一種在幼蟲期鑑別家蠶吐絲顏色的方法

2023-04-24 14:42:36 2

專利名稱：一種在幼蟲期鑑別家蠶吐絲顏色的方法
技術領域：
本發明屬於生物技術領域，尤其涉及一種鑑別家蠶吐絲顏色的方法，具體的是利用家蠶Cbp基因和Cbp-Iike基因轉錄的mRNA的特異序列，特異性鑑別家蠶吐絲顏色，同時區分吐全部黃色絲的家蠶與吐部分黃色絲的家蠶、純合型吐黃色絲的家蠶與雜合型吐黃色絲的家蠶，以及鑑別吐黃色絲的色度與色牢度差異。
背景技術：
家蠶(Bombyx mori)也稱桑蠶，是被產業化利用大量生產絲蛋白纖維的昆蟲。蠶絲是熟蠶結繭時分泌絲液凝固而成的連續長纖維，也稱繭絲。現代繭絲綢エ業主要利用家蠶白色繭絲，通過化學染色等生產エ藝生產有色絲綢產品，在染色及後整理加工過程中使用的染料和其它化學藥物有相當一部分含有對人體有害甚至致癌的物質，印染廢水則成為エ業汙水的重要整治目標。 家蠶天然彩色繭是人類早已發現的資源，家蠶天然繭色主要有黃紅繭系、黃綠繭系和白繭系3類。黃紅繭系包括淡黃、金黃、肉色、紅色、蒿色、鏽色等多種繭色；黃綠繭系包括竹綠(淡緑)和緑色兩種。家蠶天然彩色繭絲纖維吸溼導溼性能強、抑菌性能優，吸收紫外線與抗氧化等護膚能力好，具有色彩天然、色澤雅致等突出性能，生產的纖維產品色澤柔和、無毒無害、色彩自然，是高檔天然緑色紡織材料。家蠶天然彩色繭絲纖維生產過程不需要染色，能夠有效減少絲綢印染的汙染，對環境和人體友好，具有重大經濟利用價值和重要的社會發展意義。但近百年來，彩色繭原料生產一直未能解決繭色雜、易褪色、絲質差、絲量低和繭形不正等繭絲纖維特性的重大缺陷，家蠶彩色繭精細化加工技術也因為完全沒有合格的原料苗，無法開展技術研究與突破，存在無法紡制細纖高檔天然彩色絲線、無法生產高檔面料的行業技術瓶頸。因此迫切需求創新天然彩色繭品種培育方法，提高選擇的準確性，加快天然彩色繭品種選育速度。家蠶形成繭色的物質來源於幼蟲取食的桑葉(飼料)，桑葉中的天然色素在體內與色素轉運蛋白結合後，才能夠被家蠶消化道吸收，並進一步通過血液轉移進入絲腺，最終形成有色繭。家蠶同樣取食桑葉，能夠結出不同顔色的蠶繭，甚至是白色繭，其根本的原因是家蠶體內在色素吸收與轉運過程中對色素的保護與加工能力差異所致。經典遺傳學分析已經鑑定出近20個控制家蠶繭色的基因，因此繭色的遺傳相當複雜，不僅有些種類的黃色繭與緑色繭很難分辨，同樣是黃色繭也存在多種遺傳類型，甚至還有外層黃色繭與內層黃色繭等差別，僅僅憑繭色無法保證遺傳基因的純合，也很難通過雜交分離純化，這直接影響有色繭實用品種的選育和雜交Fl代的利用。類胡蘿蔔素、葉黃素及黃酮色素也是亞洲人類血液中大量存在的色素，它在動物體內具有抗氧化、影響繁殖性能、參與機體免疫反應等功能。鳥類就具有在蛋中沉積類胡蘿蔔素的習慣，沉積的色素能夠促進胚胎發育和孵化。目前為止，包括人類在內，動物對類胡蘿蔔素相關色素的吸收與轉運機制都還不清楚，其調控基因的研究只是參考家蠶這ー實驗動物數據。因此，發現和應用分子水平的鑑別基因和分子標記方法具有生物醫學的實踐意義。1996年，Jouni和Wells報導了一個分離自家蠶中腸的葉黃素結合蛋白(Luteinbinding protein, LBP),但目前還沒有其序列及功能的深入報導。Tabunoki H等(2002)，Tsuchida 等(2004)，Sakudoh 等(2005，2007)，牛豔山等(2010)報導了一個家蠶類胡蘿蔔素結合蛋白(Carotenoid binding protein, CBP),其與類胡蘿蔔素特別是葉黃素(Lutin)的吸收、轉運密切相關，並克隆和功能鑑定了該基因。CBP作為胞質溶膠中的類胡蘿蔔素載體與C基因編碼的CAME02蛋白作為細胞表面的跨膜受體協同作用，共同介導類胡蘿蔔素的運輸(Sakudoh et al.，2010)。家蠶Cbp基因位於功能還不清楚的BmStartl基因位點，由7個外顯子和6個內含子構成，第2外顯子序列完整性與黃色繭形成有夫，第2外顯子序列缺失的原因，可能是一個反轉錄轉座子CATS(CBP_associated TRAS-Iike sequence),針對Cbp第2內含子的插入導致基因重排，結果使第2外顯子3'端序列和第2內含子及CATS 5'端序列的刪除，導致Cbp基因具有多於4種基因結構，這個基因內的重排過程影響黃繭和白繭品種的形成。
在對多個家蠶繭色系統(品種)Cbp基因和3種Cbp-Iike基因結構比較分析的基礎上，結合它們的絲腺色素與繭色的分析發現家蠶Cbp基因的翻譯蛋白質產物CBP是家蠶黃色繭形成過程中色素轉運的關鍵因子，只存在於家蠶黃色繭品種4齡與5齡幼蟲的絲腺等組織，但家蠶Cbp基因和Cbp-Iike基因及其轉錄RNA產物存在於各種繭色的家蠶體內。家蠶黃色繭品種的Cbp基因和Cbp-Iike基因能夠同時轉錄具有CBP功能性的完整mRNA和缺少第2外顯子的mRNA ;綠繭品種和白繭蠶品種的Cbp基因和Cbp-Iike基因都只能轉錄缺少第2外顯子的mRNA (牛豔山，2010)。目前，國內外家蠶有色繭品種選育使用的方法是依靠繭色評估和選留家系與個體，而由於前述的黃紅系列繭色無法判斷純合和雜合家系，另外對繭層內外顔色的一致性和色牢度高家系和個體的選擇只能通過蠶繭顏色測定和繭絲色牢度檢測才能夠實現，導致黃紅繭系蠶品種的選育工作缺乏準確性，選育的品系很難穩定繭色，育種周期長、成本高、效果差。雖然理論上通過檢驗Cbp基因和Cbp-Iike基因轉錄的mRNA結構，或者檢測CBP蛋白質產物，可以確認檢測個體的類胡蘿蔔素結合蛋白基因類型，但家蠶Cbp基因和Cbp-Iike基因主要在5齡幼蟲絲腺和消化管轉錄表達，鑑定Cbp基因和Cbp-Iike基因轉錄和表達產物類型需要殺死幼蟲取出絲腺或消化管組織，無法同時實現鑑定基因類型與留種兩全，而且也無法從蠶繭繭層顔色有差異、色度也有差異的黃紅色繭系統的混合群體鑑別和分離出繭層顏色內外一致、色牢度高的家系，不能滿足天然彩色繭品種育種工作的需要。

發明內容
有鑑於此，本發明的目的在於提供ー種利用家蠶Cbp基因和Cbp-Iike基因轉錄的mRNA的特異序列，在幼蟲期快速、準確、特異性鑑別家蠶吐絲顏色的方法。為了實現本發明的目的，本發明採用如下技術方案ー種在幼蟲期鑑定家蠶吐絲顏色的方法，為提取待測家蠶絲腺RNA，反轉錄方法合成cDNA，以獲得的cDNA為模板用具有SEQ ID NO 1所示核苷酸序列的上遊引物和具有SEQID NO 2所示核苷酸序列的下遊引物進行RT-PCR擴增，瓊脂糖電泳檢測PCR擴增產物，判斷家蠶吐絲顏色；
若僅具有一條SEQ ID NO :4所示的核苷酸序列或其互補序列或者同時具有SEQ IDNO :3所示的核苷酸序列或其互補序列和SEQ ID NO :4所示的核苷酸序列或其互補序列，則家蠶吐黃色繭絲；若僅具有SEQ ID NO :3所示的核苷酸序列或其互補序列，則家蠶吐綠色繭絲或者白色繭絲。家香基因轉錄的mRNA和翻譯的蛋白質序列，雖然依賴於該基因的外顯子序列,但其內含子序列和順式調節子等其它序列有時也影響基因轉錄的mRNA和翻譯的蛋白質序列。家蠶的BmStartl基因位點是一個複雜的多基因重疊位點，Cbp基因是其中I個重疊基因。豕香的Cbp基因重置範圍內的DNA有4種不同序列，這種DNA序列的差異，既有Cbp基因外顯子的序列差異，也有影響Cbp基因mRNA轉錄本的內含子序列差異，導致在結不同顏色蠶繭的家蠶的色素吸收和儲存組織的Cbp基因和Cbp-Iike基因mRNA轉錄本有4種不同序列，翻譯的蛋白質序列和功能也有差異。Cbp基因重置範圍內的DNA序列雖然變化很多，但其中存在能夠區分結黃色繭家蠶與結其它顏色繭家蠶的特異序列。本發明利用家蠶Cbp基因和Cbp-Iike基因轉錄的mRNA的特異序列，在幼蟲期快速、準確、特異性鑑別家蠶吐絲顏色。 在一個具體實施方式
中，本發明提取5齡期家蠶絲腺RNA，反轉錄合成cDNA，以獲得的cDNA為模板，用具有SEQ ID NO :1所示核苷酸序列的上遊引物和具有SEQ ID N0:2所示核苷酸序列的下遊引物，進行RT-PCR擴增，擴增家蠶特徵序列，瓊脂糖電泳檢測RT-PCR擴增產物，結果顯示RT-PCR擴增產物僅具有一條SEQ ID NO :4所示的核苷酸序列或者同時具有SEQ IDNO 3所示的核苷酸序列和SEQ ID NO 4所示的核苷酸序列，家蠶吐黃色繭絲；RT-PCR擴增產物僅具有SEQ ID NO :3所示的核苷酸序列，家蠶吐綠色繭絲或者白色繭絲。肌動蛋白基因3 (Actin3)，屬於ARP家族Actin亞家族，在家蠶不同組織及發育時期Actin3基因表達基本穩定，因此Actin3基因是家蠶分子生物學研究中常用內參基因之一。本發明以Actin 3基因作為內參基因，通過用凝膠自動成像系統分析RT-PCR擴增產物的電泳凝膠產物與Actin 3基因的相對含量，判斷家蠶吐綠色繭絲還是白色繭絲，結果顯示具有SEQ ID NO 3所示的核苷酸序列的RT-PCR擴增產物電泳條帶的光密度值與內參基因Actin 3電泳條帶的光密度值的比值> O. 8，家蠶吐綠色繭絲；具有SEQ ID NO :3所示的核苷酸序列的RT-PCR擴增產物電泳條帶的光密度值與內參基因Actin 3電泳條帶的光密度值的比值 3，家蠶為純合型吐黃色繭絲，即家蠶全部吐黃色繭絲；具有SEQ ID NO 4所示的核苷酸序列的RT-PCR擴增產物電泳條帶與具有SEQID NO 3所示的核苷酸序列的RT-PCR擴增產物電泳條帶的光密度比值 5則家蠶吐黃色繭絲的色度高和色牢度高。本發明所述鑑別家蠶吐絲顏色的方法準確率為100%。本發明所述方法可以在幼蟲階段判定蛾區後代是否為色度高和色牢度高的純合型吐黃色繭絲，不需經過3代以上的蛾區內自交，極大的減少了育種過程中的飼養工作量及飼養成本。為了獲得絲量多、絲質優、抗性強彩色繭絲，人們通常將家蠶黃色繭純系Y12與家蠶絲量多、絲質優、抗性強的純系白色繭優秀蠶品種JS雜交，Fl代蠶繭全部為黃色，F2代出現黃色與白色兩種蠶繭，其中黃色繭中有繭色分離與繭色不分離兩種個體，這種繭色分離的個體現有方法無法剔除乾淨。目前採用的方法是將上述F2代黃色繭與黃色繭純系Y12回交，毎回交一代，黃色繭中有繭色分離的個體數減少一半，但理論上永遠不會將繭色分離的個體剔除乾淨，至回交第3代的黃色繭中有繭色分離的個體數仍然有1/16，而且此時黃色繭的絲量、絲質和抗性會迅速回落。在一個實施例中，本發明採用鑑別出的色度高和色牢度高的純合型吐黃色絲的家蠶與白色繭優秀品種組合的雜交，獲得絲量多、絲質優、抗性 強、內外顏色一致的黃色苗系統。本發明還提供了ー種在幼蟲期鑑定家蠶吐絲顏色的試劑盒，包括具有SEQ ID NO I所示核苷酸序列的上遊引物和具有SEQ ID NO :2所示核苷酸序列的下遊引物。在一些實施例中，本發明所述鑑定家蠶吐絲顏色的試劑盒還包括PCR擴增反應緩衝液、dNTP、Taq酶中的ー種或幾種。本發明還提供了ー種在幼蟲期鑑定家蠶吐絲顏色的DNA分子組，由SEQ ID NO 3所示的核苷酸序列和SEQ ID NO :4所示的核苷酸序列組成。本發明提供了一種鑑定家蠶吐絲顏色的方法。本發明所述方法利用基因工程技術提取待測5齡期家蠶絲腺RNA，反轉錄合成cDNA，以獲得的cDNA為模板，用特異引物進行RT-PCR擴增反應，瓊脂糖電泳檢測PCR擴增產物的種類和長度判斷家蠶吐黃色繭絲還是吐緑色或白色繭絲，並且通過分析RT-PCR擴增產物的電泳凝膠產物的相對含量進ー步判斷吐黃色繭絲的家蠶為純合型吐黃色繭絲還是雜合型吐黃色繭絲，其他家蠶吐綠色繭絲還是白色繭絲。本發明所述方法還可以從繭層顔色有差異、色度也有差異的混合群體鑑別分離出繭色內外一致、色牢度高的家系。本發明所述鑑別方法操作簡便快速，鑑別家蠶吐絲顏色準確性高。同時鑑別出的色度高和色牢度高的純合型吐黃色絲的家蠶還可與白色繭優秀品種組合的雜交，獲得絲量多、絲質優、抗性強、內外顔色一致的黃色繭系統。
具體實施例方式本發明實施例公開了ー種鑑別家蠶吐絲顏色的方法。本領域技術人員可以借鑑本文內容，適當改進エ藝參數實現。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領域技術人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發明。本發明的方法已經通過較佳實施例進行了描述，相關人員明顯能在不脫離本發明內容、精神和範圍內對本文所述的方法進行改動或適當變更與組合，來實現和應用本發明技木。為了進一歩理解本發明，下面結合實施例對本發明提供的方法進行詳細說明。實施例I :為了從4個家蠶5齡幼蟲樣本鑑別出繭色黃緑色的綠色繭系統大造品種、繭色純白色的白色苗品種C108、苗色黃色的黃色苗系統彩苗I號品種和外層黃苗品種Y0，本實施例進行了如下的步驟(I)分別以商用RNA提取試劑盒(Qiagen公司)提取上述4個5齡幼蟲樣本的絲腺的總RNA，分別反轉錄方法合成cDNA，-20°C至_40°C保存待用。反轉錄採用TaKaRa公司的反轉錄試劑盒，反轉錄反應體系(10 μ L): 5 X PrimeScript Buffer 2 μ L ；PrimeScript EnzymeMixI O. 5 μ L ；50 μ mol/L Oligo dT Prime (50 μ mol/L) O. 5 μ L ；Total RNA I μ L ；加RNase FreeH2O至總體積10 μ L。反轉錄的條件為37°C 15min ；85°C 5s。(2)以步驟(I)獲得的4種家蠶cDNA為模板，用具有SEQ ID N0:1所示核苷酸序列的上遊引物和具有SEQ ID NO :2所示核苷酸序列的下遊引物，以Actin 3基因作為內參基因，採用SYBR PrimeScript RT-PCR試劑盒(TaKaRa公司)，在Bio-RadChromo4儀器上，按照說明書進行RT-PCR擴增，反應體系25 μ L，每個樣品重複檢測3次。其中Act in 3基因的上遊引物序列為5』 -CCCCATCGAACACGGAATCG-3』，下遊引物為5』-CGCTCGGCAGTGGTAGTGAA-3』 ；RT_PCR 擴增的反應條件為95°C 5s ；60°C IOs ；72°C 10 ；32 個循環。(3)以加入EB的I. 2%瓊脂糖電泳檢測步驟(2)獲得的4個樣本的RT-PCR擴增產物的種類與序列長度，以200bp DNA Ladder為序列長度標記。(4)紫外光條件下觀察步驟(3)電泳凝膠，除內參基因Actin 3的I條產物條帶夕卜，樣本2和樣本3的電泳泳道中都只有I條長度268bp的產物；樣本I和樣本4的電泳泳道中同時都具有I條長度268bp的產物和I條長度577bp的產物。將4個幼蟲樣本從步驟(3)電泳凝膠獲得的268bp的產物和577bp的產物分別用PCR Clean-up kit回收，克隆測序後結果為樣本I來源的268bp的產物，3個克隆有2個克隆具有SEQ ID NO :3所示核苷酸序列，另I個克隆與具有SEQ ID NO 3所示核苷酸序列僅有I個鹼基的差異。樣本I號來源的577bp的產物，3個克隆有I個克隆具有SEQ ID NO :4所示核苷酸序列，有I個克隆與具有SEQ ID NO 4所示核苷酸序列僅有I個鹼基的差異，另I個克隆與具有SEQ ID NO 4所示核苷酸序列僅有2個鹼基的差異。樣本2來源的268bp的產物，3個克隆中有2個克隆具有SEQ ID NO :3所示核苷酸序列，另I個克隆與具有SEQ ID NO 3所示核苷酸序列僅有I個鹼基的差異。樣本3來源的268bp的產物，3個克隆中有2個克隆具有SEQ ID NO :3所示核苷酸序列，另I個克隆與具有SEQ ID NO 3所示核苷酸序列僅有2個鹼基的差異。樣本4來源的268bp的產物，3個克隆有2個克隆具有SEQ ID NO :3所示核苷酸序列，另I個克隆與具有SEQ ID NO 3所示核苷酸序列僅有I個鹼基的差異。樣本4號來源的577bp的產物，3個克隆有I個克隆與具有SEQ ID NO 4所示核苷酸序列僅有I個鹼基的差異，另2個克隆與具有SEQ ID NO :4所示核苷酸序列僅有2個鹼基的差異。將4個樣本剩餘幼蟲繼續分別飼養至吐絲結繭，樣品I和樣品4吐黃色繭絲。因此判定若僅具有一條SEQ ID NO :4所示的核苷酸序列或者同時具有SEQ ID NO :3所示的核苷酸序列和SEQ ID NO 4所示的核苷酸序列，則家蠶吐黃色繭絲；若僅具有SEQ ID NO 3所示的核苷酸序列，則家蠶吐綠色繭絲或者白色繭絲。(5)用凝膠自動成像系統 Tanon 2500, Tanon GIS (Gel Image System)軟體分析步驟(3)各樣本的電泳凝膠產物的相對含量，結果樣本2的長度268bp的產物電泳條帶的光密度值與內參基因Actin 3產物電泳條帶的光密度值的比值為1.2 ;樣本3的長度268bp的產物電泳條帶的光密度值與內參基因Actin A3產物電泳條帶的光密度值的比值為O. 3 ；樣本I的長度577bp的產物電泳條帶的光密度值高於長度268bp的產物電泳條帶的光密度值11. 2倍；樣本4的長度577bp的產物電泳條帶的產物的光密度值高於長度268bp的產物電泳條帶的光密度值2. 3倍。觀察飼養的4個樣本剰餘幼蟲所結的繭評判家蠶品種，樣本I為全部吐黃色繭絲的黃色繭系統彩繭I號品種；樣本2為吐綠色繭絲的綠色繭系統大造品種；樣本3為吐白色繭絲的白色繭系統C108品種；樣本4為吐部分黃色繭絲的外層黃繭品種Y0。因此判定若家蠶具有SEQ ID NO 3所示的核苷酸序列的RT-PCR擴增產物電泳條帶的光密度值與內參基因Actin 3電泳條帶的光密度值的比值> O. 8，則家蠶吐綠色繭絲；若具有SEQ ID NO :3所示的核苷酸序列的RT-PCR擴增產物電泳條帶的光密度值與內參基因Actin 3電泳條帶的光密度值的比值彡O. 4，則家蠶吐白色繭絲。若家蠶具有SEQ ID NO: 4所示的核苷酸序列的RT-PCR擴增產物電泳條與具有SEQ ID NO :3所示的核苷酸序列的RT-PCR擴增產物電泳條帶的光密度比值> 3則家蠶為純合型吐黃色繭絲。實施例2從繭層顔色有差異、色度也有差異的混合群體鑑別分離出繭色內外一致、色牢度聞的家系。(I)以單蛾區飼養，5齡期從100個蛾區中每蛾區各取一定數量的幼蟲樣本，按實施例I所述方法從每條幼蟲絲腺提取的總RNA，按實施例I所述方法反轉錄方法合成cDNA，-20°C至 _40°C保存備用。(2)以步驟(I)提取的各蛾區家蠶絲腺cDNA為模板，用具有SEQ ID NO 1所示核苷酸序列的上遊引物和具有SEQ ID NO :2所示核苷酸序列的下遊引物，以Actin 3基因作為內參基因，按照實施例I所述方法RT-PCR擴增。(3)以加入EB的I. 2%瓊脂糖電泳檢測步驟(2)獲得的各蛾區幼蟲樣本的RT-PCR擴增產物，以200bp DNA Ladder為序列長度標記。(4)紫外光條件下觀察步驟(3)電泳凝膠，除內參基因Actin 3的I條產物條帶夕卜，選出電泳泳道中只有I條長度577bp的具有SEQ ID NO 4所示核苷酸序列的產物的樣本，這類樣本記為「 + 」；(5)對步驟(4)紫外光條件下觀察到的泳道中除內參基因Actin 3的I條產物條帶外，還同時具有I條長度268bp的具有SEQ ID NO :3所示核苷酸序列的產物和I條長度577bp的具有SEQ ID NO 4所示核苷酸序列的產物的樣本，用凝膠自動成像系統Tanon2500, Tanon GIS (Gel Image System)軟體分析各樣本的電泳凝膠產物的相對含量,結果出現3種類型類型I為樣本的SEQ ID NO. 4產物的光密度值高於SEQ ID NO. 3的光密度值3倍至5倍，這類樣本記為「 + 」類型2為樣本的SEQ ID NO. 4產物的光密度值高於SEQ ID NO. 3的光密度值5倍以上，這類樣本記為「++」類型3為樣本的SEQ ID NO. 4產物的光密度值高於SEQ ID NO. 3的光密度值小於3倍，這類樣本記為
(6)統計各蛾區中所有樣本的步驟(4)或步驟(5)中的類型，選擇沒有類型的蛾區留種，共選出3號、23號、27號、39號、61號和89號6個蛾區，其中3號蛾區的「++」類型比例高於80%。系統選育後結果，這6個蛾區中沒有出現其他顏色的蠶繭，蠶繭的內外繭層顏色都為黃色，表明本發明所述鑑別家蠶吐絲顏色的方法準確率為100%。其中3號蛾區的後代生絲顏色金黃色、色牢度高於其它5個蛾區的繭絲。因此判定，若具有SEQ ID NO 4所示的核苷酸序列的RT-PCR擴增產物電泳條帶與具有SEQ ID NO 3所示的核苷酸序列的RT-PCR擴增產物電泳條帶的光密度比值> 5則家蠶吐黃色繭絲的色度高和色牢度高。本發明所述方法不需經過3代以上的蛾區內自交即可判定蛾區後代是否為純合型吐黃色繭絲，可以減少5齡後期94%的飼養量。實施例3從純合型吐黃色絲的家蠶與白色繭優秀品種的配種中篩選純合型吐黃色絲家蠶。 (I)將家蠶黃色繭純系Y12與家蠶絲量多、絲質優、抗性強的純系白色繭優秀蠶品種JS雜交，Fl代自交得到的F2代以單蛾區飼養，5齡期從全部幼蟲的血液都為黃色的100個蛾區各取一定數量的幼蟲樣本，按實施例I所述方法從每條幼蟲絲腺提取的總RNA，按實施例I所述方法反轉錄方法合成cDNA，-20°C至_40°C保存備用。(2)以步驟(I)提取的各蛾區家蠶絲腺cDNA為模板，用具有SEQ ID NO 1所示核苷酸序列的上遊引物和具有SEQ ID NO :2所示核苷酸序列的下遊引物，以Actin 3基因作為內參基因，按照實施例I所述方法RT-PCR擴增。(3)以加入EB的I. 2%瓊脂糖電泳檢測步驟(2)獲得的各蛾區幼蟲樣本的RT-PCR擴增產物，以200bp DNA Ladder為序列長度標記。(4)選擇蛾區中每條幼蟲來源的步驟(3)電泳檢測的RT-PCR擴增產物的種類都同時具有I條長度268bp的SEQ ID NO. 3產物和I條長度577bp的SEQ ID NO. 3的產物，結果共選出99個蛾區。(5)用凝膠自動成像系統 Tanon 2500, Tanon GIS (Gel Image System)軟體分析各樣本的電泳凝膠產物的相對含量，計算同一個電泳泳道中電泳條帶SEQ ID NO. 4產物與SEQ ID NO. 3產物的相對光密度值比值，選出蛾區中每條幼蟲樣本的該比值大於2. O的蛾區，結果從步驟(4)的99個蛾區中共選出41個蛾區。(6)繼續飼養步驟(5)選出的41個蛾區的幼蟲，系統選育方法獲得了絲量、絲質和抗性顯著高於家蠶黃色繭純系Y12的穩定遺傳的黃色繭品種，與選配的白色繭優秀品種雜交，獲得絲量多、絲質優、抗性強、內外顏色一致的黃色繭系統。本發明所述方法不需經過反覆與Y12回交，可以縮短育種時間和成本50%以上，本發明所述方法也不會出現育成品種的繭色不純所帶來的生產效率低和品種認定困難的問題。以上實施例的說明只是用於幫助理解本發明的方法及其核心思想。應當指出，對於本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以對本發明進行若干改進和修飾，這些改進和修飾也落入本發明權利要求的保護範圍內。
權利要求
1.一種在幼蟲期鑑別家蠶吐絲顏色的方法，其特徵在於， 提取待測5齡期家蠶絲腺RNA，反轉錄方法合成CDNA，以獲得的cDNA為模板用具有SEQID NO :1所示核苷酸序列的上遊引物和具有SEQ ID NO :2所示核苷酸序列的下遊引物進行RT-PCR擴增，瓊脂糖電泳檢測PCR擴增產物，判斷家蠶吐絲顏色； 若僅具有一條SEQ ID NO :4所示的核苷酸序列或其互補序列，或者同時具有SEQ IDNO :3所示的核苷酸序列或其互補序列和SEQ ID NO :4所示的核苷酸序列或其互補序列，則家蠶吐黃色繭絲；若僅具有SEQ ID NO :3所示的核苷酸序列或其互補序列，則家蠶吐綠色繭絲或者白色繭絲。
2.根據權利要求I所述鑑別方法，其特徵在於，還包括與具有SEQID NO 5所示的核苷酸序列內參基因ActinA3的RT-PCR擴增產物光密度值比較，判斷家蠶吐綠色繭絲還是白色苗絲； 若具有SEQ ID NO :3所示的核苷酸序列或其互補序列的RT-PCR擴增產物電泳條帶的光密度值與內參基因Actin 3電泳條帶的光密度值的比值> O. 8，則家蠶吐綠色繭絲；若具有SEQ ID NO :3所示的核苷酸序列或其互補序列的RT-PCR擴增產物電泳條帶的光密度值與內參基因Actin 3電泳條帶的光密度值的比值彡O. 4，則家蠶吐白色繭絲。
3.根據權利要求I所述鑑別方法，其特徵在於，還包括利用具有SEQID N0:4所示的核苷酸序列或其互補序列的RT-PCR擴增產物電泳條帶與具有SEQ ID NO 3所示的核苷酸序列或其互補序列的RT-PCR擴增產物電泳條帶的光密度比值，判斷家蠶為純合型吐黃色繭絲還是雜合型吐黃色繭絲； 若具有SEQ ID NO 4所示的核苷酸序列或其互補序列的RT-PCR擴增產物電泳條帶與具有SEQ ID NO 3所示的核苷酸序列或其互補序列的RT-PCR擴增產物電泳條帶的光密度比值> 3則家蠶為純合型吐黃色繭絲。
4.根據權利要求I所述鑑別方法，其特徵在於，利用具有SEQID NO :4所示的核苷酸序列或其互補序列的RT-PCR擴增產物電泳條帶與具有SEQ ID NO 3所示的核苷酸序列或其互補序列的RT-PCR擴增產物電泳條帶的光密度比值，判斷家蠶吐黃色繭絲的色度和色牢度； 若具有SEQ ID NO :4所示的核苷酸序列或其互補序列的RT-PCR擴增產物電泳條帶與具有SEQ ID NO 3所示的核苷酸序列或其互補序列的RT-PCR擴增產物電泳條帶的光密度比值> 5則家蠶吐黃色繭絲的色度高和色牢度高。
5.—種在幼蟲期鑑別家蠶吐絲顏色的試劑盒，其特徵在於，包括具有SEQ ID N0:1所示核苷酸序列的上遊引物和具有SEQ ID NO :2所示核苷酸序列的下遊引物。
6.一種在幼蟲期鑑別家蠶吐絲顏色的DNA分子組，其特徵在於，由具有SEQ ID NO :3所示的核苷酸序列或其互補序列的DNA分子和具有SEQ ID NO :4所示的核苷酸序列或其互補序列的DNA分子組成。
全文摘要
本發明屬於生物技術領域，公開了一種在幼蟲期鑑定家蠶吐絲顏色的方法。本發明所述方法利用基因工程技術提取待測5齡期家蠶絲腺RNA，反轉錄合成cDNA，以獲得的cDNA為模板，用特異引物進行RT-PCR擴增反應，瓊脂糖電泳檢測PCR擴增產物的種類和長度判斷家蠶吐黃色繭絲還是吐綠色或白色繭絲，並且通過分析RT-PCR擴增產物的電泳凝膠產物的相對含量進一步判斷吐黃色繭絲的家蠶為純合型吐黃色繭絲還是雜合型吐黃色繭絲，其他家蠶吐綠色繭絲還是白色繭絲。本發明所述方法還可以從繭層顏色有差異、色度也有差異的混合群體鑑別分離出繭色內外一致、色牢度高的家系。本發明所述鑑別方法操作簡便快速，鑑別家蠶吐絲顏色準確性高。
文檔編號C12N15/11GK102808033SQ20121031221
公開日2012年12月5日 申請日期2012年8月29日 優先權日2012年8月29日
發明者徐世清, 牛豔山, 司馬楊虎, 陳息林, 殷為民, 袁紅霞, 邢瑞 申請人:蘇州大學