利用CRISPR‑CAS9技術對水稻BADH2基因定點突變的方法與流程
2023-04-26 20:29:26
本發明涉及植物轉基因技術領域和作物遺傳育種領域，具體地說，涉及一種利用CRISPR-CAS9技術對水稻BADH2基因定點突變的方法。
背景技術：
香稻作為水稻家族中的特殊成員,其栽培歷史相當悠久,世界上各水稻生產國或地區幾乎都有香稻種植。香味是優質稻米重要特徵，香稻育種已成為水稻遺傳育種的重要內容之一。Bradbury等(2005)發現在香米和普通米之間一個存在序列差異的基因—BADH2，這一基因編碼甜菜鹼乙醛脫氫酶(betaine aldehyde dehydrogenase)，推測可能與米香的合成有關。Chen等(2008)對通過轉基因互補實驗證明了BADH2基因控制米香，香米品種BADH2基因的第二個或第七個外顯子存在天然突變，沒有全長的BADH2轉錄本，2AP(2-acetyl-1-pyrroline，水稻香米芳香成分之一)大量積累；而只有在普通稻米中存在全長的BADH2轉錄本，其中2AP含量極低。通過在香米品種中轉入全長BADH2基因，其2AP含量顯著降低，香氣丟失。證明BADH2是控制米香的主效基因。
目前，香米品種的培育多是利用雜交方式將香米基因轉入普通稻米中，儘管可以藉助分子標記進行輔助選擇，但這個過程複雜周期較長。以ZFN(zinc-finger nucleases)和TALEN(transcription activator-like effector nucleases)為代表的序列特異性核酸酶技術能夠實現定點基因組編輯。在水稻中已實現利用TALEN技術敲除BADH2使水稻獲得香味。但TALEN技術模塊組裝過程繁瑣，需要大量測序工作，成本較高且具有細胞毒性。ZFN技術設計上依賴於上下遊序列，脫靶率高，同樣具有細胞毒性。
CRISPR/Cas技術擺脫了合成並組裝具有特異性DNA識別能力蛋白模塊的繁瑣操作，其gRNA的設計和合成工作量遠遠小於TALEN和ZFN技術的DNA識別模塊的構建過程，且毒性遠遠低於ZFN技術，有著靶向精確、脫靶率低、細胞毒性低、廉價簡便等優點。CRISPR/Cas9技術自問世以來，就有著其它基因編輯技術無可比擬的優勢，技術不斷改進後，更被認為能夠在活細胞中最有效、最便捷地「編輯」任何基因。
技術實現要素：
本發明的目的是提供一種利用CRISPR-CAS9技術對水稻BADH2基因定點突變的方法。
為了實現本發明目的，本發明提供的利用CRISPR-CAS9技術對水稻BADH2基因定點突變的方法，針對水稻BADH2基因設計基於CRISPR/Cas9的sgRNA序列，將含有編碼所述sgRNA序列的DNA片段連接到攜帶CRISPR/Cas的載體中，轉化水稻，實現對水稻BADH2基因的定點突變。
其中，sgRNA作用位點的核苷酸序列為5』-GAGTGGCGCGCCCCCGCGCT-3』。(SEQ ID NO:1)
前述的方法，構建載體pHZ1-CAS9-gRNA-BADH2，採用農桿菌介導法轉化水稻，篩選陽性轉基因植株。
所述載體pHZ1-CAS9-gRNA-BADH2的構建方法如下：
1)OsU6-BADH2-gRNA-polyT片段的構建
第一輪PCR以Cris-GL3質粒(由中國科學院遺傳與發育生物學研究所徐冉博士惠贈)為模板，用引物CRI-F1和SQ3-R1擴增OsU6啟動子與BADH2基因的20bp靶序列，片段大小329bp；同樣以Cris-GL3質粒為模板，用引物SQ3-F2和CRI-R2擴增BADH2基因的20bp靶序列與gRNA-polyT，片段大小180bp；第二輪PCR是以第一輪PCR產物為模板，用引物CRI-F1和CRI-R2擴增即得OsU6-BADH2-gRNA-polyT片段，片段大小489bp，序列如SEQ ID NO:2所示；
2)載體pHZ1-CAS9-gRNA-BADH2的構建
將OsU6-BADH2-gRNA-polyT片段與經Hind III酶切後的PMDC99-Cas9載體分別進行瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收後進行無縫克隆，基於同源重組的原理，OsU6-BADH2-gRNA-polyT片段通過Infusion的方法融合到PMDC99-CAS9載體的Hind III位點，即構建得到pHZ1-CAS9-gRNA-BADH2載體。
其中，步驟1)中使用的引物序列如下：
CRI-F1：5』-CGACGGCCAGTGCCAAGCTTCTCGGATCCACTAGTAACGGC-3』
SQ3-R1：5』-AGCGCGGGGGCGCGCCACTCACACAAGCGACAGCGCGCGGG-3』
SQ3-F2：5』-GAGTGGCGCGCCCCCGCGCTGTTTTAGAGCTAGAAATAGCA-3』
CRI-R2:5』-ACCTGCAGGCATGCAAGCTTCGACCTCGAGCGGCCGCCAGT-3』
本發明的pHZ1-CAS9-gRNA-BADH2載體的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
本發明還提供所述方法在水稻BADH2基因定點突變育種中的應用。
包括以下步驟：
(1)水稻『日本晴』成熟胚誘導愈傷組織；
(2)將誘導的愈傷組織浸入攜帶pHZ1-CAS9-gRNA-BADH2載體的農桿菌菌液中侵染；優選使用農桿菌菌株為EHA105；
(3)將愈傷組織移至共培養培養基上培養，洗去農桿菌後移至預篩選培養基上培養，再移至篩選培養基上進行抗性愈傷組織篩選；
(4)將抗性愈傷組織移至再生培養上培養，形成再生幼苗；
(5)再生幼苗在生根培養基上生根後煉苗、移栽，得到轉基因水稻；
(6)根據sgRNA作用位點的核苷酸序列設計引物，通過PCR法鑑定水稻植株突變位點。
前述應用中，步驟(1)具體為：成熟種子脫粒後去殼，用75％酒精洗2分鐘，再浸入次氯酸鈉溶液(活性氯5.5％)中，在搖床上搖30min，水洗5次，種子處理後置於NBi培養基中用於誘導愈傷，26℃光照14h/暗10h培養15-20天；剝取愈傷組織，移至新的NBi培養基上，26℃暗培養4天後用於侵染。
所述攜帶pHZ1-CAS9-gRNA-BADH2載體的農桿菌菌液的製備方法如下：從-80℃冰箱中取農桿菌感受態在冰上解凍，加入3-5μL質粒pHZ1-CAS9-gRNA-BADH2混勻，冰置30min，放入液氮中1min，然後37℃水浴鍋中熱激1min，在無菌操作臺中對應加入1mL YEP培養基，28℃搖床上搖2-4h，取出，8000rpm/min離心1min，在無菌操作臺中倒掉部分上清，用塗布器均勻地把剩下的懸濁液混勻塗在加有利福平和卡那黴素的YEP平板上，封口膜封口後放入28℃培養箱培養。2d後挑取單菌落，28℃搖菌24-36h後，進行菌落PCR，獲得陽性菌落。
用移液槍從100mL農桿菌懸浮液(所述農桿菌懸浮液的配方按1L計為：20×N6母液50mL，100×EDTA-Fe母液10mL，100×B5微量元素母液10mL，100×B5維生素母液10mL，CEH 0.3g，肌醇2g，蔗糖30g，3』,5』-二甲氧基-4』-羥基苯乙酮100μM，pH 5.2～5.3)中吸取800μL衝洗農桿菌菌板三至四次，吸取菌液3～5滴到懸浮液中，稍有混濁即可(即菌液濃度達到OD600為0.3左右)，將愈傷組織用鑷子夾入懸浮液中，計時15min，每隔三四分鐘搖晃一次，使其充分接觸。倒去菌液，將感染過的愈傷組織倒在無菌濾紙上，吸乾其表面多餘的菌液，10min後將愈傷移至NBco共培養基上，放至組培間26℃條件下，光照培養2～3d，直到愈傷組織周圍看得見農桿菌長出。
將侵染過的愈傷放入滅菌的空三角瓶中，用無菌水衝洗數次，直到水變清澈為止，在100mL滅菌的無菌水中加入200μL頭孢(cef，濃度0.25g/mL，終濃度500mg/L)，將愈傷用鑷子夾入三角瓶，放於28℃搖床上搖15min，將裝有頭孢的水倒出，將愈傷撥到無菌濾紙上充分吹乾，定期翻動愈傷，1-2小時後將愈傷放入NBps預篩選培養基上，26℃下暗培養7d。
將NBps預篩選培養基上的愈傷移到NBS篩選培養基上。1個月後，將長出的抗性愈傷依次編號置於再生培養基上，26℃下光照14h/暗10h培養3-4周左右。
待再生培養基中的抗性愈傷發育長出2-3釐米的小苗之後，即可用鑷子輕輕夾出，放在滅過菌的空培養皿上，除去苗周圍及根部的培養基和舊的愈傷，然後輕輕放入有3.5cm高的生根培養基的生根管中，每管中放一棵苗，編號與再生管編號一致。26℃下光照14h/黑暗10h培養3-4周，待小苗長出粗壯而發達的根系後即可開蓋煉苗培養，定期向管中加水。小苗長至葉片直立且根系發達時，將小苗根部培養基洗淨後繼續放入生根管中並加入水，待小苗足夠健壯後種於土中。
本發明中，所述共培養培養基的配方按2L計為：
20×N6母液100mL，100×EDTA-Fe母液20mL，100×B5微量元素母液20mL，100×B5維生素母液20mL，穀氨醯胺1g，脯氨酸1g，CEH 0.6g，肌醇0.2g，蔗糖60g，2,4-D 4mg，AS(即3』,5』-二甲氧基-4』-羥基苯乙酮)100μM，植物膠5.2g，pH 5.2～5.3。
所述預篩選培養基配方為：
含有500mg/L頭孢黴素的NBi培養基，pH＝5.8。
所述篩選培養基的配方為：
含有終濃度為40mg/L的潮黴素和終濃度為500mg/L的頭孢黴素的NBi培養基，pH 5.8。
所述再生培養的配方為：
不含2,4-D的NBi培養基，含有終濃度為3mg/L的6-BA、終濃度為0.5mg/L的NAA和終濃度為30mg/L的潮黴素，pH 5.8。
所述生根培養基的配方按2L計為：
20×MS大量元素母液50mL，100×EDTA-Fe母液10mL，100×MS微量元素母液10mL，100×B5維生素母液20mL，肌醇0.2g，葡萄糖14g，蔗糖6g，植物膠5.2g，潮黴素終濃度40mg/L，pH 5.8。
其中，所述NBi培養基的配方按2L計為：
20×N6母液100mL，100×EDTA-Fe母液20mL，100×B5微量元素母液20mL，100×B5維生素母液20mL，穀氨醯胺1g，脯氨酸1g，CEH 0.6g，肌醇0.2g，蔗糖60g，2,4-D 4mg，植物膠5.2g，pH 5.8。
所述20×N6母液的配方按1L計為：
KNO3：56.6g，(NH4)2SO4：9.26g，KH2PO4：8.00g，MgSO4·7H2O：3.70g，CaCl2·2H2O：3.32g。
所述100×EDTA-Fe母液的配方按1L計為：
FeSO4·7H2O 2.78g，Na2-EDTA 3.73g。
所述100×B5微量元素母液的配方按1L計為：
MnSO4·H2O 1.0g，ZnSO4·7H2O 0.2g，H3BO3 0.3g，CuSO4·5H2O 2.5mg，Na2MoO4·2H2O 25.0mg，CoCl2·6H2O 2.5mg，KI 75.0mg。
所述100×B5維生素母液的配方按500mL計為：
鹽酸硫胺素VB1 500mg，鹽酸吡哆醇VB6 50mg，煙酸VB5 50mg。
所述20×MS大量元素母液的配方按1L計為：
KNO3 38.0g，NH4NO3 33.0g，KH2PO4 3.4g，MgSO4·7H2O 7.4g，CaCl2·2H2O 8.8g。
所述100×MS微量元素母液的配方按1L計為：
MnSO4·H2O 1.56g，ZnSO4·7H2O 0.86g，H3BO3 0.62g，CuSO4·5H2O 2.5mg，Na2MoO4·2H2O 25.0mg，CoCl2·6H2O 2.5mg，KI 83.0mg。
前述應用中，步驟(6)選取靶位點上下遊各200bp-400bp序列，設計引物，進行PCR擴增，擴增片段送測序，通過峰圖判斷靶位點是否發生突變。鑑定BADH2突變效果的引物序列如下，片段大小494bp。
JDSQ3F1：5』-ACCTATCGCTTTCCACCTCA-3』
JDSQ3R1：5』-CGGTTCCTCTTCAGCGCCTC-3』
本發明進一步提供用於水稻BADH2基因定點突變的CRISPR-CAS9載體，所述載體的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
本發明通過CRISPR-CAS9技術對水稻內源基因BADH2進行編輯，獲得了BADH2突變體，在創製香米種質資源上更為便捷高效。利用該方法成功實現了對水稻BADH2基因的定點突變，該方法具有實驗周期短、操作簡便等特點，為水稻改良育種提供了新方法，對於改良水稻性狀具有重大實際意義。
附圖說明
圖1為本發明實施例1中OsU6-BADH2-gRNA-polyT片段的構建圖。
圖2為本發明實施例1中pHZ1-CAS9-gRNA-BADH2載體的雙酶切電泳結果。
圖3為本發明載體Cris-GL3的質粒圖譜。
圖4為本發明載體PMDC99-CAS9的質粒圖譜。
圖5為本發明載體pHZ1-CAS9-gRNA-BADH2的質粒圖譜。
圖6為本發明實施例2中轉基因水稻BADH2基因敲除的PCR檢測結果。
圖7為本發明實施例2中轉基因水稻植株FZCX3-1(A)和FZCX3-2(B)測序峰圖。
圖8為本發明實施例2中轉基因水稻植株(T0代)FZCX3-1和FZCX3-2突變類型的預測結果。通過分析FZCX3-1、FZCX3-2植株測序峰圖中的套峰情況，結合DSDecode預測結果，確認FZCX3-1、FZCX3-2植株中BADH2的突變類型都是一條鏈有4個鹼基的缺失(缺失位置一致)，另一條鏈有5個鹼基的突變(兩個株系鹼基突變位置不一致)。
具體實施方式
以下實施例用於說明本發明，但不用來限制本發明的範圍。若未特別指明，實施例均按照常規實驗條件，如Sambrook等分子克隆實驗手冊(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照製造廠商說明書建議的條件。
實施例1載體pHZ1-CAS9-gRNA-BADH2的構建
1、水稻BADH2(LOC_Os08g32870)基因中靶位點的選擇
登錄植物轉錄因子資料庫(http://rice.plantbiology.msu.edu/analyses_search_locus.shtml)，查詢水稻BADH2基因(LOC號：LOC_Os08g32870)的序列，設計基於CRISPR/Cas9的sgRNA序列。
sgRNA作用位點的核苷酸序列為5』-GAGTGGCGCGCCCCCGCGCT-3』。
2、載體pHZ1-CAS9-gRNA-BADH2的構建
1)OsU6-BADH2-gRNA-polyT片段的構建
第一輪PCR以Cris-GL3質粒為模板，用引物CRI-F1和SQ3-R1擴增OsU6啟動子與BADH2基因的20bp靶序列，片段大小329bp；同樣以Cris-GL3質粒為模板，用引物SQ3-F2和CRI-R2擴增BADH2基因的20bp靶序列與gRNA-polyT，片段大小180bp；第二輪PCR是以第一輪PCR產物為模板，用引物CRI-F1和CRI-R2擴增即得OsU6-BADH2-gRNA-polyT片段，片段大小489bp，序列如SEQ ID NO:2所示。(圖1)
2)載體pHZ1-CAS9-gRNA-BADH2的構建
將OsU6-BADH2-gRNA-polyT片段與經Hind III酶切後的PMDC99-Cas9載體分別進行瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收後進行無縫克隆，基於同源重組的原理，OsU6-BADH2-gRNA-polyT片段通過Infusion的方法融合到PMDC99-CAS9載體的Hind III位點，即構建得到pHZ1-CAS9-gRNA-BADH2載體(序列如SEQ ID NO:3所示)。
其中，步驟1)中使用的引物序列如下：
CRI-F1：5』-CGACGGCCAGTGCCAAGCTTCTCGGATCCACTAGTAACGGC-3』
SQ3-R1：5』-AGCGCGGGGGCGCGCCACTCACACAAGCGACAGCGCGCGGG-3』
SQ3-F2：5』-GAGTGGCGCGCCCCCGCGCTGTTTTAGAGCTAGAAATAGCA-3』
CRI-R2:5』-ACCTGCAGGCATGCAAGCTTCGACCTCGAGCGGCCGCCAGT-3』。
載體pHZ1-CAS9-gRNA-BADH2的驗證：用BamH I/Hind III雙酶切。酶切結果見圖2，第1泳道代表pHZ1-CAS9-gRNA-BADH2載體酶切結果，可獲得9205bp、5180bp、447bp三個條帶。第2泳道代表PMDC99-CAS9對照載體酶切結果，可獲得9197bp、5180bp兩個條帶，M為2kb Marker，條帶大小分別為2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp。
Cris-GL3質粒、PMDC99-CAS9載體和載體pHZ1-CAS9-gRNA-BADH2的質粒圖譜分別見圖3-圖5。
實施例2水稻BADH2基因定點突變植株的製備方法
1、農桿菌轉化及菌落PCR鑑定
從-80℃冰箱中取農桿菌感受態在冰上解凍，加入3-5μL質粒pHZ1-CAS9-gRNA-BADH2混勻，冰置30min，放入液氮中1min，然後37℃水浴鍋中熱激1min，在無菌操作臺中對應加入1mL YEP培養基，28℃搖床上搖2-4h，取出，8000rpm/min離心1min，在無菌操作臺中倒掉部分上清，用塗布器均勻地把剩下的懸濁液混勻塗在加有利福平和卡那黴素的YEP平板上，封口膜封口後放入28℃培養箱培養。2d後挑取單菌落，28℃搖菌24-36h後，進行菌落PCR，獲得陽性菌落。
菌落PCR：模板的製備：從試管中吸取200μL的菌液於1.5mL離心管中，先8000rpm/min離心1min倒掉上清液，分別加入50μL的ddH2O懸浮沉澱，放入沸水中煮沸2min，12000rpm/min離心5min，吸取上清作為模板。陽性對照：以稀釋20-50倍的質粒1μL為模板。陰性對照：以1μL ddH2O為模板。
2、農桿菌介導的水稻轉化
(1)成熟胚誘導愈傷
水稻『日本晴』成熟種子脫粒後需去殼，用75％酒精洗2分鐘，再浸入次氯酸鈉溶液(活性氯5.5％)中，在搖床上搖30min(可根據實際情況搖兩次，每次20min)，水洗5次，種子處理之後放在NBi培養基中用於誘導愈傷，26℃下光照14h/暗10h培養。
(2)剝取愈傷組織
成熟胚誘導愈傷需15-20天長出，在超淨臺中無菌濾紙上，用鑷子和鉤子剝取愈傷組織，移至新的NBi培養基上，26℃下暗培養。愈傷剝下後在NBi培養基上培養4天即可用於侵染，不侵染的應定期在新NBi培養基上繼代培養，長時間培養後侵染率會下降。
(3)侵染
用移液槍從100mL農桿菌懸浮液(所述農桿菌懸浮液的配方按1L計為：20×N6母液50mL，100×EDTA-Fe母液10mL，100×B5微量元素母液10mL，100×B5維生素母液10mL，CEH 0.3g，肌醇2g，蔗糖30g，AS 100μM，pH 5.2～5.3)中吸取800μL衝洗農桿菌菌板三至四次，吸取菌液3～5滴到懸浮液中，稍有混濁即可(即菌液濃度達到OD600為0.3左右)，將愈傷組織用鑷子夾入懸浮液中，計時15min，每隔三四分鐘搖晃一次，使其充分接觸。倒去菌液，將感染過的愈傷組織倒在無菌濾紙上，吸乾其表面多餘的菌液，10min後將愈傷移至NBco共培養基上，放至組培間26℃條件下，光照培養2～3d，直到愈傷組織周圍看得見農桿菌長出。
(4)清洗愈傷及預篩選
將侵染過的愈傷放入滅菌的空三角瓶中，用無菌水衝洗數次，直到水變清澈為止，在100mL滅菌的無菌水中加入200μL頭孢(cef，濃度0.25g/mL，終濃度500mg/L)，將愈傷用鑷子夾入三角瓶，放於28℃搖床上搖15min，將裝有頭孢的水倒出，將愈傷撥到無菌濾紙上充分吹乾，定期翻動愈傷，1-2小時後將愈傷放入NBps預篩選培養基上，26℃下暗培養7d。
(5)篩選
將NBps預篩選培養基上的愈傷移到NBS篩選培養基上。
(6)再生培養
1個月後，將長出的抗性愈傷依次編號置於再生培養基上，26℃下光照14h/暗10h培養3-4周左右。
(7)生根培養
待再生培養基中的抗性愈傷發育長出2-3釐米的小苗之後，即可用鑷子輕輕夾出，放在滅過菌的空培養皿上，除去苗周圍及根部的培養基和舊的愈傷，然後輕輕放入有3.5cm高的生根培養基的生根管中，每管中放一棵苗，編號與再生管編號一致。26℃下光照14h/黑暗10h培養3-4周，待小苗長出粗壯而發達的根系後即可開蓋煉苗培養，定期向管中加自來水。
(8)種苗
小苗長至葉片直立且根系發達時，將小苗根部培養基洗淨後繼續放入生根管中並加入自來水，待小苗足夠健壯後種於土中。
3、BADH2敲除效果檢測
選取靶位點上下遊各200bp-400bp序列，設計引物，進行PCR擴增，擴增片段送測序，通過峰圖判斷靶位點是否發生突變。鑑定BADH2突變效果的引物序列如下，片段大小494bp。
JDSQ3F1：5』-ACCTATCGCTTTCCACCTCA-3』
JDSQ3R1：5』-CGGTTCCTCTTCAGCGCCTC-3』
擴增結果見圖6，第1泳道表示BADH2轉基因植株中第107號株系第1棵苗T0代植株，將其命名為FZCX3-1，第2泳道表示BADH2轉基因植株中第132號株系第2棵苗T0代植株，將其命名為FZCX3-2；+表示日本晴基因組正對照，-表示ddH2O負對照，M為2kb Marker，條帶大小分別為2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp。
將上述BADH2的PCR片段送測序，測序引物為JDSQ3F1，FZCX3-1、FZCX3-2植株(T0代)測序結果表明BADH2在PAM位點(即CGG序列)附近出現突變。
FZCX3-1和FZCX3-2植株測序峰圖分別見圖7A和圖7B。將測序結果在DSDecode網站(http://dsdecode.scgene.com/home/)中進行突變類型的預測，結果見圖8。
由此可知，FZCX3-1植株中BADH2是複合雜合子突變。其中一條鏈缺失4個鹼基，另一條鏈是5個鹼基的突變；FZCX3-2植株中BADH2也是複合雜合子突變。其中一條鏈缺失4個鹼基，缺失位置與FZCX3-1中一樣，另一條鏈是5個鹼基的突變，突變位置部分不一樣。
FZCX3-1與FZCX3-2中4個鹼基的缺失造成移碼，翻譯提前終止，鹼基序列及推導胺基酸序列如下：
ATGGCCACGGCGATCCCGCAGCGGCAGCTCTTCGTCGCCGGCGAGTGGCGCGCCCGCTCGGCCGCCGCCTCCCCGTCGTCAACCCCGCCACCGAGTCCCCCATCGGCGAGATCCCGGCGGGCACGGCGGAGGACGTGGACGCGGCGGTGGCGGCGGCGCGGGAGGCGCTGAAGAGGAACCGGGGCCGCGACTGGGCGCGCGCGCCGGGCGCCGTCCGGGCCAAGTACCTCCGCGCAATCGCGGCCAAGATAATCGAGAGGAAATCTGAGCTGGCTAGACTAGAGACGCTTGATTGTGGGAAGCCTCTTGATGAAGCAGCATGGGACATGGACGATGTTGCTGGATGCTTTGAGTACTTTGCAGATCTTGCAGAATCCTTGGACAAAAGGCAAAATGCACCTGTCTCTCTTCCAATGGAAAACTTTAAATGCTATCTTCGGAAAGAGCCTATCGGTGTAGTTGGGTTGATCACACCTTGGAACTATCCTCTCCTGATGGCAACATGGAAGGTAGCTCCTGCCCTGGCTGCTGGCTGTACAGCTGTACTAAAACCATCTGAATTGGCTTCCGTGACTTGTTTGGAGCTTGCTGATGTGTGTAAAGAGGTTGGTCTTCCTTCAGGTGTGCTAAACATAGTGACTGGATTAGGTTCTGAAGCCGGTGCTCCTTTGTCATCACACCCTGGTGTAGACAAGGTTGCATTTACTGGGAGTTATGAAACTGGTAAAAAGATTATGGCTTCAGCTGCTCCTATGGTTAAGCCTGTTTCACTGGAACTTGGTGGAAAAAGTCCTATAGTGGTGTTTGATGATGTTGATGTTGAAAAAGCTGTTGAGTGGACTCTCTTTGGTTGCTTTTGGACCAATGGCCAGATTTGCAGTGCAACATCGCGTCTTATTCTTCATAAAAAAATCGCTAAAGAATTTCAAGAAAGGATGGTTGCATGGGCCAAAAATATTAAGGTGTCAGATCCACTTGAAGAGGGTTGCAGGCTTGGGCCCGTTGTTAGTGAAGGACAGTATGAGAAGATTAAGCAATTTGTATCTACCGCCAAAAGCCAAGGTGCTACCATTCTGACTGGTGGGGTTAGACCCAAGCATCTGGAGAAAGGTTTCTATATTGAACCCACAATCATTACTGATGTCGATACATCAATGCAAATTTGGAGGGAAGAAGTTTTTGGTCCAGTGCTCTGTGTGAAAGAATTTAGCACTGAAGAAGAAGCCATTGAATTGGCCAACGATACTCATTATGGTCTGGCTGGTGCTGTGCTTTCCGGTGACCGCGAGCGATGCCAGAGATTAACTGAGGAGATCGATGCCGGAATTATCTGGGTGAACTGCTCGCAACCCTGCTTCTGCCAAGCTCCATGGGGCGGGAACAAGCGCAGCGGCTTTGGACGCGAGCTCGGAGAAGGGGGCATTGACAACTACCTAAGCGTCAAGCAAGTGACGGAGTACGCCTCCGATGAGCCGTGGGGATGGTACAAATCCCCTTCCAAGCTGTAA
MATAIPQRQLFVAGEWRARSAAASPSSTPPPSPPSARSRRARRRTWTRRWRRRGRR.RGTGAATGRARRAPSGPSTSAQSRPR.SRGNLSWLD.RRLIVGSLLMKQHGTWTMLLDALSTLQILQNPWTKGKMHLSLFQWKTLNAIFGKSLSV.LG.SHLGTILS.WQHGR.LLPWLLAVQLY.NHLNWLP.LVWSLLMCVKRLVFLQVC.T..LD.VLKPVLLCHHTLV.TRLHLLGVMKLVKRLWLQLLLWLSLFHWNLVEKVL.WCLMMLMLKKLLSGLSLVAFGPMARFAVQHRVLFFIKKSLKNFKKGWLHGPKILRCQIHLKRVAGLGPLLVKDSMRRLSNLYLPPKAKVLPF.LVGLDPSIWRKVSILNPQSLLMSIHQCKFGGKKFLVQCSV.KNLALKKKPLNWPTILIMVWLVLCFPVTASDARD.LRRSMPELSG.TARNPASAKLHGAGTSAAALDASSEKGALTTT.ASSK.RSTPPMSRGDGTNPLPSC
FZCX3-1中5個鹼基的突變造成3個連續胺基酸突變，其鹼基序列及推導胺基酸序列如下：
ATGGCCACGGCGATCCCGCAGCGGCAGCTCTTCGTCGCCGGCGAGTGGCGCGCCCCCGGGCGGCGGCGCCGCCTCCCCGTCGTCAACCCCGCCACCGAGTCCCCCATCGGCGAGATCCCGGCGGGCACGGCGGAGGACGTGGACGCGGCGGTGGCGGCGGCGCGGGAGGCGCTGAAGAGGAACCGGGGCCGCGACTGGGCGCGCGCGCCGGGCGCCGTCCGGGCCAAGTACCTCCGCGCAATCGCGGCCAAGATAATCGAGAGGAAATCTGAGCTGGCTAGACTAGAGACGCTTGATTGTGGGAAGCCTCTTGATGAAGCAGCATGGGACATGGACGATGTTGCTGGATGCTTTGAGTACTTTGCAGATCTTGCAGAATCCTTGGACAAAAGGCAAAATGCACCTGTCTCTCTTCCAATGGAAAACTTTAAATGCTATCTTCGGAAAGAGCCTATCGGTGTAGTTGGGTTGATCACACCTTGGAACTATCCTCTCCTGATGGCAACATGGAAGGTAGCTCCTGCCCTGGCTGCTGGCTGTACAGCTGTACTAAAACCATCTGAATTGGCTTCCGTGACTTGTTTGGAGCTTGCTGATGTGTGTAAAGAGGTTGGTCTTCCTTCAGGTGTGCTAAACATAGTGACTGGATTAGGTTCTGAAGCCGGTGCTCCTTTGTCATCACACCCTGGTGTAGACAAGGTTGCATTTACTGGGAGTTATGAAACTGGTAAAAAGATTATGGCTTCAGCTGCTCCTATGGTTAAGCCTGTTTCACTGGAACTTGGTGGAAAAAGTCCTATAGTGGTGTTTGATGATGTTGATGTTGAAAAAGCTGTTGAGTGGACTCTCTTTGGTTGCTTTTGGACCAATGGCCAGATTTGCAGTGCAACATCGCGTCTTATTCTTCATAAAAAAATCGCTAAAGAATTTCAAGAAAGGATGGTTGCATGGGCCAAAAATATTAAGGTGTCAGATCCACTTGAAGAGGGTTGCAGGCTTGGGCCCGTTGTTAGTGAAGGACAGTATGAGAAGATTAAGCAATTTGTATCTACCGCCAAAAGCCAAGGTGCTACCATTCTGACTGGTGGGGTTAGACCCAAGCATCTGGAGAAAGGTTTCTATATTGAACCCACAATCATTACTGATGTCGATACATCAATGCAAATTTGGAGGGAAGAAGTTTTTGGTCCAGTGCTCTGTGTGAAAGAATTTAGCACTGAAGAAGAAGCCATTGAATTGGCCAACGATACTCATTATGGTCTGGCTGGTGCTGTGCTTTCCGGTGACCGCGAGCGATGCCAGAGATTAACTGAGGAGATCGATGCCGGAATTATCTGGGTGAACTGCTCGCAACCCTGCTTCTGCCAAGCTCCATGGGGCGGGAACAAGCGCAGCGGCTTTGGACGCGAGCTCGGAGAAGGGGGCATTGACAACTACCTAAGCGTCAAGCAAGTGACGGAGTACGCCTCCGATGAGCCGTGGGGATGGTACAAATCCCCTTCCAAGCTGTAA
MATAIPQRQLFVAGEWRAPGRRRRLPVVNPATESPIGEIPAGTAEDVDAAVAAAREALKRNRGRDWARAPGAVRAKYLRAIAAKIIERKSELARLETLDCGKPLDEAAWDMDDVAGCFEYFADLAESLDKRQNAPVSLPMENFKCYLRKEPIGVVGLITPWNYPLLMATWKVAPALAAGCTAVLKPSELASVTCLELADVCKEVGLPSGVLNIVTGLGSEAGAPLSSHPGVDKVAFTGSYETGKKIMASAAPMVKPVSLELGGKSPIVVFDDVDVEKAVEWTLFGCFWTNGQICSATSRLILHKKIAKEFQERMVAWAKNIKVSDPLEEGCRLGPVVSEGQYEKIKQFVSTAKSQGATILTGGVRPKHLEKGFYIEPTIITDVDTSMQIWREEVFGPVLCVKEFSTEEEAIELANDTHYGLAGAVLSGDRERCQRLTEEIDAGIIWVNCSQPCFCQAPWGGNKRSGFGRELGEGGIDNYLSVKQVTEYASDEPWGWYKSPSKL
FZCX3-2中5個鹼基的突變造成2個胺基酸突變，其鹼基序列及推導胺基酸序列如下：
ATGGCCACGGCGATCCCGCAGCGGCAGCTCTTCGTCGCCGGCGAGTGGCGCGCCCCGGGGCTGCGGCGCCGCCTCCCCGTCGTCAACCCCGCCACCGAGTCCCCCATCGGCGAGATCCCGGCGGGCACGGCGGAGGACGTGGACGCGGCGGTGGCGGCGGCGCGGGAGGCGCTGAAGAGGAACCGGGGCCGCGACTGGGCGCGCGCGCCGGGCGCCGTCCGGGCCAAGTACCTCCGCGCAATCGCGGCCAAGATAATCGAGAGGAAATCTGAGCTGGCTAGACTAGAGACGCTTGATTGTGGGAAGCCTCTTGATGAAGCAGCATGGGACATGGACGATGTTGCTGGATGCTTTGAGTACTTTGCAGATCTTGCAGAATCCTTGGACAAAAGGCAAAATGCACCTGTCTCTCTTCCAATGGAAAACTTTAAATGCTATCTTCGGAAAGAGCCTATCGGTGTAGTTGGGTTGATCACACCTTGGAACTATCCTCTCCTGATGGCAACATGGAAGGTAGCTCCTGCCCTGGCTGCTGGCTGTACAGCTGTACTAAAACCATCTGAATTGGCTTCCGTGACTTGTTTGGAGCTTGCTGATGTGTGTAAAGAGGTTGGTCTTCCTTCAGGTGTGCTAAACATAGTGACTGGATTAGGTTCTGAAGCCGGTGCTCCTTTGTCATCACACCCTGGTGTAGACAAGGTTGCATTTACTGGGAGTTATGAAACTGGTAAAAAGATTATGGCTTCAGCTGCTCCTATGGTTAAGCCTGTTTCACTGGAACTTGGTGGAAAAAGTCCTATAGTGGTGTTTGATGATGTTGATGTTGAAAAAGCTGTTGAGTGGACTCTCTTTGGTTGCTTTTGGACCAATGGCCAGATTTGCAGTGCAACATCGCGTCTTATTCTTCATAAAAAAATCGCTAAAGAATTTCAAGAAAGGATGGTTGCATGGGCCAAAAATATTAAGGTGTCAGATCCACTTGAAGAGGGTTGCAGGCTTGGGCCCGTTGTTAGTGAAGGACAGTATGAGAAGATTAAGCAATTTGTATCTACCGCCAAAAGCCAAGGTGCTACCATTCTGACTGGTGGGGTTAGACCCAAGCATCTGGAGAAAGGTTTCTATATTGAACCCACAATCATTACTGATGTCGATACATCAATGCAAATTTGGAGGGAAGAAGTTTTTGGTCCAGTGCTCTGTGTGAAAGAATTTAGCACTGAAGAAGAAGCCATTGAATTGGCCAACGATACTCATTATGGTCTGGCTGGTGCTGTGCTTTCCGGTGACCGCGAGCGATGCCAGAGATTAACTGAGGAGATCGATGCCGGAATTATCTGGGTGAACTGCTCGCAACCCTGCTTCTGCCAAGCTCCATGGGGCGGGAACAAGCGCAGCGGCTTTGGACGCGAGCTCGGAGAAGGGGGCATTGACAACTACCTAAGCGTCAAGCAAGTGACGGAGTACGCCTCCGATGAGCCGTGGGGATGGTACAAATCCCCTTCCAAGCTGTAA
MATAIPQRQLFVAGEWRAPGLRRRLPVVNPATESPIGEIPAGTAEDVDAAVAAAREALKRNRGRDWARAPGAVRAKYLRAIAAKIIERKSELARLETLDCGKPLDEAAWDMDDVAGCFEYFADLAESLDKRQNAPVSLPMENFKCYLRKEPIGVVGLITPWNYPLLMATWKVAPALAAGCTAVLKPSELASVTCLELADVCKEVGLPSGVLNIVTGLGSEAGAPLSSHPGVDKVAFTGSYETGKKIMASAAPMVKPVSLELGGKSPIVVFDDVDVEKAVEWTLFGCFWTNGQICSATSRLILHKKIAKEFQERMVAWAKNIKVSDPLEEGCRLGPVVSEGQYEKIKQFVSTAKSQGATILTGGVRPKHLEKGFYIEPTIITDVDTSMQIWREEVFGPVLCVKEFSTEEEAIELANDTHYGLAGAVLSGDRERCQRLTEEIDAGIIWVNCSQPCFCQAPWGGNKRSGFGRELGEGGIDNYLSVKQVTEYASDEPWGWYKSPSKL.
本發明成功構建獲得了雜合型BADH2突變體水稻植株FZCX3-1、FZCX3-2。利用載體pHZ1-CAS9-gRNA-BADH2對水稻BADH2基因定點突變的效率為50％。
雖然，上文中已經用一般性說明及具體實施方案對本發明作了詳盡的描述，但在本發明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬於本發明要求保護的範圍。
序列表
華智水稻生物技術有限公司
利用CRISPR-CAS9技術對水稻BADH2基因定點突變的方法
KHP161117616.2
9
PatentIn version 3.3
1
20
DNA
水稻
1
gagtggcgcg cccccgcgct 20
2
347
DNA
OsU6-BADH2-gRNA-polyT片段
2
ggatcatgaa ccaacggcct ggctgtattt ggtggttgtg tagggagatg gggagaagaa 60
aagcccgatt ctcttcgctg tgatgggctg gatgcatgcg ggggagcggg aggcccaagt 120
acgtgcacgg tgagcggccc acagggcgag tgtgagcgcg agaggcggga ggaacagttt 180
agtaccacat tgcccagcta actcgaacgc gaccaactta taaacccgcg cgctgtcgct 240
tgtgtgagtg gcgcgccccc gcgctgtttt agagctagaa atagcaagtt aaaataaggc 300
tagtccgtta tcaacttgaa aaagtggcac cgagtcggtg ctttttt 347
3
14832
DNA
pHZ1-CAS9-gRNA-BADH2載體
3
cgtaatcatg gtcatagctg tttcctgtgt gaaattgtta tccgctcaca attccacaca 60
acatacgagc cggaagcata aagtgtaaag cctggggtgc ctaatgagtg agctaactca 120
cattaattgc gttgcgctca ctgcccgctt tccagtcggg aaacctgtcg tgccagctgc 180
attaatgaat cggccaacgc gcggggagag gcggtttgcg tattggctag agcagcttgc 240
caacatggtg gagcacgaca ctctcgtcta ctccaagaat atcaaagata cagtctcaga 300
agaccaaagg gctattgaga cttttcaaca aagggtaata tcgggaaacc tcctcggatt 360
ccattgccca gctatctgtc acttcatcaa aaggacagta gaaaaggaag gtggcaccta 420
caaatgccat cattgcgata aaggaaaggc tatcgttcaa gatgcctctg ccgacagtgg 480
tcccaaagat ggacccccac ccacgaggag catcgtggaa aaagaagacg ttccaaccac 540
gtcttcaaag caagtggatt gatgtgataa catggtggag cacgacactc tcgtctactc 600
caagaatatc aaagatacag tctcagaaga ccaaagggct attgagactt ttcaacaaag 660
ggtaatatcg ggaaacctcc tcggattcca ttgcccagct atctgtcact tcatcaaaag 720
gacagtagaa aaggaaggtg gcacctacaa atgccatcat tgcgataaag gaaaggctat 780
cgttcaagat gcctctgccg acagtggtcc caaagatgga cccccaccca cgaggagcat 840
cgtggaaaaa gaagacgttc caaccacgtc ttcaaagcaa gtggattgat gtgatatctc 900
cactgacgta agggatgacg cacaatccca ctatccttcg caagaccttc ctctatataa 960
ggaagttcat ttcatttgga gaggacacgc tgaaatcacc agtctctctc tacaaatcta 1020
tctctctcga gctttcgcag atcccggggg gcaatgagat atgaaaaagc ctgaactcac 1080
cgcgacgtct gtcgagaagt ttctgatcga aaagttcgac agcgtctccg acctgatgca 1140
gctctcggag ggcgaagaat ctcgtgcttt cagcttcgat gtaggagggc gtggatatgt 1200
cctgcgggta aatagctgcg ccgatggttt ctacaaagat cgttatgttt atcggcactt 1260
tgcatcggcc gcgctcccga ttccggaagt gcttgacatt ggggagttta gcgagagcct 1320
gacctattgc atctcccgcc gtgcacaggg tgtcacgttg caagacctgc ctgaaaccga 1380
actgcccgct gttctacaac cggtcgcgga ggctatggat gcgatcgctg cggccgatct 1440
tagccagacg agcgggttcg gcccattcgg accgcaagga atcggtcaat acactacatg 1500
gcgtgatttc atatgcgcga ttgctgatcc ccatgtgtat cactggcaaa ctgtgatgga 1560
cgacaccgtc agtgcgtccg tcgcgcaggc tctcgatgag ctgatgcttt gggccgagga 1620
ctgccccgaa gtccggcacc tcgtgcacgc ggatttcggc tccaacaatg tcctgacgga 1680
caatggccgc ataacagcgg tcattgactg gagcgaggcg atgttcgggg attcccaata 1740
cgaggtcgcc aacatcttct tctggaggcc gtggttggct tgtatggagc agcagacgcg 1800
ctacttcgag cggaggcatc cggagcttgc aggatcgcca cgactccggg cgtatatgct 1860
ccgcattggt cttgaccaac tctatcagag cttggttgac ggcaatttcg atgatgcagc 1920
ttgggcgcag ggtcgatgcg acgcaatcgt ccgatccgga gccgggactg tcgggcgtac 1980
acaaatcgcc cgcagaagcg cggccgtctg gaccgatggc tgtgtagaag tactcgccga 2040
tagtggaaac cgacgcccca gcactcgtcc gagggcaaag aaatagagta gatgccgacc 2100
ggatctgtcg atcgacaagc tcgagtttct ccataataat gtgtgagtag ttcccagata 2160
agggaattag ggttcctata gggtttcgct catgtgttga gcatataaga aacccttagt 2220
atgtatttgt atttgtaaaa tacttctatc aataaaattt ctaattccta aaaccaaaat 2280
ccagtactaa aatccagatc ccccgaatta attcggcgtt aattcagtac attaaaaacg 2340
tccgcaatgt gttattaagt tgtctaagcg tcaatttgtt tacaccacaa tatatcctgc 2400
caccagccag ccaacagctc cccgaccggc agctcggcac aaaatcacca ctcgatacag 2460
gcagcccatc agtccgggac ggcgtcagcg ggagagccgt tgtaaggcgg cagactttgc 2520
tcatgttacc gatgctattc ggaagaacgg caactaagct gccgggtttg aaacacggat 2580
gatctcgcgg agggtagcat gttgattgta acgatgacag agcgttgctg cctgtgatca 2640
ccgcggtttc aaaatcggct ccgtcgatac tatgttatac gccaactttg aaaacaactt 2700
tgaaaaagct gttttctggt atttaaggtt ttagaatgca aggaacagtg aattggagtt 2760
cgtcttgtta taattagctt cttggggtat ctttaaatac tgtagaaaag aggaaggaaa 2820
taataaatgg ctaaaatgag aatatcaccg gaattgaaaa aactgatcga aaaataccgc 2880
tgcgtaaaag atacggaagg aatgtctcct gctaaggtat ataagctggt gggagaaaat 2940
gaaaacctat atttaaaaat gacggacagc cggtataaag ggaccaccta tgatgtggaa 3000
cgggaaaagg acatgatgct atggctggaa ggaaagctgc ctgttccaaa ggtcctgcac 3060
tttgaacggc atgatggctg gagcaatctg ctcatgagtg aggccgatgg cgtcctttgc 3120
tcggaagagt atgaagatga acaaagccct gaaaagatta tcgagctgta tgcggagtgc 3180
atcaggctct ttcactccat cgacatatcg gattgtccct atacgaatag cttagacagc 3240
cgcttagccg aattggatta cttactgaat aacgatctgg ccgatgtgga ttgcgaaaac 3300
tgggaagaag acactccatt taaagatccg cgcgagctgt atgatttttt aaagacggaa 3360
aagcccgaag aggaacttgt cttttcccac ggcgacctgg gagacagcaa catctttgtg 3420
aaagatggca aagtaagtgg ctttattgat cttgggagaa gcggcagggc ggacaagtgg 3480
tatgacattg ccttctgcgt ccggtcgatc agggaggata tcggggaaga acagtatgtc 3540
gagctatttt ttgacttact ggggatcaag cctgattggg agaaaataaa atattatatt 3600
ttactggatg aattgtttta gtacctagaa tgcatgacca aaatccctta acgtgagttt 3660
tcgttccact gagcgtcaga ccccgtagaa aagatcaaag gatcttcttg agatcctttt 3720
tttctgcgcg taatctgctg cttgcaaaca aaaaaaccac cgctaccagc ggtggtttgt 3780
ttgccggatc aagagctacc aactcttttt ccgaaggtaa ctggcttcag cagagcgcag 3840
ataccaaata ctgtccttct agtgtagccg tagttaggcc accacttcaa gaactctgta 3900
gcaccgccta catacctcgc tctgctaatc ctgttaccag tggctgctgc cagtggcgat 3960
aagtcgtgtc ttaccgggtt ggactcaaga cgatagttac cggataaggc gcagcggtcg 4020
ggctgaacgg ggggttcgtg cacacagccc agcttggagc gaacgaccta caccgaactg 4080
agatacctac agcgtgagct atgagaaagc gccacgcttc ccgaagggag aaaggcggac 4140
aggtatccgg taagcggcag ggtcggaaca ggagagcgca cgagggagct tccaggggga 4200
aacgcctggt atctttatag tcctgtcggg tttcgccacc tctgacttga gcgtcgattt 4260
ttgtgatgct cgtcaggggg gcggagccta tggaaaaacg ccagcaacgc ggccttttta 4320
cggttcctgg ccttttgctg gccttttgct cacatgttct ttcctgcgtt atcccctgat 4380
tctgtggata accgtattac cgcctttgag tgagctgata ccgctcgccg cagccgaacg 4440
accgagcgca gcgagtcagt gagcgaggaa gcggaagagc gcctgatgcg gtattttctc 4500
cttacgcatc tgtgcggtat ttcacaccgc atatggtgca ctctcagtac aatctgctct 4560
gatgccgcat agttaagcca gtatacactc cgctatcgct acgtgactgg gtcatggctg 4620
cgccccgaca cccgccaaca cccgctgacg cgccctgacg ggcttgtctg ctcccggcat 4680
ccgcttacag acaagctgtg accgtctccg ggagctgcat gtgtcagagg ttttcaccgt 4740
catcaccgaa acgcgcgagg cagggtgcct tgatgtgggc gccggcggtc gagtggcgac 4800
ggcgcggctt gtccgcgccc tggtagattg cctggccgta ggccagccat ttttgagcgg 4860
ccagcggccg cgataggccg acgcgaagcg gcggggcgta gggagcgcag cgaccgaagg 4920
gtaggcgctt tttgcagctc ttcggctgtg cgctggccag acagttatgc acaggccagg 4980
cgggttttaa gagttttaat aagttttaaa gagttttagg cggaaaaatc gccttttttc 5040
tcttttatat cagtcactta catgtgtgac cggttcccaa tgtacggctt tgggttccca 5100
atgtacgggt tccggttccc aatgtacggc tttgggttcc caatgtacgt gctatccaca 5160
ggaaagagac cttttcgacc tttttcccct gctagggcaa tttgccctag catctgctcc 5220
gtacattagg aaccggcgga tgcttcgccc tcgatcaggt tgcggtagcg catgactagg 5280
atcgggccag cctgccccgc ctcctccttc aaatcgtact ccggcaggtc atttgacccg 5340
atcagcttgc gcacggtgaa acagaacttc ttgaactctc cggcgctgcc actgcgttcg 5400
tagatcgtct tgaacaacca tctggcttct gccttgcctg cggcgcggcg tgccaggcgg 5460
tagagaaaac ggccgatgcc gggatcgatc aaaaagtaat cggggtgaac cgtcagcacg 5520
tccgggttct tgccttctgt gatctcgcgg tacatccaat cagctagctc gatctcgatg 5580
tactccggcc gcccggtttc gctctttacg atcttgtagc ggctaatcaa ggcttcaccc 5640
tcggataccg tcaccaggcg gccgttcttg gccttcttcg tacgctgcat ggcaacgtgc 5700
gtggtgttta accgaatgca ggtttctacc aggtcgtctt tctgctttcc gccatcggct 5760
cgccggcaga acttgagtac gtccgcaacg tgtggacgga acacgcggcc gggcttgtct 5820
cccttccctt cccggtatcg gttcatggat tcggttagat gggaaaccgc catcagtacc 5880
aggtcgtaat cccacacact ggccatgccg gccggccctg cggaaacctc tacgtgcccg 5940
tctggaagct cgtagcggat cacctcgcca gctcgtcggt cacgcttcga cagacggaaa 6000
acggccacgt ccatgatgct gcgactatcg cgggtgccca cgtcatagag catcggaacg 6060
aaaaaatctg gttgctcgtc gcccttgggc ggcttcctaa tcgacggcgc accggctgcc 6120
ggcggttgcc gggattcttt gcggattcga tcagcggccg cttgccacga ttcaccgggg 6180
cgtgcttctg cctcgatgcg ttgccgctgg gcggcctgcg cggccttcaa cttctccacc 6240
aggtcatcac ccagcgccgc gccgatttgt accgggccgg atggtttgcg accgtcacgc 6300
cgattcctcg ggcttggggg ttccagtgcc attgcagggc cggcagacaa cccagccgct 6360
tacgcctggc caaccgcccg ttcctccaca catggggcat tccacggcgt cggtgcctgg 6420
ttgttcttga ttttccatgc cgcctccttt agccgctaaa attcatctac tcatttattc 6480
atttgctcat ttactctggt agctgcgcga tgtattcaga tagcagctcg gtaatggtct 6540
tgccttggcg taccgcgtac atcttcagct tggtgtgatc ctccgccggc aactgaaagt 6600
tgacccgctt catggctggc gtgtctgcca ggctggccaa cgttgcagcc ttgctgctgc 6660
gtgcgctcgg acggccggca cttagcgtgt ttgtgctttt gctcattttc tctttacctc 6720
attaactcaa atgagttttg atttaatttc agcggccagc gcctggacct cgcgggcagc 6780
gtcgccctcg ggttctgatt caagaacggt tgtgccggcg gcggcagtgc ctgggtagct 6840
cacgcgctgc gtgatacggg actcaagaat gggcagctcg tacccggcca gcgcctcggc 6900
aacctcaccg ccgatgcgcg tgcctttgat cgcccgcgac acgacaaagg ccgcttgtag 6960
ccttccatcc gtgacctcaa tgcgctgctt aaccagctcc accaggtcgg cggtggccca 7020
tatgtcgtaa gggcttggct gcaccggaat cagcacgaag tcggctgcct tgatcgcgga 7080
cacagccaag tccgccgcct ggggcgctcc gtcgatcact acgaagtcgc gccggccgat 7140
ggccttcacg tcgcggtcaa tcgtcgggcg gtcgatgccg acaacggtta gcggttgatc 7200
ttcccgcacg gccgcccaat cgcgggcact gccctgggga tcggaatcga ctaacagaac 7260
atcggccccg gcgagttgca gggcgcgggc tagatgggtt gcgatggtcg tcttgcctga 7320
cccgcctttc tggttaagta cagcgataac cttcatgcgt tccccttgcg tatttgttta 7380
tttactcatc gcatcatata cgcagcgacc gcatgacgca agctgtttta ctcaaataca 7440
catcaccttt ttagacggcg gcgctcggtt tcttcagcgg ccaagctggc cggccaggcc 7500
gccagcttgg catcagacaa accggccagg atttcatgca gccgcacggt tgagacgtgc 7560
gcgggcggct cgaacacgta cccggccgcg atcatctccg cctcgatctc ttcggtaatg 7620
aaaaacggtt cgtcctggcc gtcctggtgc ggtttcatgc ttgttcctct tggcgttcat 7680
tctcggcggc cgccagggcg tcggcctcgg tcaatgcgtc ctcacggaag gcaccgcgcc 7740
gcctggcctc ggtgggcgtc acttcctcgc tgcgctcaag tgcgcggtac agggtcgagc 7800
gatgcacgcc aagcagtgca gccgcctctt tcacggtgcg gccttcctgg tcgatcagct 7860
cgcgggcgtg cgcgatctgt gccggggtga gggtagggcg ggggccaaac ttcacgcctc 7920
gggccttggc ggcctcgcgc ccgctccggg tgcggtcgat gattagggaa cgctcgaact 7980
cggcaatgcc ggcgaacacg gtcaacacca tgcggccggc cggcgtggtg gtgtcggccc 8040
acggctctgc caggctacgc aggcccgcgc cggcctcctg gatgcgctcg gcaatgtcca 8100
gtaggtcgcg ggtgctgcgg gccaggcggt ctagcctggt cactgtcaca acgtcgccag 8160
ggcgtaggtg gtcaagcatc ctggccagct ccgggcggtc gcgcctggtg ccggtgatct 8220
tctcggaaaa cagcttggtg cagccggccg cgtgcagttc ggcccgttgg ttggtcaagt 8280
cctggtcgtc ggtgctgacg cgggcatagc ccagcaggcc agcggcggcg ctcttgttca 8340
tggcgtaatg tctccggttc tagtcgcaag tattctactt tatgcgacta aaacacgcga 8400
caagaaaacg ccaggaaaag ggcagggcgg cagcctgtcg cgtaacttag gacttgtgcg 8460
acatgtcgtt ttcagaagac ggctgcactg aacgtcagaa gccgactgca ctatagcagc 8520
ggaggggttg gatcaaagta ctttgatccc gaggggaacc ctgtggttgg catgcacata 8580
caaatggacg aacggataaa ccttttcacg cccttttaaa tatccgttat tctaataaac 8640
gctcttttct cttaggttta cccgccaata tatcctgtca aacactgata gtttaaactg 8700
aaggcgggaa acgacaatct gatccaagct caagctgctc tagcattcgc cattcaggct 8760
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ttgtaaaacg acggccagtg ccaagctctc ggatccacta gtaacggccg ccagtgtgct 8940
ggaattgccc ttggatcatg aaccaacggc ctggctgtat ttggtggttg tgtagggaga 9000
tggggagaag aaaagcccga ttctcttcgc tgtgatgggc tggatgcatg cgggggagcg 9060
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