一種重組人血小板衍生生長因子凝膠劑的製作方法

2023-04-26 18:59:01 2

專利名稱：一種重組人血小板衍生生長因子凝膠劑的製作方法
技術領域：
本發明涉及用於治療糖尿病並發性潰瘍的重組人血小板衍生生長因子凝膠劑。
背景技術：
糖尿病是全球高發性非傳染性疾病之一，後期患者的一個特殊問題是足部及下肢發生潰瘍，很難治癒，目前臨床主要有維持、預防感染和營養神經三種治療方法，但無法從根本上使組織再生，促進創面癒合。病人的潰瘍長期不能癒合，並發感染，最終的結果是截肢。而血小板衍生生長因子可促進創面組織再生，增加糖尿病足的治癒率，降低截肢的危險。

發明內容
本發明的目的是提供一種用於治療糖尿病神經病變性下肢潰瘍的重組人血小板衍生生長因子凝膠劑。
本發明所提供的重組人血小板衍生生長因子凝膠劑，每1000g含有如下重量的組分重組人血小板衍生生長因子 0.08-0.12g，透明質酸鈉0.40-0.6g，羧甲基纖維素鈉20-30g，賴氨酸鹽酸鹽 4-6g，磷酸氫二鈉0.45-0.75g，磷酸二氫鈉0.04-0.06g，對羥基苯甲酸甲酯 1.2-1.9g，對羥基苯甲酸丙酯 0.15-0.25g，氯化鈉7.50-8.0g，加水至1000g。
其中，該重組人血小板衍生生長因子凝膠劑優選配方為，每1000g含有如下重量的組分重組人血小板衍生生長因子 0.1g，透明質酸鈉0.5g，
羧甲基纖維素鈉24g，賴氨酸鹽酸鹽 5g，磷酸氫二鈉0.6g，磷酸二氫鈉0.05g，對羥基苯甲酸甲酯 1.6g，對羥基苯甲酸丙酯 0.2g，氯化鈉7.8g，加水至1000g。
在本發明中，重組人血小板衍生生長因子優選為重組人血小板衍生生長因子Thr6-PDGF-BB，該生長因子可按照中國發明專利申請(一種重組人血小板衍生生長因子及其編碼基因與表達方法，申請號200410068993.2)進行製備。
本發明通過篩選凝膠劑配方，將重組人血小板衍生生長因子(Thr6-PDGF-BB)製備為凝膠劑，可以直接塗覆於糖尿病神經病變性下肢潰瘍的創口部位，效果良好，使用方便，具有廣泛的應用前景。
具體實施例方式


圖1為凝膠劑的製備工藝流程圖。
具體實施例方式
實施例1、凝膠劑的製備凝膠劑的配方重組人血小板衍生生長因子0.1g，透明質酸鈉 0.5g，羧甲基纖維素鈉 24g，賴氨酸鹽酸鹽5g，磷酸氫二鈉 0.6g，磷酸二氫鈉 0.05g，對羥基苯甲酸甲酯1.6g，對羥基苯甲酸丙酯0.2g，氯化鈉 7.8g，加注射用水到1000g。
所用的原料來源與標準如表1。
表1原料來源與標準表

其製備工藝流程如圖1所示，包括如下步驟(1)取80％重量的注射用水，加入氯化鈉、對羥基苯甲酸甲酯和對羥基苯甲酸丙酯，加熱使溶解；(2)將上述溶液放至室溫，加入磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉，使溶解；(3)取此溶液的一半，加入羧甲基纖維素鈉，溶脹過夜，105℃滅菌20分鐘，得混合溶液I；(4)另一半溶液中加入賴氨酸鹽酸鹽、間甲酚使溶解，0.22μm微孔濾膜過濾，再加入透明質酸鈉攪拌使溶解，得混合溶液II；(5)將重組人血小板衍生生長因子(Thr6-PDGF-BB)經0.22μm微孔濾膜過濾加入到混合溶液II中，再與混合溶液I混合，攪拌均勻，調節pH值到6.5-7.5，加注射用水補充到全量。
(6)分裝。
實施例2、凝膠劑指標評價按照表2的配方製作對比例凝膠劑和本發明凝膠劑。
表2凝膠劑配方

一、質量評價對兩種凝膠劑進行評價，評價指標包括外觀、pH、無菌、活度等方面。
外觀性狀直接目視觀察。
pH值取本品，參照中國藥典2005年版二部附錄VApH值測定法測定。
無菌取本品，依法(中國藥典2005年版三部附錄XIIA，薄膜過濾法)檢查，應符合規定。
色譜法測定含量取本品，採用高效液相色譜法進行測定。
活度採用MTT測定細胞增殖的方法，使用重組人血小板衍生生長因子標準品校準確定效價。
取對數生長期的BALB/C 3T3細胞，棄去培養瓶中的完全培養液，以無血清DMEM潤洗2～3次，胰蛋白酶消化後用測定培養基重懸細胞，計數後以測定培養液調整細胞密度至1×105/ML，接種96細胞培養板，每孔100μl，37℃，5％CO2條件下培養2-3h。取rhPDGF-BB參考品，以無血清DMEM培養液溶解並稀釋至40U/ML，同法稀釋待測樣品，將已預稀釋的參考品和待測樣品以測定培養液於96孔板上以無血清DMEM培養液進行倍比梯度稀釋，工作12梯度濃度，每一梯度設2個復孔；將梯度稀釋好的參考品和待測樣品每孔加入100μl至已接種BALB/C 3T3細胞的96孔細胞培養板中，終體積為200μl(CMS胎牛血清終濃度為1％)；培養48h，取出每孔吸去100μl培養液後加入10μlMTT溶液，培養4h；棄去孔中全部液體加入200μl裂解液，吹打混勻後，用酶標儀測量其A570值，橫坐標為參考品濃度，縱坐標為A570光吸收值的平均數，選用的回歸模型為4參數方程，並按以下公式計算結果待檢品效價＝標準品效價×待檢品預稀釋倍數/參考品預稀釋倍數×待檢品半效稀釋倍數/參考品半效稀釋倍數。
檢測結果如表3所示。
表3質量評價結果

上述兩個凝膠劑的各項指標均無明顯差異，對其進行影響因素試驗。
二、影響因素實驗高溫實驗—由於本品為蛋白質，是熱敏感藥物，因此確定影響因素實驗的溫度為40℃，並同時進行常規的保存條件2-8℃條件下的試驗同時進行。由於本品的包裝材料需要採用對光和水蒸氣具有完全阻隔作用的鋁塑複合性材料作為包裝材料，因此，影響因素不進行強光試驗和高溼試驗。
取重組人血小板衍生生長因子凝膠小試樣品，分別置於40℃烘箱和4℃的冰箱中，分別於5天、10天取樣，按照《中國藥典》2005版規定注射液穩定性重點考察項目的規定，對樣品的性狀、均勻性、含量、活度進行考察，結果如表4-表9所示。
表4影響因素考察0天結果

表5影響因素考察4℃5天結果

表7影響因素考察40℃5天結果

表8影響因素考察4℃10天結果

表9影響因素考察40℃10天結果

根據影響因素實驗考察的結果，對比例在40℃條件保存時，第10天出現沉澱物，色譜法測定的含量有一定的下降；而本發明凝膠劑則可以保持穩定。
實施例3、凝膠劑對皮膚損傷創面的修復實驗一、實驗材料1.糖尿病Wistar雄性大鼠36隻，購於中國醫學科學院動物研究所；2.凝膠劑採用實施例1的配方。
3.凝膠基質不加入重組人血小板衍生生長因子Thr6-PDGF-BB，其餘物質用量與二、實驗步驟1.製備全層皮膚缺損創面在試驗前糖尿病Wistar大鼠單籠餵養1周，自由飲水與攝食。大鼠試驗當日禁食，用乙醚吸入麻醉，背部剃毛，75％酒精常規消毒。用直徑18mm的環鑽在糖尿病Wistar大鼠脊柱兩側各壓出1個圓形印跡(2.54cm2)，外科手術剪刀沿壓痕剪去全層皮膚(達深筋膜)，即每隻大鼠背部各製成兩個圓形全層皮膚缺損創面，止血備用。
2.試驗分組將上述糖尿病Wistar大鼠36隻隨機分成五組(1)空白對照組致傷後創面不給凝膠基質，也不給Thr6-PDGF-BB治療藥(n＝7)，塗以0.9％NaCl；(2)基質對照組致傷後創面塗無Thr6-PDGF-BB的凝膠基質(n＝7)。
(3)凝膠劑治療組，分為三個不同的劑量組3.5μg劑量治療組致傷後創面塗以凝膠劑，Thr6-PDGF-BB劑量為3.5μg/cm2(n＝8)；7.0μg劑量治療組致傷後傷面塗以凝膠劑，Thr6-PDGF-BB劑量為7.0μg/cm2(n＝7)；14.0μg劑量治療組致傷後傷面塗以凝膠劑，Thr6-PDGF-BB劑量為14μg/cm2(n＝7)。
3.給藥方法將糖尿病Wistar大鼠每個創面滴注試劑，並塗布均勻，用單層油紗布(紹興福清衛生用品有限公司)和4-6層無菌紗布覆蓋，再用3M膠帶固定。動物單籠餵養，自由飲水進食，每天給藥1次，至傷後12d。
三、評價指標及方法1.測定血糖血糖測定儀(韓國，Blood Glucose Test Meter，GlucoDrTM)測定糖尿病Wistar大鼠血糖。分別於手術當天和傷後3、7、10和14d，剪鼠尾將血吸入血糖測試條內，在11秒即可顯示血糖讀數(mmol/L)。
2.稱體重用電子天平(精確度為g)分別於手術當天和傷後3、7、10和14d對各組糖尿病Wistar大鼠稱重(g)。
3.測量傷腔容量傷後0、2、3、4、5、6和7d用向傷腔內滴注生理鹽水，記錄滴至傷腔液面與創緣皮膚相平時的液量(ml/創面)。
4.測定創面面積傷後0、3、7、10和14d用透明載玻片覆蓋創面，用記號筆沿創面邊緣描繪出創面，再用平整厚度均勻的透明塑料膜複製並剪下該創面圖樣，以萬分之一電子分析天平(西德，Sartorius A 120S)稱取透明塑料膜圖樣的質量，並換算成相應創面的面積(首先稱取透明塑料膜單位面積的質量，g/cm2)。
5.創面收縮百分率測定糖尿病Wistar大鼠創面癒合過程創面收縮百分率(％)，即測定傷後某天(n)創面收縮面積與原創面面積的比率，某天創面是指某天開放創面面積或開放創面面積與再上皮化面積的總面積(cm2)。分別於傷後0、3、7、10和14d用透明塑料上畫出該創面的邊緣。再用上面介紹的稱重法測量計算創面的面積，並計算創面收縮百分率(％)。創面收縮百分率通過下式計算Cn＝(A1-An)/A1式中Cn＝傷後某天(n)創面收縮百分率(％)A1＝最初創面面積(0d)An＝傷後某天創面面積(開放創面或開放創面與再上皮化的總面積)6.創面上皮化面積即測定傷後某天創面新生上皮面積(cm2)，某天創面新生上皮面積是指某天新生上皮從創緣向創面中心移行的上皮面積。肉眼觀察原創面邊緣與新生上皮起始邊緣至創心裸露創面(即無上皮)間的面積。分別於傷後0、3、7、10和14d用透明載玻片畫出該創面邊緣和新生上皮至創心的邊緣。再用稱重法測量計算創面的面積。
7.創面閉合百分數測定糖尿病Wistar大鼠創面癒合過程中創面肉芽組織形成和表皮再上皮化情況。肉眼很容易從溼潤肉芽組織辨別在創緣移行的上皮。傷後3、7、10和14d在透明塑料上描記上皮向創面中心移行的邊緣。用上面介紹的稱重法測量計算創面的面積，並計算創面閉合的百分率(％)。創面閉合百分率是某天創面以最初創面面積的百分率表示，通過下式計算
創面閉合(％)＝[(0d面積-Nd面積)/0d面積]×100％8.組織學觀察在傷後7d或14d活檢各組創面組織，進行組織學觀察。以吸入致命劑量的乙醚處死大鼠，切取整個創面，包括5mm無損傷的正常皮膚，切至筋膜，放入10％甲醛液中固定。從創面中心部切開，取其中一半用石臘包埋固定，蘇木精和曙紅(HE)染色、切片。用光學顯微鏡觀察組織肉芽組織、新生上皮生長和炎症細胞、成纖維細胞生長變化。
9.創面定時照相創面於0、3、7、10和14d定期照相，觀察了解各組在不同時間創面的癒合情況。
四、統計學分析用SPSS 11統計軟體對數據進行統計學處理，計量資料組間和組內不同時間的比較選用方差分析，所有數據均表示為x±s，P＜0.05和P＜0.01為有統計學意義。
五、實驗結果結果顯示本發明凝膠劑治療組對糖尿病Wistar大鼠創面的修復有較好的促進作用觀察發現在傷後3d，本發明凝膠劑治療組和對照組創面肉芽組織增生都不明顯，但治療組創面比對照組創面明顯新鮮，很容易出血，提示已有肉芽組織生長形成；傷後4d治療組肉芽組織增生很明顯，創緣已有新生上皮向創面中心生長移行；傷後5-7d治療組創面肉芽組織生長很活躍(6d填充量達100％)，新生上皮向創面中心生長移行略3-4mm，比兩個對照組顯著多(p＜0.05)；基質對照和空白對照組4-7d肉芽組織生長不太活躍，創面顯得蒼白，此後部分創面才有較多的肉芽組織生長，創緣新生上皮生長較少(1-3mm)。
從傷後3d開始創面出現明顯收縮，治療組創面比對照組收縮小，3.5μg組與對照組相比差異顯著(p＜0.05)；傷後7d兩個對照組創面收縮百分率大約為60％，本發明凝膠劑治療組則為40％左右，兩者差異顯著(p＜0.05)；傷後14d治療組創面收縮率仍比對照組明顯小(p＜0.05)；傷後14d各組創面閉合率都在98.5％以上，組間沒有顯著性差異。
創面組織學觀察表明，本發明凝膠劑治療組傷後7d肉芽組織、新生毛細血管和新生上皮比兩個對照明顯多；傷後14d該組有較多的新合成的膠原，絕大多數創面已完全被多層新生上皮覆蓋；兩個對照組新合成的膠原較少，新生真皮較薄，新生上皮也比治療組少。結果表明，本發明凝膠劑有明顯促進糖尿病並發性創面肉芽組織增生和創緣新生上皮生長移行的作用，並有一定「抑制」和延遲創面收縮的作用。
權利要求
1.一種血小板衍生生長因子凝膠劑，每1000g含有如下重量的組分血小板衍生生長因子0.08-0.12g，透明質酸鈉0.40-0.6g，羧甲基纖維素鈉20-30g，賴氨酸鹽酸鹽 4-6g，磷酸氫二鈉0.45-0.75g，磷酸二氫鈉0.04-0.06g，對羥基苯甲酸甲酯 1.2-1.9g，對羥基苯甲酸丙酯 0.15-0.25g，氯化鈉7.50-8.0g，加水至1000g。
2.根據權利要求1所述的血小板衍生生長因子凝膠劑，其特徵在於所述血小板衍生生長因子凝膠劑每1000g含有如下重量的組分血小板衍生生長因子0.1g，透明質酸鈉0.5g，羧甲基纖維素鈉24g，賴氨酸鹽酸鹽 5g，磷酸氫二鈉0.6g，磷酸二氫鈉0.05g，對羥基苯甲酸甲酯 1.6g，對羥基苯甲酸丙酯 0.2g，氯化鈉7.8g，加水至1000g。
3.根據權利要求1或2所述的血小板衍生生長因子凝膠劑，其特徵在於所述血小板衍生生長因子為重組人血小板衍生生長因子Thr6-PDGF-BB。
全文摘要
本發明公開了一種重組人血小板衍生生長因子凝膠劑。本發明所提供的血小板衍生生長因子凝膠劑，每1000g含有如下重量的組分血小板衍生生長因子0.08－0.12g，透明質酸鈉0.40－0.6g，羧甲基纖維素鈉20－30g，賴氨酸鹽酸鹽4－6g，磷酸氫二鈉0.45－0.75g，磷酸二氫鈉0.04－0.06g，對羥基苯甲酸甲酯1.2－1.9g，對羥基苯甲酸丙酯0.15－0.25g，氯化鈉7.50－8.0g，加水至1000g。本發明通過篩選凝膠劑配方，將血小板衍生生長因子製備為凝膠劑，可以直接塗覆於糖尿病神經病變性下肢潰瘍的創口部位，效果良好，使用方便，具有廣泛的應用前景。
文檔編號A61P17/00GK1814280SQ20051012426
公開日2006年8月9日 申請日期2005年11月29日 優先權日2005年11月29日
發明者陳薇, 於長明, 付玲, 白森 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院微生物流行病研究所, 北京勁邦生物工程有限公司