仙臺病毒實時螢光定量pcr檢測方法
2023-04-26 14:42:36
專利名稱：仙臺病毒實時螢光定量pcr檢測方法
技術領域：
本發明屬於生物技術領域，涉及一種病毒檢測方法，具體的地說是一種仙臺病毒 實時螢光定量PCR檢測方法。
背景技術：
仙臺病毒(Sendai virus)屬RNA病毒中的副黏液病毒科第一型，可在小鼠、大鼠、 豚鼠等多種嚙齒類實驗室動物中導致自然感染甚至死亡，小鼠仙臺病毒很難控制，常呈隱 性感染，急性型多見於20日齡左右乳鼠，表現呼吸道症狀。仙臺病毒感染可對實驗研究產 生嚴重幹擾，如改變體液和細胞介導的免疫應答，可改變被感染的腫瘤細胞的表面抗原及 其致癌性。目前，檢測各種病毒的方法很多，如血清學試驗、組織塊培養和共培技術、核酸雜 交和常規PCR檢測技術等，其中常規PCR檢測技術敏感性、特異性、穩定性和可操作性都比 較好，但常規PCR反應後的處理存在交叉汙染，也比較容易出現假陽性結果，並且實驗時間 也相對較長。而實時螢光定量PCR檢測技術就填補了以上的缺陷，無論是在研究中還是在 臨床樣品的檢測上，實時螢光定量PCR快速、敏感的特性使它成為應用於檢測微生物的有 效方法。實時螢光定量PCR技術具有以下優點=(I)PCR的高靈敏性、DNA雜交的高特異性和 光譜技術的高精確性；(2)儀器自動分析，效率高、無後續處理；(3)獨特的定量原理，即時 反映擴增過程，摒棄終點數據，更適用於定量，結果重現性好；(4)採用dUTP-UNG酶的防汙 染系統，所有試劑均是一次擴增，毋須開蓋，不產生汙染。
發明內容
本發明的目的在於克服現有技術中存在的上述不足，提供一種仙臺病毒實時螢光 定量PCR檢測方法，該檢測方法的檢測靈敏度可達到1. 0 X IO4個拷貝的病毒分子，對於單 個樣本檢測時間為2個小時，可同時進行大批量的樣本分析，具有良好的特異性、敏感性、 重複性和穩定性，適用於病毒感染的前期診斷。按照本發明提供的技術方案，所述仙臺病毒實時螢光定量PCR方法包括步驟如 下1、標準質粒的構建在美國國立生物信息中心NCBI基因庫(Genbank)中檢索獲得 仙臺病毒的保守基因，利用基因克隆技術構建含有該保守基因序列的標準質粒分子；2、特異性引物及螢光探針的設計以步驟1中選取的高度保守序列為基準，設計 一對特異性引物及一條螢光探針；設計原則為每條引物的長度為18-25個鹼基，螢光探針 長度為20 30個鹼基；特異性引物和螢光探針中GC含量要求在40-60%，理論Tm> 50°C; 特異性引物和螢光探針自身以及特異性引物和螢光探針之間的3』端避免鹼基配對；選用 的特異性引物和螢光探針要設計在仙臺病毒基因中的保守區，只對仙臺病毒特異，和其他 物種無交叉反應；螢光探針應位於一對特異性引物之間的區域；所述特異性引物包含有正向引物(PrimerF)、反向引物(PrimerR)，其中
正向引物的序列為5，-CGCTGTGGGGGAACAAATTC-3，，反向引物的序列為5，-CAGCAGCTCGGAGTAATGTT-3，；所述螢光探針的序列為5，-GCGAATTGGGTTGTGAGACT-3，；3、實時螢光定量PCR擴增及建立檢測標準曲線，包括步驟(1)模板的製備將步驟1中構建的標準質粒作10倍系列稀釋，以稀釋液為模板；具體如下定量 標準質粒為2. 98 X IO9拷貝/ μ 1，用稀釋液將標準質粒按10倍稀釋，即稀釋成濃度分別為 1.0Χ ΙΟ8、1.0Χ ΙΟ7、1.0Χ IO6、1.0Χ ΙΟ5、1.0Χ IO4 的稀釋液，稀釋液在-20°C條件下保存備 用；(2)實時螢光定量PCR反應體系25μ 1 的 PCR 反應體系含有成分如下DEPC 水，15. 75μ 1 ； 10XPCR buffer, 2. 5μ 1 ； IOmM dNTPs，0. 5μ 1 ；1. 25U Tag DNA 聚合酶，0· 25 μ 1 ；300ηΜ 正向引物(PrimerF)， 2. 5μ 1 ；300ηΜ 反向引物(PrimerR), 2. 5 μ 1 ；模板，1 μ 1 ；(3)循環反應根據步驟⑵中的PCR反應體系加樣，將加好樣的PCR試劑管放入螢光PCR儀中， 設置相應的螢光採集條件後進行擴增，反應循環程序為(a)、95°C預變性5min，1個循環； (b)、95°C變性20sec，55°C退火30sec，72°C延伸30sec，40個循環後反應結束，得到反應產 物；(4)建立檢測標準曲線螢光PCR儀採集螢光信號，經計算機軟體自動生成以起始 模板數對數為X軸，Ct值為y軸的標準曲線；4、感染病毒樣本的RNA提取及cDNA的製備，包括步驟(1)採用Trizol法提取感染病毒樣本的RNA ；(2) ffl Invitrogen & 目 ! # 白勺 SuperScriptTM Preamplification System forFirst Strand cDNA Synthesis 試劑盒做反轉錄，製備 cDNA ；5、有效性驗證及結果檢測判定(1)利用未感染仙臺病毒小鼠的cDNA配製陰性對照PCR反應體系25μ 1的陰 性對照PCR反應體系為含有成分如下DEPC水，15. 75 μ 1 ； 10XPCRbuffer, 2. 5 μ 1 ；IOmM dNTPs，0. 5μ 1 ；1. 25U Tag DNA聚合酶，0. 25 μ 1 ；300ηΜ正向引物(PrimerF), 2. 5 μ 1 ；300ηΜ 反向引物(PrimerR), 2. 5 μ 1 ；未感染仙臺病毒小鼠的cDNA，1 μ 1 ；利用感染仙臺病毒小鼠的cDNA製備陽性對照PCR反應體系25 μ 1的陽性對照 PCR 反應體系為含有成分如下DEPC 水，15. 75 μ 1 ;10XPCR buffer, 2. 5 μ 1 ；IOmM dNTPs, 0. 5μ 1 ；1. 25U Tag DNA 聚合酶，0. 25 μ 1 ；300ηΜ 正向引物(PrimerF), 2. 5 μ 1 ；300ηΜ 反向 引物(PrimerR)，2. 5 μ 1 ；感染仙臺病毒小鼠的cDNA, 1 μ 1 ；(2)循環反應按照步驟(1)中的PCR反應體系加樣，將加好樣的PCR試劑管放入螢光PCR儀中， 設置相應的螢光採集條件後進行擴增，反應循環程序為(a)、95°C預變性5min，1個循環； (b)、95°C變性20sec，55°C退火30sec，72°C延伸30sec，40個循環後反應結束，得到反應產 物；(3)有效性驗證
螢光PCR儀採集螢光信號，經計算機軟體生成陰性對照點和陽性對照點；陰性對 照應無Ct值並且無擴增曲線，陽性對照點應位於標準曲線上，並且其Ct值應< 30，否則重 做。本發明採用實時定量螢光PCR進行仙臺病毒的特異性檢測，具有以下優點(1)、特異性好由於TagMan螢光探針定量使用雜交對定量分子進行甄別，具有很 高的準確性，同時，靶序列由引物和螢光探針雙重控制，特異性好，假陽性低。(2)、靈敏度高螢光檢測技術是一個很靈敏的檢測技術，因此TagMan檢測的靈敏 度很高。(3)、線性關係好由於螢光信號的產生和每次擴增產物成一一對應的關係，通過 螢光信號的檢測可以直接對產物進行定量。(4)、操作簡單，自動化程度高、防汙染；使用TagMan螢光探針定量擴增和檢測可 以在同一管內檢測，不需要開蓋，不易汙染。同時擴增和檢測一步完成，操作簡單，易於實現 自動化。
圖1為仙臺病毒的檢測標準曲線。圖2為仙臺病毒PCR電泳圖譜。
具體實施例方式一、實驗材料1、陽性樣本取自感染仙臺病毒小鼠(來自無錫市血防所動物實驗室)的血液。2、實驗試劑裂解液Trizol (購於美國Invitrogen公司)，反轉錄試劑盒、TaqDNA 聚合酶及引物(購於美國Promega公司)，液氮、氯仿、異丙醇、75 %乙醇、DEPC處理水、 dNTPs、DL2000 Marker (均購自美國 Sigma 公司)。實驗儀器離心機(CT15RT，上海天美電化儀器設備工程有限公司)、實時螢光定量PCR儀 (FQD-48A，杭州博日科技有限公司)、普通PCR儀(TC_96/G/H(b)A杭州博日科技有限公 司)、紫外分光光度儀(ND-1000，美國Thermo FisherScientific公司)、掃描儀(YLN-26、 北京市朝陽區京南機電綜合服務部)、數位照相機(索尼WXl)、冰箱(MDF-382E(N)，三洋電 機國貿公司)。二、實驗方法1、標準質粒的構建在美國國立生物信息中心NCBI基因庫(Genbank)中檢索獲得 仙臺病毒的保守基因，該保守基因序列的NC號為001552. 1，基因片段從5275 5619 ；利用 基因克隆技術構建含有該保守序列的標準質粒分子，所用的質粒為PUC57(由金斯瑞公司 提供)，由金斯瑞公司提供合成。2、特異性引物及螢光探針的設計以步驟1中選取的高度保守序列為基準，按照 發明內容部分的設計原則設計一對包含有正向引物(PrimerF)、反向引物(PrimerR)的特 異性引物及一條螢光探針其中，正向引物的序列(SEQ ID NO. 1)為
5，-CGCTGTGGGGGAACAAATTC-3，，反向引物的序列(SEQ ID NO. 2)為5』 -CAGCAGCTCGGAGTAATGTT-3』 ；螢光探針的序列(SEQ ID NO. 3)為5』 -GCGAATTGGGTTGTGAGACT-3』 ；3、實時螢光定量PCR擴增及建立檢測標準曲線(1)模板的製備將步驟1中構建的標準質粒作10倍系列稀釋，以稀釋液為模板；具體如下定量 標準質粒為2. 98 X IO9拷貝/ μ 1，用稀釋液將標準質粒按10倍稀釋，即稀釋成濃度分別為 1.0Χ ΙΟ8、1.0Χ ΙΟ7、1.0Χ IO6、1.0Χ ΙΟ5、1.0Χ IO4 的稀釋液，稀釋液在-20°C條件下保存備 用；(2)實時螢光定量PCR反應體系25 μ 1 的 PCR 反應體系含有成分如下DEPC 水，15. 75 μ 1 ；10XPCR buffer, 2. 5μ 1 ； IOmM dNTPs，0. 5μ 1 ；1. 25U Tag DNA 聚合酶，0· 25 μ 1 ；300ηΜ 正向引物(PrimerF)， 2. 5μ 1 ；300ηΜ 反向引物(PrimerR), 2. 5 μ 1 ；模板，1 μ 1 ；(3)循環反應根據步驟(2)中的PCR反應體系加樣，將加好樣的PCR試劑管放入螢光PCR儀中， 設置相應的螢光採集條件後進行擴增，反應循環程序為(a)、95°C預變性5min，1個循環； (b)、95°C變性20sec，55°C退火30sec，72°C延伸30sec，40個循環後反應結束，得到反應產 物；(4)建立檢測標準曲線螢光PCR儀採集螢光信號，經計算機軟體自動生成以起始 模板數對數為X軸，Ct值為y軸的標準曲線(如圖1所示)；對圖1所示的檢測標準曲線進行分析可見，模板的5個稀釋點均在同一條直線上， 表明當基因拷貝數在LOXlO8-L OXlO4範圍內時，檢測域值與拷貝數之間均呈良好的線 性關係；回歸分析顯示，R2 = 0. 9935 ；可見本發明設計的引物及螢光探針的特異且工作性 能良好。4、感染病毒樣本的RNA提取及cDNA的製備(1)採用Trizol法提取感染病毒樣本的RNA ；具體步驟為(a)、抽取感染仙臺病毒小鼠的血液，在1.5ml的微量離心管中加入抽取的血液 500 μ 1，然後加入Trizol裂解液500 μ 1，充分混勻，室溫放置IOmin ；(b)、向上述室溫放置IOmin後的微量離心管中加入200 μ 1的氯仿，蓋緊離心管 蓋，用力震蕩離心管，室溫放置IOmin ；然後4°C，13000r/min離心15min ；(C)、吸取上述離心後的上層水相加入到另一個新的離心管中，加入等體積的異丙 醇，輕輕顛倒離心管充分混勻液體，室溫放置IOmin後，4°C，13000r/min離心15min ；(d)、小心棄去上清液，再加入lml75%乙醇洗一遍，4°C，8000r/min離心IOmin ；(d)、棄去上清液，按每Iml Trizol液加入至少Iml的比例加入75%乙醇，渦旋混 勻，4°C下10000r/min離心5分鐘。(e)、小心棄去上清液，然後將分離下來的RNA置於超淨臺中乾燥5min ；(注意乾燥後的RNA溶於DEPC處理水中，即可進行反轉錄操作，若要保存備用，可在步驟(e)後直接加入乙醇並凍存於-70°C，可保存一年；若加入DEPC水後則只能 在-20°C保存1個月左右)。(2) cDNA 的製備米用 Invitrogen 公司提供的 SuperScriptTM Preamplification System for FirstStrand cDNA Synthesis試劑盒做反轉錄，具體步驟為仏)、在0. 5ml微量離心管中，加入步驟(1)中提取的乾燥後的RNA 1_5μ g，補充適 量的DEPC水使總體積達11 μ 1 ；向微量離心管中加入10 μ M Oligo (dT) 15 μ 1，輕輕混勻、離 心；(b)、將微量離心管70°C加熱IOmin後立即插入冰浴中至少Imin ；然後加入下 列混合試劑，混合試劑的成分為10 X PCR buffer, 2 μ 1 ； 25mM MgCl2, 2 μ 1 ； IOmM each dNTPmix, 1 μ 1 ；0. IM DTT,2y 1 ；然後輕輕混勻，4 °C 下 12000r/min 離心 Imin ；然後轉入 42°C水浴中下孵育2-5min ；(c)、加入反轉錄酶200U1 μ 1，在42°C水浴中繼續孵育50min ；(d)、將微量離心管70°C加熱15min，終止反應；(e)、將微量離心管插入冰中，加入RNase H 1 μ 1，在37°C下孵育20min，降解殘留 的RNA，反轉錄的最終體系為35 μ 1，最後補足DEPC水165 μ 1，得最終cDNA為200 μ 1，置 於-20°C保存備用。5、有效性驗證及結果檢測判定(1)利用未感染仙臺病毒小鼠的cDNA配製陰性對照PCR反應體系25μ 1的陰 性對照PCR反應體系為含有成分如下DEPC水，15. 75 μ 1 ； 10XPCRbuffer, 2. 5 μ 1 ；IOmM dNTPs，0. 5μ 1 ；1. 25U Tag DNA 聚合酶，0. 25 μ 1 ；300ηΜ 正向引物(PrimerF), 2. 5 μ 1 ； 300ηΜ 反向引物(PrimerR), 2. 5 μ 1 ；未感染仙臺病毒小鼠的cDNA，1 μ 1 ；利用步驟4中製備的感染仙臺病毒小鼠的cDNA製備陽性對照PCR反應體系 25 μ 1的陽性對照PCR反應體系為含有成分如下DEPC水，15. 75 μ 1 ； 10XPCR buffer, 2. 5μ 1 ； IOmM dNTPs，0. 5μ 1 ；1. 25U Tag DNA 聚合酶，0· 25 μ 1 ；300ηΜ 正向引物(PrimerF)， 2. 5μ 1 ；300ηΜ反向引物(PrimerR)，2. 5 μ 1 ；感染仙臺病毒小鼠的cDNA，1 μ 1 ；(2)循環反應按照步驟(1)中的PCR反應體系加樣，將加好樣的PCR試劑管放入螢光PCR儀中， 設置相應的螢光採集條件後進行擴增，反應循環程序為(a)、95°C預變性5min，1個循環； (b)、95°C變性20seC，55°C退火30seC，72°C延伸30seC，40個循環後反應結束，得到反應產 物；(3)有效性驗證螢光PCR儀採集螢光信號，經計算機軟體生成陰性對照點和陽性對照點(如圖1 所示)；陰性對照在本檢測試驗中無Ct值並且無擴增曲線，表明該反應體系中無仙臺病毒； 圖中的陽性對照點位於標準曲線上，並且其Ct值< 30，實驗有效，可見，本發明的檢測方法 能夠準確有效地檢測出仙臺病毒。三、常規PCR檢測(1)以DL2000 Marker作為參照，採用步驟1中構建的標準質粒作為模板，以未感 染仙臺病毒小鼠的cDNA作為樣本cDNA，進行PCR電泳檢測，分為參照組、陰性對照組、陽性 表1 常規PCR電泳檢測中的各組的反應體系成分其中，8.25μ 1 的混合液由 2. 5μ 1 的 10XPCR buffer，0. 5 μ 1 的 IOmM dNTPs, 0. 25 μ 1 的 1. 25U Tag DNA 聚合酶，2. 5 μ 1 的 300nM PrimerF 禾口 2. 5 μ 1 的 300nMPrimerR組成。(2)常規PCR反應反應循環程序及參數為(a)、95°C預變性5min，l個循環；(b)、 95°C變性20sec，55°C退火30sec，72°C延伸30sec，35個循環後反應結束，得到反應產物；(3)將上述反應產物進行常規凝膠電泳檢測(120V 40min)，檢測結果如圖2所示 (泳道M 參照組DL2000 Marker,泳道1 陰性對照組，泳道2 陽性對照組，泳道3 樣品組 a,泳道4 樣品組b，泳道5 樣品組c，泳道6 樣品組d，泳道7 樣品組e)，由圖可見，泳道 1並未出現條帶，說明本實驗方法的非特異性較好。本發明採用的實時螢光定量PCR技術巧妙地利用了 PCR技術的DNA高效擴增、螢光探針技術高特異性和光譜技術的敏感性及實時定量分析的優點，克服了常規PCR定性檢 測的一些不足，極大地提高了檢測的敏感性和特異性，縮短了實驗時間，簡化了實驗操作。 而且螢光檢測的結果由電腦分析讀數，避免了產物後處理過程所致的汙染，較常規PCR更 為客觀、靈敏、準確。同時，本發明中採用的陽性對照是根據仙臺病毒的保守基因序列設計 構建的標準質粒分子，相對於以往採用滅活病毒液作為陽性品的檢測，更增加了安全性，標 準質粒分子還可以大量進行複製，使得陽性標準品的來源更加穩定和可靠，避免了陽性病 毒株在每次試驗中的使用。
權利要求
仙臺病毒實時螢光定量PCR檢測方法，包括有標準質粒的構建、特異性引物及螢光探針的設計、實時螢光定量PCR擴增及建立檢測標準曲線、感染病毒樣本的RNA提取及cDNA的製備、有效性驗證及結果檢測判定，其特徵在於，所述特異性引物包含有正向引物(PrimerF)、反向引物(PrimerR)，其中正向引物的序列為5』 CGCTGTGGGGGAACAAATTC 3』，反向引物的序列為5』 CAGCAGCTCGGAGTAATGTT 3』；所述螢光探針的序列為5』 GCGAATTGGGTTGTGAGACT 3』。
2.如權利要求1所述的仙臺病毒實時螢光定量PCR檢測方法，其特徵還在於，所述實時 螢光定量PCR擴增及建立檢測標準曲線的步驟為(1)將構建的標準質粒作10倍系列稀釋，以稀釋液為模板；具體如下定量標準質粒 為2. 98 X IO9拷貝/ μ 1，用稀釋液將標準質粒按10倍稀釋，即稀釋成濃度分別為1. OX 108、 1.0Χ ΙΟ7、1.0Χ IO6、1.0Χ ΙΟ5、1.0Χ IO4的稀釋液，稀釋液在_20°C條件下保存備用；(2)實時螢光定量PCR反應體系25 μ 1 的 PCR 反應體系含有成分如下DEPC 水，15. 75μ 1 ； 10XPCR buffer, 2. 5 μ 1 ； IOmM dNTPs，0. 5μ 1 ；1. 25U Tag DNA聚合酶，0· 25 μ 1 ；300ηΜ 正向引物(PrimerF)，2. 5 μ 1 ； 300ηΜ 反向引物(PrimerR)，2. 5 μ 1 ；模板，1 μ 1 ；(3)循環反應根據步驟(2)中的PCR反應體系加樣，將加好樣的PCR試劑管放入螢光PCR儀中，設置 相應的螢光採集條件後進行擴增，反應循環程序為(a)、95°C預變性5min，1個循環；(b)、 95°C變性20sec，55°C退火30sec，72°C延伸30sec，40個循環後反應結束，得到反應產物；(4)建立檢測標準曲線螢光PCR儀採集螢光信號，經計算機軟體自動生成以起始模板 數對數為χ軸，Ct值為y軸的標準曲線。
3.如權利要求1所述的仙臺病毒實時螢光定量PCR檢測方法，其特徵還在於，所述有效 性驗證及結果檢測判定的步驟為(1)利用未感染仙臺病毒小鼠的cDNA配製陰性對照PCR反應體系25μ 1的陰性對照 PCR 反應體系為含有成分如下:DEPC 水，15. 75 μ 1 ； 10XPCRbuffer，2. 5 μ 1 ；IOmM dNTPs, 0. 5μ 1 ；1. 25U Tag DNA 聚合酶，0. 25 μ 1 ；300ηΜ 正向引物(PrimerF), 2. 5 μ 1 ；300ηΜ 反向 引物(PrimerR)，2. 5 μ 1 ；未感染仙臺病毒小鼠的cDNA, 1 μ 1 ；利用感染仙臺病毒小鼠的cDNA製備陽性對照PCR反應體系25μ 1的陽性對照PCR 反應體系為含有成分如下DEPC 水，15. 75μ 1 ;10XPCR buffer, 2. 5 μ 1 ； IOmM dNTPs, 0. 5μ 1 ；1. 25U Tag DNA 聚合酶，0. 25 μ 1 ； 300ηΜ 正向引物(PrimerF), 2. 5 μ 1 ； 300ηΜ 反向 引物(PrimerR)，2. 5 μ 1 ；感染仙臺病毒小鼠的cDNA, 1 μ 1 ；(2)循環反應按照步驟(1)中的PCR反應體系加樣，將加好樣的PCR試劑管放入螢光PCR儀中，設置 相應的螢光採集條件後進行擴增，反應循環程序為(a)、95°C預變性5min，1個循環；(b)、 95°C變性20sec，55°C退火30sec，72°C延伸30sec，40個循環後反應結束，得到反應產物；(3)有效性驗證螢光PCR儀採集螢光信號，經計算機軟體生成陰性對照點和陽性對照點；陰性對照應 無Ct值並且無擴增曲線，陽性對照點應位於標準曲線上，並且其Ct值應< 30，否則重做。
全文摘要
本發明涉及一種仙臺病毒實時螢光定量PCR檢測方法。該方法包括標準質粒的構建、特異性引物及螢光探針的設計、實時螢光定量PCR擴增及建立檢測標準曲線、感染病毒樣本的RNA提取及cDNA的製備以及有效性驗證及結果檢測判定步驟；其中特異性引物的正向引物的序列為5』-CGCTGTGGGGGAACAAATTC-3』，反向引物的序列為5』-CAGCAGCTCGGAGTAATGTT-3』；所述螢光探針的序列為5』-GCGAATTGGGTTGTGAGACT-3』。本發明檢測靈敏度高，檢測時間短，可同時進行大批量的樣本分析，具有良好的特異性、敏感性、重複性和穩定性，適用於病毒感染的前期診斷。
文檔編號C12Q1/70GK101928784SQ20101011025
公開日2010年12月29日 申請日期2010年2月3日 優先權日2010年2月3日
發明者張紅, 潘振華, 盛青松, 陳林鳳 申請人:無錫奧瑞生物醫藥科技有限公司