.根據前述權利要求中任一項的用途，其中所述蛋白質物質與消泡劑相聯合。20.權利要求19的用途，其中所述消泡劑是聚氧乙烯和聚氧丙烯的嵌段共聚物。21.如權利要求1至14中任一項所定義的式III化合物，其中U和/或v被取代。22.權利要求21的化合物，其中所述取代基是OH、芳基或滷素。23.權利要求21的化合物，其中U和/或V是CHOH。全文摘要本發明描述了親和吸附劑用於蛋白質物質的分離、去除、離析、純化、表徵、鑑定或定量的用途，其中所述親和吸附劑是式(III)的化合物，其中R1是H、烷基、芳基、羥烷基、環己基、氨基或雜環基，其任選地被烷基、芳基、烷氧基、芳氧基、醯氧基、醯氨基、氨基、OH、CO2H、磺醯基、氨基甲醯基、氨磺醯基、烷基磺醯基和滷素中的一個或多個所取代；一個X是N，另一個X是N、C-Cl或C-CN；Y是O、S或NR2；Z是O、S或NR3；R2和R3各自是H、烷基、羥烷基、苄基或β-苯基乙基；Q是苯、萘、苯並噻唑、苯並噁唑、1-苯基吡唑、吲唑或苯並咪唑；R4、R5和R6各自是H、OH、烷基、芳基、雜環基、烷氧基、芳氧基、氨基、醯氧基、醯氨基、CO2H、磺酸、氨基甲醯基、氨磺醯基、烷基磺醯基或滷素，或者R4、R5和R6中的兩個或更多個相連接形成環狀結構；U和V是相同的或不同的C1-10直鏈亞烷基，其任選地被羥基、烷基、芳基、羥基、烷基、β-苯基乙基和滷素中的一個或多個所取代；以及A是任選地通過間隔基連接到含有X的環上的載體基質。文檔編號C07D251/48GK101415692SQ200780011865公開日2009年4月22日申請日期2007年3月2日優先權日2006年3月2日發明者凱利·萊裡克,海倫·塔頓,詹森·理察·貝特利,馬修·韋布申請人:普羅米蒂克生物科學有限公司