多肽、其與阿黴素的結合物和基於結合物的藥物組合物的製作方法

2023-04-26 22:01:11

專利名稱：多肽、其與阿黴素的結合物和基於結合物的藥物組合物的製作方法
技術領域：
本發明涉及天然化合物的化學、藥理學和藥物，並可用於治療癌症病人的藥物。
背景技術：
癌細胞的先天和後天的抗藥性以及抗癌劑的低選擇性是限制抗癌化療效果的主要因素。這些抗癌)的選擇生可以通過以各種蛋白作為攜帶載體使它們對癌細胞的直接的靶向性投放來增加。這樣，藥物可通過一個結合物的受體介導的細胞內機制透過靶細胞，而該結合物內有一個載體蛋白與藥物共價結合。上述結合物的選擇性既可以通過癌細胞膜上存在的可被載體蛋白或抗體認識的特殊受體，也可由癌細胞膜上具有比正常細胞更高水平的載體蛋白的受體來獲得。推測表皮生長因子(EGF)作為載體分子的效應來自於它的高穩定性、作為再結合蛋白的高利用度以及癌細胞膜上具有較健康細胞更高水平的表皮生長因子的受體。
已知許多研究和專利都描述了不同的表皮生長因子(EGF)與阿黴素(DR)和其它抗癌藥結合的結合物以及在此基礎上，它們的生產方法和藥物組合物(美國專利號5824805、5349066、5087616、5393737、5505931、5622929、5122368、5776458等)。
阿黴素是一種抗癌的抗生素類藥物，雖然它被廣泛用於臨床實踐，但卻有許多實際缺點，如，高心臟毒性及其因反覆靜脈注射引起而快速形成的癌細胞的抗藥性。而阿黴素用於一種結合物中可帶來其治療質量的極大改善。
短鍊表皮生長因子的肽類片段作為靶向投放阿黴素和其它抗癌藥至癌細胞的載體分子，具有特殊的好處。因為它們的生產方法相對簡單、經濟而且不需任何生物源性的起始物，它們的結合物也更易標準化。
已知帶有不同的表皮生長因子肽類片段的阿黴素(DR)(和其它抗癌藥)的混合物(藥物組合物)被用於癌症的化療(美國專利號4863902)。作者解釋由於癌細胞對阿黴素有更高的敏感性，而增加的專利藥的抗癌效果是歸咎於表皮生長因子及其活性片段產生的增殖方面的影響。然而，由於結合物中的阿黴素和表皮生長因子及其片段的連接是非共價性的，對靶細胞的靶向投放就不能確定，從而增加了藥物的非特異性毒性。
同樣，已知用於癌症治療的是一個生物活性的環狀多肽，該多肽具有與表皮生長因子32到48胺基酸片段相似的胺基酸序列(美國專利號5183805)。該專利說明此多肽片段可與阿黴素等化學劑結合，但在該專利中該結合物及其生產方法以及其生物學質量均未言及。
也已知一個多肽是一個表皮生長因子從21到31胺基酸的片段並具有如下的化學式H2N-MYIEALDKYAC-COOH (I)，(它)能夠有效地與表皮生長因子受體結合和引起細胞增殖，其與阿黴素的結合物裡面阿黴素與多肽的比例是1比1，並且，該結合部分與一個由用戊二醛作為交叉連接劑產生的、對酸不穩定的偶氮甲鹼的聯接聯在一起(俄國腫瘤雜誌，2001年第3期第33至37頁經蛋白載體對癌細胞的靶向投放引起的阿黴素抗癌活性的增加)。作為藥物組合物，任何含有有效濃度的阿黴素-表皮生長因子和適於靜脈給藥的藥學載體的成分都記載於號碼為5349066，5087616，5122368的美國專利中。

發明內容
本發明的目的是為了達到所述目標拓寬所述藥物的選擇範圍，和增加其效應。
該目的由提供一個新合成的、與表皮生長因子21到31胺基酸片段相似的多肽來實現。其能有效與表皮生長因子的受體結合，該多肽可引起細胞增殖並有靶向投放抗癌藥至癌細胞的載體作用。此多肽的化學式如下H2N-MYIEALDSYAC-COOH(II)與化學式(I)的多肽不同，(本發明)提出的多肽將人表皮生長因子受體結合片段的活性中心的絲氨酸(Ser)代替賴氨酸(Lys)，該絲氨酸是形成鼠科動物表皮生長因子結合部位的胺基酸之一。(我們)偶然發現以絲氨酸代替賴氨酸排除了受體結合片段的活性中心中不想要的賴氨酸ε-氨基團的結合，由此防止了對(本發明)提出的多肽結合到表皮生長因子受體的抑制作用。
雖然本發明提供的多肽的效應體現在和已知抗生素類阿黴素的結合物中，其它的具有抗癌作用的抗生素如長春新鹼，順鉑，柔毛黴素，甲氨蝶呤以及其它抗癌劑，如毒素(如白喉毒素或蓖麻毒素)、環磷醯胺和其它製劑等均可應用。
本發明也提供了一個上述多肽與阿黴素的結合物，其中阿黴素通過一個對酸不穩定的偶氮甲鹼與多肽聯在一起，並且將多肽MYIEALDSYAC作為其中的多肽。該結合物選擇性地作用於腫瘤並可充分地減少癌細胞對抗癌藥的抗藥性。
戊二醛或任何具有雙功能基的試劑可作為交叉聯接劑用來在氨基團處聯接多肽和阿黴素。由此可得到一個帶有對酸不穩定的聯結的結合物。
本發明也提供了一個藥物組合物，它具有細胞毒活性並且含有在有效濃度(0.05-0.1％)下帶有阿黴素的表皮生長因子的受體結合片段和適於靜脈注射載體的本發明提出的結合物。
一種生理鹽溶液、磷酸鹽鹽溶液或鎮痛劑均可用作該載體。該成分可另外含有微生物殺滅劑、抗病毒和抗寄生蟲藥物以及其它用於治療癌症病人的藥物，其含量不超過藥物組合物總重量的50％。


圖1的數據比較了本發明提出的多肽與已知多肽(I)對鼠科動物關節間纖維軟骨NIH3T3細胞系的增殖作用。
圖2的數據顯示在鼠科動物移植腫瘤的模型上含有阿黴素的藥物組合物延緩腫瘤的發生和生長。
具體實施例方式
以下舉例說明本發明並證明應用本發明提出的表皮生長因子的受體結合片段、結合物以及基於結合物的藥物組合物達到所述目的的可行性。
實施例1.多肽的製備採用合成的Fmoc策略，以固體肽類化學的方法獲得該多肽。選擇洗脫樹脂作為多聚體載體。用HOBt和N，N-二異丙基羰二醯胺，通過在每一步肽濃縮時轉換到羥苯三唑乙酯，來激活Fmoc胺基酸的羧基團。所用HOBt和N，N-二異丙基羰二醯胺須超過該多聚體的氨基團摩爾數的10倍。化學反應過程由加入到反應物中的溴酚藍溶液的變色來控制，溴酚藍以相對於氨基團的比例為1/1000(摩爾)的濃度溶於二甲基亞碸(DMSO)中。反應持續1.5-2小時。濃縮完成後，樹脂用二甲基甲醯胺洗4遍。然後，用溶於二甲基甲醯胺(DMF)中濃度為50％的哌啶處理。用三氟乙酸-95％、水-2.5％和1，2-乙二硫醇-2.5％的混合液將多肽從多聚體載體中移出。樹脂濾出後，該多肽用乙醚從溶液中沉澱出來。將沉澱物離心分離，真空乾燥，再在Phenomenex Luna C18 250*3柱上進行反相高壓相液相(HPLC)層析。多肽從柱上的梯度洗提是在下列溶劑系統中進行的乙腈-0.1％三氟醋酸/水。在相同條件下，在一個Nucleosil C18 250*8柱上進行半合成反相高壓液相(HPLC)層析。採用層析法獲得的多肽純度大於96％。
所得多肽用質譜方法進行特徵分析(分子離子-1265)。表1中給出了該多肽的結構。
表1.已知和本發明提出的多肽的結構原型多肽(表皮生長因子片段)的胺基酸序列 (本發明)提出的多肽的胺基酸序列NH2-蛋-酪-異亮-谷-丙-亮-天冬-絲-酪-丙-半胱-COOHNH-Met-Tyr-Ile-3lu-Ala-Leu-Asp-Ser-Tyr-Ala-Cys-COOH實施例2 多肽與阿黴素的結合物的製備溶於5ml濃度為0.05M、pH值為7的磷酸緩衝液中(濃度為1mg/ml)的多肽與先溶於pH值為5.5的蒸餾水的阿黴素(濃度為1.2mg/ml)加在一起。採用方案1進行合成
方案1 ＝POLYPEPTIDE-N＝＝C-CH2-CH2-CH2-C＝＝N-DR將在pH值為7.2、濃度為0.05M磷酸緩衝液中的戊二醛一滴一滴地加入反應混合物中。共加入3ml。然後，將反應混合物在50℃下保持1小時。用PD-10 Sephadex G-25(瑞典Pharmacia公司產)柱將所得結合物從原始反應物中分離出來。在Nucleosil C 18250*4.6柱上將此結合物進行反相高壓液相層析。再用含有乙腈-0.1％三氟醋酸/水的溶劑系統將多肽從柱上梯度洗提出來。
結合物中多肽的濃度用分光光度分析法(波長＝280nm)來測定。結合物中阿黴素的濃度則用波長為495nm的分光光度分析法測定。多肽/阿黴素的摩爾比例為1比1。
綜合上述，本發明開發了一種以戊二醛為交叉連接劑，將(本發明)提出的多肽與阿黴素化學結合的方法。獲得和特徵化了一種多肽與阿黴素的結合物，其中多肽與阿黴素的比例為1比1。
實施例3.展示多肽的生物活性在鼠科動物關節間纖維軟骨NIH3T3細胞系上測定多肽的增殖活性。以結合於可酸溶的細胞碎片中氚標的替米啶(3H-timidine)的量來判斷DNA生物合成率。鼠科動物關節間纖維軟骨NIH3T3細胞系在37℃、含有5％的二氧化碳的溼環境下、於含有RPMI媒介(Sigma公司生產)塑料瓶中培養。該媒介含有10％的小牛血清(Sigma產)、100U/ml的青黴素和100μg/ml的鏈黴素。同步的關節間纖維軟骨NIH3T3細胞系的增殖由加入不同濃度(0.1-1000ng/ml)的本發明提出的多肽於細胞懸液中來誘導。將纖維軟骨細胞置於96坑的培養板中進行培養，每一個坑中含有200微升培養基和200-800個細胞。於培養結束前2小時加入氚標的替米啶(3H-timidine)(1微居裡/坑，40微居裡/mol)。採用甲苯類閃爍液ZhS-8和閃爍計數器測定放射活性。DNA生物合成率表示為刺激指數(刺激細胞/對照細胞的比率)，該指數由下式計算I＝N/No×100％其中，I為刺激指數；N為受表皮細胞生長因子(EGF)刺激的細胞的數量；No為對照細胞的數量。
圖1的數據比較了本發明提出的多肽與已知多肽I(表皮細胞生長因子片段)對鼠科動物關節間纖維軟骨NIH3T3細胞系的增殖作用。數據顯示本發明提出的多肽比已知多肽對該細胞系有更明顯的劑量依賴的增殖作用，這也許表明本發明提出的多肽對相關受體有更高的親和力。由於癌細胞膜上表皮生長因子受體的表達比未變形細胞高出幾個數量級，上述發現支持用本發明提出的多肽作為更有效的載體分子來靶向投放抗癌藥至癌細胞的可能性。
實施例4 以存活率評價本發明提出多肽-阿黴素結合物對不同癌細胞系的效力在下列細胞系上研究了結合物的效力人類乳腺癌細胞系MCF-7wt、抗人類乳腺癌細胞系MCF-7AdrR、人類卵巢癌細胞系SKOV3和抗人類卵巢癌細胞系SKVLB以及鼠科黑素瘤細胞系B16。
所有測試的研究方案都是一樣的。將於37℃、5％的二氧化碳的溼環境下、在含有RPMI媒介(Sigma公司生產，含有10％的小牛血清(Sigma產)、100U/ml的青黴素和100μg/ml的鏈黴素)的塑料瓶(Costar產)中培養的細胞接種於96坑的培養板(Costar產)內，每一個坑中接種10000個細胞。然後加入不同濃度的要研究的藥物。孵育細胞72小時。於孵育結束前2到4小時在每個坑中加入50微升(1mg/ml)的MTT溶液(溴化3-[4，5-二甲基噻唑-2基]-2，5-聯苯四唑，Sigm產)於培養基中。著色後移去培養基，將甲晶體溶於150微升的二甲亞碸中，然後在540nm波長下用分光光度分析法測定其吸光率(度)。以對照細胞為100％，以非結合和結合的阿黴素處理的細胞存活相對於對照細胞存活的百分率來測定其存活率。
表2給出了用非結合和與本發明提出的多肽或表皮生長因子結合的阿黴素處理的細胞的存活率。
表2.非結合或結合阿黴素處理細胞的存活率

上述數據說明本發明提出的多肽與阿黴素的結合物對對阿黴素敏感的人類癌細胞系MCF-7wt和SKOV3、鼠類黑色素瘤細胞系B16具有比非結合的阿黴素或其與表皮生長因子片段(原型)的結合物更明顯的毒性。本發明提出的多肽與阿黴素的結合物也顯示了一個對細胞系MCF-7AdrR和對蒽環類藥抗生素具有抗藥性的細胞系SKVLB的較高的細胞毒活性。
綜合上述，一種抗癌藥(阿黴素)與本發明提出的多肽的結合顯示了對癌細胞的明顯的毒性，無論該癌細胞是對阿黴素敏感還是有抗阿黴素特性。事實證明本發明提出的多肽在離體實驗中作為引導抗癌藥靶向投放的載體分子的效力。
實施例5注射用藥物組合物由溶解結合物於生理鹽溶液或pH值約為7.4的磷酸鹽溶液中獲得。結合物在上述溶液中的濃度為0.05-0.1％。
實施例6在鼠科移植瘤模型中帶有生理溶液(如實施例5中所述)的多肽-阿黴素結合物成分顯示的細胞毒活性為了顯示多肽-阿黴素結合物對固體瘤的細胞毒活性，將實施例5中的藥物組合物靜脈注射到皮下移植了B16系癌細胞的小鼠體內。所得結果見附圖1和附圖2。所給藥物的劑量是每公斤體重0.2mg阿黴素，每4天一次。從癌細胞移植後3天開始給藥，一共給3次。
由附圖1可見，不象非結合阿黴素，其結合物相當程度地延遲了腫瘤的發生並減慢了其生長。對腫瘤生長的抑制率為58％。
如表3所示，從實驗室動物平均存活時間(ADL)的增加可以看到(本發明)提出的結合物當靜脈給藥時具有治療作用。與非結合的阿黴素不同，給其結合物使平均存活時間(ADL)增加了46％。
表3.靜脈給含有阿黴素的藥物組合物引起的動物平均存活時間的增加

平均存活時間的增加和更高的腫瘤生長抑制率顯示了在體外實驗中本發明提出的藥物組合物中抗癌劑靶向投放的治療效應。
實施例4和實施例6顯示本發明提出的多肽與一種蒽環類抗生素阿黴素的結合物(多肽-阿黴素)當靜脈給藥時對固體瘤具有治療作用。
權利要求
1.一個化學式為MYIEALDSYAC的生物活性多肽，(它)能與表皮生長因子結合、引起細胞增殖並具有載體分子引導抗癌藥對癌細胞靶向投放的作用。
2.一個多肽與阿黴素的結合物，其中，阿黴素是以共價鍵通過一個對酸不穩定的偶氮甲鹼的聯接與多肽連接，而所用的多肽是化學式為MYIEALDSYAC的多肽。
3.根據權利要求2所述的多肽與阿黴素的結合物，其中，阿黴素與多肽的共價聯接是用戊二醛作交叉聯接劑來達到的。
4.一種具有抗癌作用的藥物細合物，它含有有效濃度的與載體分子結合的阿黴素和一個適於靜脈給藥的藥學載體，其突出特徵是它含有與化學式為MYIEALDSYAC的多肽結合的阿黴素。
全文摘要
本發明多肽是與從21到31胺基酸的表皮生長因子片段相似的片段，並且，作為直接提供抗癌劑至癌細胞的載體，能有效地與表皮生長因子受體結合。所述多肽的發明性結合物包含阿黴素並對腫瘤有選擇性的作用，並能有效地減少腫瘤細胞對抗腫瘤藥的抗藥性。上述藥物的結合物是在對酸水解不穩定的化學鍵的幫助下產生結合的。本發明的藥物組合物含有有效量的結合物和一個適合於靜脈注射的載體。本發明可用作治療癌症病人的藥物。
文檔編號A61K38/08GK1606450SQ02825655
公開日2005年4月13日 申請日期2002年12月20日 優先權日2001年12月21日
發明者謝爾蓋耶維奇 謝韋林 葉夫根尼, 葉夫根尼維奇 謝韋林 謝爾蓋伊, 維克託羅維奇 盧芩科 謝爾蓋伊, 米哈伊洛維奇 基謝廖夫 謝爾蓋伊, 鮑裡索娃 費爾德曼 納塔利婭 申請人:俄羅斯生物技術有限公司