改性大孔聚乙烯醇樹脂及分離和純化中草藥多糖的方法

2023-04-30 10:34:56 1

專利名稱：改性大孔聚乙烯醇樹脂及分離和純化中草藥多糖的方法
技術領域：
本發明涉及分離樹脂的製備和中草藥有效成分的提取領域，具體是改性大孔聚乙烯 醇樹脂及分離和純化中草藥多糖的方法。本發明涉及的樹脂可以簡單、有效地去除中草 藥中粗多糖中的蛋白、色素等，從而對粗多糖達到分離和純化的目的。
背景技術：
多糖(polysaccharide)又稱為多聚糖，分子量一般在數萬到數百萬，廣泛存在於動 物細胞膜，植物和微生物細胞壁中，是由醛糖或酮糖通過糖苷鍵連接在一起的多聚物。 到目前為止，已有300多種多糖類化合物從天然產物中被提取出來，其中從中草藥中 獲得的水溶性多糖最為重要，已發現有100多種中草藥中的多糖類化合物具有免疫促 進作用，如甘草多糖、香菇多糖、枸杞多糖、靈芝多糖、黃芪多糖等。中草藥多糖具 有很強的生理活性，藥理研究與臨床應用表明，中藥多糖具有免疫調節、抗腫瘤、抗炎、 抗病毒、抗氧化、抗輻射、降血糖、降血脂、保肝等多種功能，受到越來越多的重視。 己經有不少多糖類藥物應用於臨床，也有很多多糖類保健品的出現。
由於中草藥多糖較高的生理活性，很好的治療和保健功能，因此，中草藥多糖的提
取受到了更多地重視。
中草藥多糖的常規提取方法有煎煮法、水蒸餾法、溶劑浸提法等，其提取時間長， 影響提出率。隨著現代科學的發展，超臨界萃取、超聲、微波、超濾、凝膠電泳分離、 真空冷凍乾燥提取分離等新技術，已經應用到中藥及其天然植物研究生產領域中。這些 新技術的應用使多糖的提取更為簡便和快捷，提高了提出率，縮短了提取時間，節約了 溶劑。
以上這些提取和分離方法大都需要經過水提、醇沉、脫蛋白、脫色、脫鹽等複雜步 驟，而且都需要用到大量的有機溶劑如石油醚、氯仿、乙醇、丙酮等，整個過程耗時較 長，資源和能源耗費較大，而且會產生汙染，環境不友好。這些大大限制了中草藥多糖 的生產和應用。
甘草(GlycyrrhizauralcnsisFisch)是豆科甘草屬的多年生草本植物，使傳統常用中藥，
味甘、性平，歸心、肺、脾、胃經。它具有清熱解毒，健脾補氣，潤肺止咳，調和藥性 之功效。其有效成分主要為甘草多糖、三萜皂苷類化合物(甘草酸、甘草次酸)和甘草黃 酮等。其中的甘草多糖(Glycyrrhizepolysaccharide)經藥理研究表明具有免疫調節作用， 能抑制變態反應，並具有較強的抗腫瘤作用和抗病毒作用，而且無細胞毒性，是一種較 好的生物活性多糖。
靈芝(Ganoderma lucidum)為多孔菌科真菌靈芝的子實體，在我國作為藥物已有 2000多年的歷史。靈芝的有效成分非常豐富，目前已知的有多糖、麥角字醇、三萜類、
蛋白質、胺基酸、多肽、等十大類，150多種。靈芝多糖(Ganoderma lucidum polysaccharides，GLP)是由肽多糖、葡聚糖、雜多糖等多糖均一體組成的混合物，是靈
芝中的最主要的生理活性成分。目前分離到的靈芝多糖達2oo種之多，大部分為e型葡
聚糖，分子量從數千到數萬不等，不溶於高濃度乙醇，可在熱水中溶解。靈芝多糖的藥 理活性主要取決於多糖中的糖苷鍵和立體結構，其中以e- (1—3) 、 (1—6)連接或 e- (1—4) 、 (1—6)的糖苷鍵活性較高。
現代藥理和臨床研究證明，GLP具有廣泛的藥理活性,具有提高機體免疫力、抗腫瘤、 消除機體內自由基、抗輻射、提高肝臟解毒功能等作用，能使人體產生抗體及幹擾素, 可治療高血壓、高血脂、糖尿病、B型肝炎等多種現代醫學中的疑難病症。

發明內容
本發明的目的是提供一種改性大孔聚乙烯醇樹脂及分離和純化中草藥多糖的方法。 用本發明的樹脂，同時成功地對中草藥粗多糖進行了分離和純化，可得到純度較高的多 糖產品，純度大於80%。不使用到其它的有機溶劑，環境友好。操作過程簡單，資源及 能源耗費少。
本發明提供的改性大孔聚乙烯醇樹脂，平均粒度20-120目，它是將聚乙烯醇(醋酸 乙烯酯與異氰尿酸三烯丙酯的共聚物；交聯度為30%，醇解度卯％)微球樹脂進行改性 製備的，聚乙烯醇微球樹脂(天津歐瑞生物科技有限公司生產)首先在鹼性條件下和環 氧氯丙烷反應，帶上活性功能基團環氧基，然後在鹼性條件下和三甲胺、三乙胺或二乙 烯三胺等反應，從而帶上陰離子功能基團，再經蒸餾水洗淨即可。具體製備方法包括的 步驟
1) 40-50。C下，在l-3M的NaOH溶液中，20-120目的聚乙烯醇樹脂微球(交聯度 為30%，醇解度90%)和1-4倍體積的環氧氯丙垸反應3-5h，用水洗淨，抽乾，得到活 化的微球，環氧基團含量為80-200 umol/g。
2) 在l-3M的NaOH溶液中，活化的聚乙烯醇微球和1-4倍體積的三甲胺或三乙胺 (聚乙烯醇微球與試劑體積比)等反應10h，反應溫度40-50°C，水洗淨得到球形、多
孔狀聚乙烯醇樹脂微球，備用。
本發明提供的改性大孔聚乙烯醇分離樹脂分離和純化中草藥粗多糖的方法包括的 步驟
1) 取中草藥粗多糖用水配成0.1-10mg/ml的溶液，過濾除去少量不溶性沉澱得粗多 糖清夜；
2) 將改性聚乙烯醇樹脂裝入分離柱中，將1)的清液以1-5床體積/小時的流速過 分離柱，接收分離液，分別檢測接收液和上樣液中的多糖、蛋白和色素。
3) 分離液經冷凍乾燥，得到白色多糖粉末。 所述的中草藥粗多糖重量與樹脂的體積是0.5~4: 20。
所述的樹脂柱徑和柱高比為1: 5~20。
本發明所涉及的多糖為普通中草藥粗多糖甘草多糖、黃茛多糖、靈芝多糖、香燕 多糖和人參多糖等，粗多糖純度可在10-50%之間不等。粗多糖用蒸餾水作為溶劑直接
溶解，濃度宜在0.1-10mg/ml，在2-5mg/ml為佳。粗多糖溶液經過濾或離心除去少量不 溶性沉澱後直接上樹脂分離柱分離。
粗多糖溶液上樣量依樹脂種類和粗多糖溶液濃度而定,可在分離樹脂床體積的0.1-5 倍之間，上樣量少可得到純度較高的多糖產品，但一次處理的粗多糖樣品較少，產量不 高,上樣量多則可以得到更多的多糖，但純度有所降低。上樣量在分離樹脂床體積的0.5-2 倍為佳。分離純化過程中的流速可在l-5BV/h， l-2BV/h時效果較好。
粗多糖水溶液經樹脂分離柱分離後，其中的主要雜質一蛋白和色素可以一次性地吸 附在樹脂上而除去，流出液主要為純化後的多糖樣品。流出溶液可經減壓蒸餾、冷凍幹 燥或噴霧乾燥得到純度較高的多糖產品。
樣品中多糖的含量可用高效液相色譜法或苯酚-硫酸比色法測定，其中的蛋白用考 馬斯亮藍染色法、凱氏定氮法等測定，色素的去除率用在最大波長的光吸收法測定。
純化多糖後的分離樹脂可以再生而重複使用，再生方法包括30-80%的乙醇浸泡、 淋洗，水洗，0.5-5。/。的酸(HCl)浸泡、淋洗，水洗，0.5-5。/。的鹼(NaOH)浸泡、淋洗，水 洗。
本發明的優異性在於
1. 本發明所涉及的多糖的分離和純化中利用樹脂一步除去蛋白和色素，相比現有 工藝，過程簡單，資源及能源耗費少，
2. 現有技術多採用乙醇沉澱多糖，耗費了大量的乙醇，對環境並不友好；本發明
的純化工藝只涉及到水和樹脂，沒有用到其它的有機溶劑，環境友好。
3. 本發明所涉及的分離樹脂可以經洗脫蛋白和色素再生後重複利用，有利於產品 的可持續生產。
具體實施例方式
實施例l.改性大孔聚乙烯醇分離樹脂的製備
平均粒度60目的聚乙烯醇微球40g(醋酸乙烯酯與異氰尿酸三烯丙酯的共聚物；交 聯度為30%，醇解度90%，天津歐瑞生物科技有限公司生產)，加入2M的NaOH溶液 80ml、環氧氯丙烷160ml和DMSO (二甲基亞碸)100ml， 40°C下振蕩反應3h後，用 蒸餾水充分洗淨，抽乾，得到活化的微球，環氧值為120umol/g (氯化鎂-鹽酸滴定法 測定)。活化的PVA樹脂中加入2M的NaOH溶液200ml和三甲胺200ml， 40°C下振蕩 反應10h，然後用蒸餾水充分洗淨。即得到聚乙烯醇分離微球樹脂，微球的交換量為100 umol/g (酸鹼滴定法測定)。
實施例2.改性大孔聚乙烯醇分離樹脂對粗甘草多糖的分離和純化
取由實施例1製備的樹脂20ml裝入分離柱中，分離柱直徑15mm,樹脂高度為150mm。取粗甘草多糖粗(純度10.26%，蛋白含量6.58mg)用蒸餾水配成4mg/ml濃度 的溶液，過濾除去少量不溶性沉澱得粗甘草多糖清液，此清液以lBV/h (BV:床體積) 的流速過分離柱，接收流出液，分別檢測流出液和上樣液中的多糖、蛋白和色素。流出 液經冷凍乾燥，得到白色多糖粉末9.8mg，純度87.59% (苯鼢-硫酸比色法測定)，收率 8.17%， 一次性蛋白去除率98.4% (考馬斯亮藍染色法測定)，色素去除率98.2% (色素 的去除率用在最大波長的光吸收法測定，最大波長373nm)。 實施例3.改性大孔聚乙烯醇分離樹脂對粗靈芝多糖的分離和純化
取由實施例1製備的樹脂按實施例2的方法裝分離柱。取粗靈芝多糖(純度15.4%, 蛋白含量0.474mg)用蒸餾水配成4mg/ml濃度的溶液，過濾除去少量不溶性沉澱得粗 甘草多糖清液，此清液以lBV/h的流速過分離柱，接收流出液，分別檢測流出液和上樣 液中的多糖、蛋白和色素。分離液經冷凍乾燥，得到白色多糖粉末10.5mg，純度91.39%， 收率8.75%， 一次性蛋白去除率88.23%，色素去除率92.41%。(檢測方法同上) 實施例4.分離樹脂的再生
實施例2或3中分離過多糖的聚乙烯醇分離樹脂20ml用40ml 50%的乙醇浸泡5h， 再用40ml蒸餾水充分洗滌至中性，然後樹脂用40ml2。/。的HCl浸泡5h後再衝洗，用蒸 餾水充分淋洗至中性，最後用40ml 2%的NaOH溶液浸泡5h，再衝洗40ml，用蒸餾水 充分淋洗至中性，取樣測交換量為98umol/g (酸鹼滴定法測定)，接近使用前水平。
權利要求
1、 一種改性大孔聚乙烯醇分離樹脂，其特徵在於它考將平均粒度20-120目的聚乙 烯醇樹脂微球在鹼性條件下和環氧氯丙烷反應，帶上活性功能基團環氧基，然後在鹼性條件下再與三甲胺、三乙胺或二乙烯三胺反應，水洗淨，乾燥。
2、 按照權利要求1所述的改性大孔聚乙烯醇分離樹脂的製備方法，其特徵在於包 括的步驟1) 40-50° C下，在l-3M的NaOH溶液中，平均粒度20-120目的聚乙烯醇樹脂微 球(交聯度為30%，醇解度90%)和1-4倍體積的環氧氯丙烷反應3-5h，用水洗淨，抽乾， 得到活化的微球，環氧基團含量為80-200 ymol/g。2) 在l-3M的NaOH溶液中，步驟1)活化的聚乙烯醇微球和l-4倍體積的三甲胺 或三乙胺等反應10h，反應溫度40-50。C，水洗淨得到球形、多孔狀聚乙烯醇樹脂微球， 乾燥備用。
3、 權利要求1所述的改性大孔聚乙烯醇分離樹脂分離和純化中草藥粗多糖的方法， 其特徵在於包括的步驟1) 取中草藥粗多糖用水配成0.1-10mg/ml的溶液，過濾除去少量不溶性沉澱得粗多 糖清夜；2) 將改性聚乙烯醇樹脂裝入分離柱中，將步驟l)的清液以通過分離柱，接收分離 液，分別檢測接收液和上樣液中的多糖、蛋白和色素。3) 分離液經冷凍乾燥，得到白色多糖粉末。
4、 按照權利要求3所述的方法，其特徵在於所述的中草藥粗多糖是甘草多糖、黃 芪多糖、靈芝多糖、香菇多糖或人參多糖，粗多糖用蒸餾水作為溶劑直接溶解，濃度宜 在0.1-1 Omg/ml。
5、 按照權利要求3所述的方法，其特徵在於所述的中草藥粗多糖的重量與樹脂的 體積是0.5 2: 20mg/ml。
6、 按照權利要求3所述的方法，其特徵在於所述的樹脂柱徑和柱高比為1: 5~20。
7、 按照權利要求3所述的方法，其特徵在於所述的分離純化過程中的流速可在 l-5BV/h。
8、 根據權利要求3所述的方法，其特徵在於一次處理樣品為l-15倍樹脂床體積。
9、 權利要求1所述的改性大孔聚乙烯醇分離樹脂再生方法，其特徵在於包括 30-80%的乙醇浸泡、淋洗，水洗，0.5-5%的酸浸泡、淋洗，水洗，0.5-5%的鹼浸泡、淋 洗，水洗。
全文摘要
本發明涉及改性大孔聚乙烯醇分離樹脂及分離和純化中草藥多糖的方法。聚乙烯醇樹脂微球在鹼性條件下和環氧氯丙烷反應，然後在鹼性條件下再與三甲胺、三乙胺或二乙烯三胺反應，水洗淨，乾燥。粗多糖(甘草多糖、黃芪多糖、靈芝多糖、香菇多糖和人參多糖等)水溶液直接經過改性大孔聚乙烯醇分離樹脂分離柱分離和純化，可以只經一步就可除去其中的主要雜質—蛋白和色素85％以上，分離液經乾燥可得到純度大於80％的多糖產品。
文檔編號B01D15/08GK101121118SQ20071005724
公開日2008年2月13日 申請日期2007年4月27日 優先權日2007年4月27日
發明者俞耀庭, 向才虎, 孔德領, 華 張, 楊佳玲, 歐來良, 王為超 申請人:天津德歐特生物醫藥科技有限公司