一種牛β-酪蛋白定量檢測試劑盒及其應用的製作方法

2023-04-29 21:45:21 2

一種牛β-酪蛋白定量檢測試劑盒及其應用的製作方法
【專利摘要】本發明提供了一種牛β-酪蛋白定量檢測試劑盒，主要包括牛β-酪蛋白特異肽（胺基酸序列為：VLPVPQK）、同位素標記牛β-酪蛋白特異肽（VL*PV*PQK）和同位素標記牛β-酪蛋白內標物（胺基酸序列為：QSVLSLSQSKVL*PV*PQKAVPYPQRD）。本發明試劑盒定量限為1mg/100g，重現性為RSD<9.50%（n=11），在食品基質中的回收率為73.41～93.88%（n=6），奶粉基質中的回收率為91.62～107.28%（n=6），試樣預處理簡單、快速、成本低。可適用於多種食品基質，對其中常量和微量的牛β-酪蛋白進行準確定量。
【專利說明】一種牛β-酪蛋白定量檢測試劑盒及其應用
(-)【技術領域】
[0001]本發明涉及一種牛β -酪蛋白定量檢測試劑盒，以及該試劑盒在定量檢測含乳食品或乳製品中牛β-酪蛋白含量中的應用。
(二)【背景技術】
[0002]酪蛋白(casein)是哺乳動物乳液中的主要蛋白質之一，負責傳輸營養與能量。酪蛋白會在酸性條件下(pH=4.6時)凝固沉澱，其沉澱物可以製作成奶酪，酪蛋白也因此得名。酪蛋白以外的蛋白質總稱為乳清蛋白。在不同哺乳動物乳液中，乳清蛋白和酪蛋白比例有所不同，牛乳中該比例約為2:8，而在人乳中此比例約為6:4。由於各種蛋白質的胺基酸序列不同，酪蛋白又可細分為asl、as2、β以及Κ酪蛋白，在牛乳中其比例約為38:10:36:13。母乳中的酪蛋白含量與牛乳有較大差異，在母乳中不含有as2-酪蛋白，只含有微量a sl-酪蛋白，β_酪蛋白的含量佔總酪蛋白的50-70%。所以在母乳化配方奶粉中的β_酪蛋白含量是一個非常重要的質量指標，用於評估其配方與母乳接近程度。
[0003]另外，牛酪蛋白被世界衛生組織(WHO)以及國際免疫學會聯合會(inS)定義為牛奶過敏原。世界範圍內大約有5?7%的O?3歲嬰幼兒以及2%成人患有牛奶過敏症。對過敏患者危害極大的是隱蔽過敏原，即食品中存在、卻未在包裝上以及配料表中註明該過敏原名稱與含量。例如在生產牛奶麵包後，使用同一流水線生產不含牛奶的麵包，可能會導致牛奶過敏原的交叉汙染。牛奶過敏患者在進食含有牛奶的食物後,會產生皮膚紅腫,瘙癢，呼吸困難，嘔吐，腹瀉等症狀，嚴重時甚至會導致休克。
[0004]作為一種營養物質，國內外β_酪蛋白的定量檢測方法主要有液相色譜法、毛細管電泳法，凝膠分子體積排阻色譜等方法。此類方法均採用了紫外檢測器，導致其檢測靈敏度不高。同時上述分離手段的分離效果較差，不適合用於分析嬰幼兒配方奶粉這樣含有複雜組分的樣品。
[0005]作為過敏原，牛奶在食品中的含量很低，並且含有大量的其它蛋白質，所以無法用上述檢測方法對其進行定量檢測。目前國內外定量檢測牛奶過敏原的方法主要以PCR和ELISA法為主。PCR法通過檢測食品中DNA來間接檢測食品中過敏原含量。牛奶中只含有極其微量DNA，需要經過複雜的純化富集操作，才能利用PCR技術進行擴增檢測。同時，PCR技術無法區分同源性食品，比如牛奶與牛肉製品之間的區別。利用實時螢光PCR技術可以半定量檢測，但是準確度不高。ELISA法主要利用了抗體與過敏原特異性結合，從而達到檢測目的。抗體是通過致敏動物血清製備的，批次間差異非常大。同時抗體對過敏原的空間結構有要求，無法檢測變性後的過敏原。並且ELISA法具有假陽性現象，會導致檢測結果的不準確。
(三)
【發明內容】

[0006]本發明目的是提供一種應用同位素標記內標肽稀釋法，結合LC-ES1-MS/MS準確定量檢測含乳食品中牛β-酪蛋白含量的檢測試劑盒及其應用。[0007]本發明採用的技術方案是:
[0008]一種牛β_酪蛋白定量檢測試劑盒，主要包括牛β_酪蛋白特異肽、同位素標記牛β_酪蛋白特異肽和同位素標記牛β_酪蛋白內標物，所述牛β_酪蛋白特異肽的胺基酸序列為:VLPVPQK ;所述同位素標記牛β-酪蛋白特異肽的胺基酸序列為:VLXPQK，其中L*和V*為碳氮全同位素標記的胺基酸；所述同位素標記牛β-酪蛋白內標物的胺基酸序列為:QSVLSLSQSKVLXPQKAVPYPQRD，其中L*和V*為碳氮全同位素標記的胺基酸。
[0009]本發明試劑盒的關鍵:在鹼性胰蛋白酶酶解的牛β-酪蛋白產物中經實驗確認了牛β-酪蛋白所獨有的胺基酸肽段；根據該肽段的胺基酸序列設計出同位素標記的特異肽和同位素標記內標物的序列，經化學合成獲得三種高純度的多肽成品。試劑盒中的其他試劑和物品，可根據需求在市場選擇，例如參照CN102590413A中所使用的部分試劑。
[0010]本發明試劑盒中，牛β-酪蛋白特異肽(以下簡稱:特異肽)是指牛β-酪蛋白經篩選酶解後所產生的肽段，通過研究發現VLPVPQK是牛β -酪蛋白的特異肽段之一，經對比網上資料庫以及使用高分辨液相色譜串聯質譜法檢測鑑定結果表明:存在牛乳及其製品中其他蛋白質中不存在與該胺基酸序列一致的胺基酸序列和胰蛋白酶酶解肽段。該胺基酸序列是牛β-酪蛋白經牛胰蛋白酶酶解後所特有的肽段(圖2)。經化學合成、提純後純度可達99.0%以上，在本試劑盒中作為優化液質譜參數使用(圖3)；
[0011]同位素標記牛β_酪蛋白特異肽是一條依據牛β_酪蛋白特異肽序列，經化學合成後的帶有同位素標記胺基酸的特異肽段(以下簡稱:同位素特異肽)。其胺基酸序列為VIWPQK，其中L*和V*為碳氮全同位素標記的胺基酸，經合成、提純後純度可達97.0%以上，而且其中不存在特異肽。在本試劑盒中作為優化內標酶解後質譜標記物質的液質譜參數使用(圖4);
[0012]同位素標記牛β_酪蛋白內標是專門為定量測定而設計與合成的內標物(以下簡稱:同位素內標)。同位素內標物的胺基酸序列為QSVLSLSQSKVLXPQKAVPYPQRD，其中V*和L*為碳氮全同位素標記的胺基酸。該肽段具有與牛β-酪蛋白同樣的酶解效率，可獲得等量的同位素特異肽，可以對樣品中的牛β-酪蛋白做準確定量。經合成、提純後純度可達97.0%以上，而且在測定過程中不產生特異肽。在本試劑盒中作為內標物質使用(圖5)；
[0013]本發明利用牛β -酪蛋白酶解後所獲得的特異多肽序列VLPVPQK進行定量檢測，能對不同基質食品中的牛β_酪蛋白進行準確定量檢測。
[0014]具體的，所述試劑盒中還可包括:氯化鈣、碳酸氫銨、二硫蘇糖醇、碘代乙醯胺、牛β -酪蛋白標準品(純度大於98%)、胰蛋白酶和質控樣品(圖1)。
[0015]本發明還涉及所述的試劑盒在定量檢測含乳食品或乳製品中牛β_酪蛋白含量中的應用。
[0016]各種合成肽產品的質量控制方法:
[0017]建立高效液相色譜(HPLC)和高效液相四級杆時間飛行串聯質譜聯用(HPLC-Q-TOF)的檢測方法對牛β_酪蛋白特異肽、同位素標記特異肽和同位素標記內標進行純度與雜質鑑定。
[0018]①.應用HPLC檢測合成肽的純度
[0019]稱取待測肽段lmg，加入ImL水溶解，用水再將溶解液稀釋至5mL，用HPLC-UV法在220nm波長下進行檢測，面積歸一法計算純度。[0020]②.應用UPLC-Q-TOF檢測合成肽的雜質
[0021 ] 稱取待測肽段lmg，加入ImL水溶解，用水再將溶解液稀釋20倍，用HPLC-Q-TOF法進行檢測，通過全掃描以質量數的差異來鑑別雜質。
[0022]其中液相色譜分離條件如下:色譜柱:C18 (孔徑300 A)色譜柱；柱溫為40°c，流動相A為0.08% (v/v)的三氟乙酸水溶液，流動相B為含0.08% (v/v)的三氟乙酸的乙腈溶液，梯度洗脫，流速為0.3mL/min。
[0023]其中質譜檢測條件如下:毛細管電壓:3.5kv,錐孔電壓:35kv，脫溶劑溫度:500°C，脫溶劑氣流量:900L/min，錐孔反吹氣流量:30L/hr，碰撞室壓力:3.0 X 10_3mbar ;低端解析度1:2.5V,高端解析度1:15.0V,離子能量1:0.5 ;低端解析度2:2.8V,高端解析度2:15.0V，離子能量2:1.0 ;離子源溫度:150°C，提取器電壓:3.0V，入口透鏡電壓:0.5V，出口電壓:0.5V，碰撞梯度:1.0，全掃描質量數區間200-2000m/z，停留時間100ms。
[0024]食品中牛奶過敏原的定量檢測方法:
[0025]本發明適用於各種含量的牛β_酪蛋白樣品的定量檢測，樣品基質包括奶粉原料、配方奶粉、麵包、餅乾、蛋糕、饅頭、零食、麥片以及烘焙預混粉等。樣品加入同位素標記內標後經胰蛋白酶酶切等樣品前處理後，通過液相色譜分離，進入串聯四級杆質譜，採用多反應監測方法進行檢測，內標法計算結果。
[0026]所述樣品前處理過程如下:
[0027]精密稱取約IOg樣品，加入IOOmL碳酸氫銨溶液後均質，將樣品懸濁液用適量碳酸氫銨溶液稀釋，使其β -酪蛋白濃度在I?10 μ g/mL範圍內，取ImL懸濁液，加入10 μ L同位素內標溶液和10μ L 二硫蘇糖醇溶液，50°C恆溫反應30min，取出冷卻至室溫，加入IOyL碘代乙醯胺溶液，在室溫下暗處靜置30min，加入10 μ L胰蛋白酶溶液，37°C恆溫酶解2h後加入5 μ L純甲酸，室溫靜置lh，最後將所得溶液經0.22 μ m微孔濾膜過濾後進樣分析；
[0028]稀釋牛β-酪蛋白標準儲備液，使其酪蛋白含量為1、2、4、6、8和lOyg/mL，取100 μ L標準溶液,加入900 μ L碳酸氫銨溶液和10 μ L同位素內標溶液,其餘步驟按照樣品前處理參考步驟操作，標準品酶切產物經0.22 μ m微孔濾膜過濾後進樣分析。
[0029]所述液相色譜分離參考條件如下:色譜柱:C18 (孔徑300 A)色譜柱；柱溫為40°C，流動相A為0.1% (v/v)的甲酸水溶液，流動相B為含0.1% (v/v)甲酸的乙腈溶液，梯度洗脫，流速為0.3mL/min。
[0030]所述質譜檢測參考條件如下:毛細管電壓:3.0kv，錐孔電壓:15kv，脫溶劑溫度:500°C，脫溶劑氣流量:400L/min，錐孔反吹氣流量:30L/hr，碰撞室壓力:3.0 X 10_3mbar ;低端解析度1:2.5V,高端解析度1:15.0V,離子能量1:0.6 ;低端解析度2:2.0V,高端解析度2:15.0V，離子能量2:2.0 ;離子源溫度:150°C，提取器電壓:5.0V，入口透鏡電壓:10V，出口電壓:10V。
[0031]所述質譜多反應監測方法的參數參考條件如下:牛β_酪蛋白特異肽的胺基酸序列為VLPVPQK，其雙電荷質荷比為390.8m/z，它的三個特徵碎片離子分別為213.5m/z、371.8m/z和568.3m/z，對應的碰撞能量分別為12eV、18eV和12eV ;同位素特異肽的胺基酸序列為VLXPQK(其中I/和f為碳氮全同位素標記的胺基酸)，其雙電荷質荷比為397.2m/z，它的三個特徵碎片離子分別為220.3m/z、371.8m/z和574.3m/z，對應的碰撞能量分別為12eV、18eV 和 12eV。[0032]所述內標法計算過程如下:用全脂牛奶粉標準品與同位素內標按照比例配得標準曲線，按照步驟(7)樣品前處理過程進行酶切處理，處理後樣品進樣分析，其液相色譜質譜條件與酶解後的樣品溶液相同，根據得到的標準工作曲線中特異肽和同位素特異肽的峰面積比與對應的溶液濃度，進行線性回歸，得出線性方程Y=kX+b，其中Y為牛β_酪蛋白特異肽和同位素特異肽的峰面積比；x為牛β-酪蛋白的濃度，單位為μ g/mL ;k為線性方程的斜率；b為線性方程的截距。將酶解後樣品溶液中測得的特異肽和同位素特異肽的峰面積比代入線性方程，即可計算得到樣液中牛奶過敏原的濃度(以全脂牛奶粉計)，將此濃度代入含量計算公式Cx=naXNXf，即可得到被測樣品中牛奶過敏原的含量Cx。公式中Cx為被測樣品中酪蛋白的含量，單位為mg/100g或者g/100g;na為被測樣液中β-酪蛋白的濃度；Ν為樣品稀釋倍數；f為單位之間的換算因子。
[0033]本發明利用胰蛋白酶只作用於精氨酸(R)和賴氨酸(K)的專一性，把牛奶中所有蛋白質酶切成分子量從幾十至上千道爾頓的肽段分子，從中選擇牛β_酪蛋白所特有的特徵肽段分子(特異肽)作為定量目標，使用全脂牛奶粉作為標準品參與酶解，採用同位素稀釋法，克服了酶解效率不穩定以及基質效應，能準確定量食品中牛奶過敏原。
[0034]本發明採用的裝置為:高效液相串聯四級杆質譜聯用儀，高效液相四級杆時間飛行串聯質譜，配備相應的控制軟體，恆溫水浴搖床或恆溫箱，蛋白質序列合成儀，微量移液器，超聲儀，渦旋器。
[0035]本發明的有益效果主要體現在:
[0036]1、本發明試劑盒，配置種類齊全，通過試劑配製指南可操作簡便地完成試劑配製，且易在一般實驗室推廣應用；
[0037]2、技術先進、可靠的質量檢測和控制方法，保證了試劑盒的質量和檢測結果的重現性；可滿足大批量樣品定量檢測的需求。
[0038]3、本發明所開發的方法使用經研究設計合成的同位素標記內標物，能夠準確的對食品中的牛β_酪蛋白過敏原進行定量，保證結果的可信度。
[0039]4、本發明所使用的試劑用量較少，檢測成本較低，利於在普通實驗室批量樣品快速檢測。
(四)【專利附圖】

【附圖說明】
[0040]圖1試劑盒所涉及的核心試劑整體外觀照片；
[0041]圖2為牛β -酪蛋白特異肽在牛β -酪蛋白一級結構中的位置及胺基酸序列圖；
[0042]圖3為本發明中所選牛β -酪蛋白特異肽色譜分離圖(a)和質譜鑑別圖(b)；
[0043]圖4為本發明中同位素特異肽的色譜分離圖(a)和質譜鑑別圖(b)；
[0044]圖5為本發明中同位素內標的色譜分離圖(a)和質譜鑑別圖(b)；
[0045]圖6為本發明中所選特異肽與同位素特異肽中各個離子通道裡的保留時間比較圖；
[0046]圖7為本發明中所選特異肽與同位素特異肽的裂解方式比較圖；
[0047]圖8為本發明中外標法與同位素內標法的回收率比較圖。
(五)【具體實施方式】[0048]下面結合具體實施例對本發明進行進一步描述，但本發明的保護範圍並不僅限於此:
[0049]實施例1:
[0050]1.本發明同位素特異肽的設計與確定:
[0051]根據實驗確定的牛β_酪蛋白特異肽的胺基酸序列，充分考慮其相關理化性質以及在質譜檢測過程中的幹擾與離子化效率問題，併兼顧實際生產應用的成本與可行性，弓丨入穩定同位素標記的亮氨酸(L*)和纈氨酸(V*)設計合成了牛β_酪蛋白特異肽的同位素特異肽，其胺基酸序列為VLXPQK。
[0052]本發明引入了同位素特異肽的目的是為了克服由提取試劑以及基質所引起的基質效應。為了驗證本發明所設計的同位素特異肽對牛β_酪蛋白特異肽在相同基質下結果的一致性，實驗設計比較了同位素特異肽對牛β-酪蛋白特異肽在同一液相色譜以及質譜條件下的保留時間，子離子裂解方式以及線性。分別配製本發明中的同位素特異肽與牛β -酪蛋白特異肽的標準系列工作溶液，在相同的色譜質譜條件下進樣分析，得其保留時間(圖6)與線性回歸方程。其中本發明中的同位素特異肽與牛β_酪蛋白特異肽的保留時間均為4.08min，充分證明這兩者在液相色譜行為方面的一致性。
[0053]牛β -酪蛋白特異肽的三個子離子的質荷比分別是213.5m/z、371.8m/z和568.3m/z，其對應的裂解方式分別是b2、y3和y5。同位素特異肽所選擇的子離子的質荷比分別是220.5m/z,371.8m/z和574.3m/z，第一個子離子包含了一個L%故質荷比與牛β -酪蛋白特異肽相比提高了 7m/z ;兩者的第二個子離子不包含任何同位素標記的胺基酸，所以質荷比一致；最後一個子離子包含一個 <，故質荷比提高了 6m/z。同位素特異肽的子離子裂解方式與牛β_酪蛋白特異肽的裂解方式一致，均為b2、y3和y5 (圖7)。
[0054]2.本發明同位素內標的設計與確定:
[0055]在食品中，尤其是在加熱處理後食品中，部分牛奶蛋白質會與基質中的碳水化合物，脂類以及其他蛋白質反應；部分蛋白質不參與基質反應，但是會包裹在基質中；只有一部分牛奶蛋白質是處於游離狀態的，嚴重影響了蛋白質提取效率，從而影響了酶解以及檢測結果。為了消除這些因素對定量結果帶來的影響，在已設計選擇並驗證確定的同位素特異肽的基礎上，充分考慮保留酶解位點的完整性併兼顧實際生產應用的成本與可行性，弓丨入穩定同位素標記的亮氨酸(L*)和纈氨酸(V*)設計合成了同位素內標，其胺基酸序列為QSVLSLSQSKVL*PV*PQKAVPYPQRD,該同位素內標經鹼性胰蛋白酶酶解後可產生同位素特異肽VlXPQK。
[0056]為了驗證本發明中的同位素內標與牛酪蛋白是否具有更加相近的酶解效率，設計進行了如下實驗:
[0057]精密稱取Ig陰性樣品，加入ImL的牛β -酪蛋白溶液，其濃度分別為10以及10(^8/1^，隨後加入911^碳酸氫銨溶液後均質，1:10稀釋後取ImL懸濁液，加入10 μ L同位素內標，充分渦旋震蕩混合後加入10 μ L 二硫蘇糖醇溶液，50°C恆溫反應30min，取出冷卻至室溫，加入10 μ L碘代乙醯胺溶液，暗處靜置30min，加入10 μ L胰蛋白酶溶液，37°C恆溫酶解2h後加入5 μ L純甲 酸，室溫靜置lh，經0.22 μ m微孔濾膜過濾後進樣分析。將所獲得的結果代入線性回歸方程，可獲得其含量與回收率。通過比較外標法和同位素稀釋內標法回收率(圖8)可知，同位素稀釋內標法在回收率與結果穩定性上明顯優於外標法，說明同位素稀釋內標法能夠有效排除酶解提取不穩定以及基質效應所帶來的影響。
[0058]實施例2:試劑盒配製及使用說明
[0059]一、試劑配製:[0060]1、牛β -酪蛋白特異肽標準溶液的配製:準確移取ImL超純水，加入標準物質I管中(該管內裝有已預先準確稱量的牛β_酪蛋白特異肽)，超聲溶解(30s)，所得溶液即為I μ g/mL的牛β -酪蛋白特異肽溶液；
[0061]2、同位素特異肽標準溶液的配製:準確移取ImL超純水，加入標準物質2管中(該管內裝有已預先準確稱量的同位素特異肽)，超聲溶解(30s)，所得溶液即為I μ g/mL的同位素特異肽溶液；
[0062]3、同位素內標標準儲備液的配製:準確移取ImL超純水，加入標準物質3管中(該管內裝有已預先準確稱量的同位素內標)，超聲溶解(30s)，所得溶液即為I μ g/mL的同位素內標溶液；
[0063]4、牛β -酪蛋白標準儲備液的配製:準確移取ImL超純水，加入標準物質4管中(該管內裝有已預先準確稱量的牛酪蛋白)，超聲溶解(5min)所得溶液即為lOOyg/mL的同位素內標溶液；
[0064]5、胰蛋白酶溶液的配製:準確移取lmLlmmol/L鹽酸溶液,加入試劑I管中(該管內裝有已預先準確稱量的牛胰蛋白酶，比活>3000USP/mg pro)，超聲溶解(30s)，所得溶液即為200 μ g/mL的胰蛋白酶溶液；
[0065]6、碳酸氫銨(NH4HCO3)溶液的配製:準確稱取1.98g NH4HCO3 (試劑2)於500mL容量瓶中，加入超純水超聲溶解(3min)，待冷卻至室溫後定容到刻度，所得溶液即為50mmol/L的碳酸氫銨溶液；
[0066]7、碘代乙醯胺(IAA)溶液的配製:準確稱取0.28g IAA (試劑3)於IOmL容量瓶中，加入50mmol/L的碳酸氫銨溶液約9mL,超聲溶解(3min),待冷卻至室溫後定容到刻度，所得溶液即為150mmol/L的碘代乙醯胺溶液；
[0067]8、二硫蘇糖醇(DTT)溶液的配製:準確稱取0.08g DTT (試劑4)於IOmL容量瓶中，加入50mmol/L的碳酸氫銨溶液約9mL,超聲溶解(3min),待冷卻至室溫後定容到刻度，所得溶液即為50mmol/L的二硫蘇糖醇溶液；
[0068]二、樣品前處理及分析:
[0069]精密稱取約IOg樣品，加入IOOmL碳酸氫銨溶液後均質，將樣品懸濁液用碳酸氫銨溶液稀釋，使其β -酪蛋白濃度在I~10 μ g/mL範圍內，取ImL懸濁液，加入10 μ L同位素內標溶液和10μ L 二硫蘇糖醇溶液，50°C恆溫反應30min，取出冷卻至室溫，加入10μ L碘代乙醯胺溶液，在室溫下暗處靜置30min，加入10 μ L胰蛋白酶溶液，37°C恆溫酶解2h後加入5 μ L純甲酸，室溫靜置lh，最後將所得溶液經0.22 μ m微孔濾膜過濾後進樣分析；
[0070]稀釋牛0-酪蛋白標準儲備液至1、2、4、6、8和1(^8/1^，取10(^14示準溶液，加入900 μ L碳酸氫銨溶液和10 μ L同位素內標溶液其餘步驟按照樣品前處理參考步驟操作，標準品酶切產物經0.22 μ m微孔濾膜過濾後進樣分析。
[0071]所述液相色譜分離參考條件如下:色譜柱:C18 (孔徑300 A)色譜柱；柱溫為40°C，流動相A為0.1% (v/v)的甲酸水溶液，流動相B為含0.1% (v/v)甲酸的乙腈溶液，梯度洗脫，流速為0.3mL/min。[0072]所述質譜檢測參考條件如下:毛細管電壓:3.0kv，錐孔電壓:15kv，脫溶劑溫度:500°C，脫溶劑氣流量:400L/min，錐孔反吹氣流量:30L/hr，碰撞室壓力:3.0 X 10_3mbar ;低端解析度1:2.5V,高端解析度1:15.0V,離子能量1:0.6 ;低端解析度2:2.0V,高端解析度2:15.0V，離子能量2:2.0 ;離子源溫度:150°C，提取器電壓:5.0V，入口透鏡電壓:10V，出口電壓:10V。
[0073]所述質譜多反應監測方法的參數參考條件如下:牛β_酪蛋白特異肽的胺基酸序列為VLPVPQK，其雙電荷質荷比為390.8m/z，它的三個特徵碎片離子分別為213.5m/z、371.8m/z和568.3m/z，對應的碰撞能量分別為12eV、18eV和12eV ;同位素特異肽的胺基酸序列為VLXPQK(其中I/和f為碳氮全同位素標記的胺基酸)，其雙電荷質荷比為397.2m/z，它的三個特徵碎片離子分別為220.3m/z、371.8m/z和574.3m/z，對應的碰撞能量分別為12eV、18eV 和 12eV。
[0074]所述內標法計算過程如下:用全脂牛奶粉標準品與同位素內標按照比例配得標準曲線，按照步驟(7)樣品前處理過程進行酶切處理，處理後樣品進樣分析，其液相色譜質譜條件與酶解後的樣品溶液相同，根據得到的標準工作曲線中特異肽和同位素特異肽的峰面積比與對應的溶液濃度，進行線性回歸，得出線性方程Y=kX+b，其中Y為牛β_酪蛋白特異肽和同位素特異肽的峰面積比；x為牛β-酪蛋白的濃度，單位為yg/mL;k為線性方程的斜率；b為線性方程的截距。將酶解後樣品溶液中測得的特異肽和同位素特異肽的峰面積比代入線性方程，即可計算得到樣液中牛奶過敏原的濃度(以全脂牛奶粉計)，將此濃度代入含量計算公式Cx=naXNXf，即可得到被測樣品中牛奶過敏原的含量Cx。公式中Cx為被測樣品中酪蛋白的含量，單位為mg/100g或者g/100g;na為被測樣液中β-酪蛋白的濃度；Ν為樣品稀釋倍數；f為單位之間的換算因子。
[0075]實施例3:
[0076]樣品類型:市售餅乾；
[0077]精密稱取約IOg樣品，加入IOOmL碳酸氫銨溶液後均質，將樣品懸濁液用碳酸氫銨溶液1:100稀釋後，取ImL懸濁液，加入IOyL同位素內標溶液和10 μ L 二硫蘇糖醇溶液，50°C恆溫反應30min，取出冷卻至室溫，加入10 μ L碘代乙醯胺溶液，在室溫下暗處靜置30min，加入10 μ L胰蛋白酶溶液，37 V恆溫酶解2h後加入5 μ L純甲酸，室溫靜置lh，最後將所得溶液經0.22 μ m微孔濾膜過濾後進樣分析。測得其中含有牛β_酪蛋白192.51 ±15.42mg/100g。
[0078]實施例4:
[0079]樣品類型:市售饅頭；
[0080]精密稱取約IOg樣品，加入IOOmL碳酸氫銨溶液後均質，取ImL懸濁液，加入10 μ L同位素內標溶液和IO μ L 二硫蘇糖醇溶液，5 (TC恆溫反應3 O m i η，取出冷卻至室溫，加入10 μ L碘代乙醯胺溶液，在室溫下暗處靜置30min，加入10 μ L胰蛋白酶溶液，37°C恆溫酶解2h後加入5 μ L純甲酸，室溫靜置lh，最後將所得溶液經0.22 μ m微孔濾膜過濾後進樣分析。測得其中含有牛酪蛋白含量為0.14±0.016mg/100g。
[0081]實施例5:
[0082]樣品類型:市售巧克力；
[0083]精密稱取約IOg樣品，加入IOOmL碳酸氫銨溶液後在50°C水浴加熱lOmin，其間搖晃5次以上，將樣品懸濁液用碳酸氫銨溶液1:200稀釋後，取ImL懸濁液，加入10 μ L同位素內標溶液和10 μ L二硫蘇糖醇溶液，50°C恆溫反應30min，取出冷卻至室溫，加入10 μ L碘代乙醯胺溶液，在室溫下暗處靜置30min，加入10 μ L胰蛋白酶溶液，37°C恆溫酶解2h後加入5μ L純甲酸，室溫靜置lh，最後將所得溶液經0.22 μ m微孔濾膜過濾後進樣分析。測得其牛β -酪蛋白含量為0.95 + 0.094g/100g。
[0084]實施例6:
[0085]樣品類型:市售全脂奶粉；
[0086]精密稱取約IOg樣品，加入IOOmL碳酸氫銨溶液後在50°C水浴加熱IOmin使之溶解，將樣品溶液用碳酸氫銨溶液1:500稀釋後,取ImL溶液,加入10 μ L同位素內標溶液和10 μ L 二硫蘇糖醇溶液，50°C恆溫反應30min，取出冷卻至室溫，加入10μ L碘代乙醯胺溶液，在室溫下暗處靜置30min，加入IOyL胰蛋白酶溶液，37°C恆溫酶解2h後加入5 μ L純甲酸，室溫靜置lh，最後將所得溶液經0.22 μ m微孔濾膜過濾後進樣分析。測得其牛β_酪蛋白含量為 7.42±0.17g/100g。
[0087]實施例7:
[0088]樣品類型:實驗室合成陰性樣品；
[0089]稱取取麵粉125g、食鹽2.5g、花生油15g，雞蛋IOg以及碳酸氫鈉lg，加水50mL後揉製成麵團，擀平，在170°C烘培25min。
[0090]精密稱取約IOg樣品，加入IOOmL碳酸氫銨溶液後均質，取ImL懸濁液，加入10 μ L同位素內標溶液和IOyL 二硫蘇糖醇溶液，50 V恆溫反應30min，取出冷卻至室溫，加入10 μ L碘代乙醯胺溶液，在室溫下暗處靜置30min，加入10 μ L胰蛋白酶溶液，37°C恆溫酶解2h後加入5 μ L純甲酸，室溫靜置lh，最後將所得溶液經0.22 μ m微孔濾膜過濾後進樣分析。在其中未檢出牛酪蛋白。
[0091]實施例8:
[0092]樣品類型:聞純度牛乳白蛋白；
[0093]精密稱取約0.1g樣品，加入ImL碳酸氫銨溶液後在50°C水浴加熱IOmin使之溶解加入IOyL同位素內標溶液和10 μ L 二硫蘇糖醇溶液，50°C恆溫反應30min，取出冷卻至室溫，加入10 μ L碘代乙醯胺溶液，在室溫下暗處靜置30min，加入10 μ L胰蛋白酶溶液，37°C恆溫酶解2h後加入5 μ L純甲酸，室溫靜置lh，最後將所得溶液經0.22 μ m微孔濾膜過濾後進樣分析。在其中未檢出牛β_酪蛋白。
[0094]本發明試劑盒的牛酪蛋白定量檢測方法的特點:定量限為lmg/100g，重現性為RSD〈9.50% (n=ll)，在食品基質中的回收率為73.41?93.88% (n=6)，奶粉基質中的回收率為91.62?107.28% (n=6)，試樣預處理簡單、快速、成本低。可適用於多種食品基質，對其中常量和微量的牛β_酪蛋白進行準確定量。
[0095]以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對於本【技術領域】的普通技術人員，在不脫離本發明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護範圍。
【權利要求】
1.一種牛β-酪蛋白定量檢測試劑盒，主要包括牛β-酪蛋白特異肽、同位素標記牛β-酪蛋白特異肽和同位素標記牛β-酪蛋白內標物，其特徵在於，所述牛β-酪蛋白特異肽的胺基酸序列為:VLPVPQK ;所述同位素標記牛β-酪蛋白特異肽的胺基酸序列為:VIWPQK，其中L*和V*為碳氮全同位素標記的胺基酸；所述同位素標記牛β-酪蛋白內標物的胺基酸序列為:QSVLSLSQSKVLXPQKAVPYPQRD，其中I/和V*為碳氮全同位素標記的胺基酸。
2.如權利要求1所述的試劑盒，其特徵在於所述試劑盒中還包括:氯化鈣、碳酸氫銨、二硫蘇糖醇、碘代乙醯胺、牛β -酪蛋白標準物質、質控樣品、胰蛋白酶和甲酸。
3.如權利要求1所述的試劑盒在定量檢測含乳食品或乳製品中牛β-酪蛋白含量中的應用。
【文檔編號】G01N30/02GK103529138SQ201310314220
【公開日】2014年1月22日 申請日期:2013年7月23日 優先權日:2013年7月23日
【發明者】任一平, 陳啟, 張京順, 賴世雲, 章宇 申請人:浙江省疾病預防控制中心