抑制c-Met表達的siRNA及含有所述siRNA的抗癌組合物的製作方法

2023-04-26 09:06:01

專利名稱：抑制c-Met表達的siRNA及含有所述siRNA的抗癌組合物的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種小幹擾RNA(siRNA),其可以互補結合到c_Met轉錄本(mRNA轉錄本)的鹼基序列上，從而抑制c-Met的表達且不引起免疫反應，本發明還涉及所述siRNA用於預防和/或治療癌症的用途。
背景技術：
c-Met是一種編碼被稱為肝細胞生長因子受體(HGFR)的蛋白的原癌基因。1984年，c-Met首次在化學致癌物處理的人骨肉瘤中被發現。1986年，由於與tpr (易位啟動子區)基因整合，c-Met被發現是潛在的原癌基因，(Cooper etal.，Nature，311，29-33，1984; Dean et al.，Mol cell Biol.，7，921-924，1987; Park etal·，Cell，45，895-904，1986)。
一旦和被稱為c-Met的細胞表面受體酪氨酸激酶(TK)結合，由間充質細胞分泌的肝細胞生長因子(HGF)就會刺激細胞生長、細胞運動、胚胎發生、傷口癒合及血管生成。這些多能作用在發育、內環境平衡和組織再生中起基礎性的重要作用。HGF信號傳遞還有助於幾種人癌症中的癌發生和腫瘤發展，並且可促進腫瘤轉移密切相關的攻擊性細胞侵襲力。(Nakamura et al. , J Clin Invest.，106，1511-9，2000;Comoglio et al. , Semin Cancer Biol，11，153-65，2001;Boccaccio, Nat Rev Cancer, 6，637-45，2006;Huh CF et al.，ProcNatl Acad Sci USA,101，4477-82，2004)。大多數的HGF/c-Met信號轉導異常來自於由HGF或c_Met過表達或突變導致的HGF或c-Met活性升高，並且已知這與多種癌症患者的不利預後密切相關。由於發現c-Met蛋白活性和癌症發生率/轉移之間密切關係以及其他受體酪氨酸激酶抑制劑在臨床上成功，對祀向c-Met的抗癌藥物的開發有積極進展。但是，目前臨床階段的大多數候選藥物是基於蛋白質或c-Met受體抗體的三級結構設計的化學合成抑制劑，例如抑制c-Met信號途徑的酪氨酸激酶抑制劑。雖然低分子量的激酶抑制劑與靶向大量蛋白激酶的激酶抑制劑相比具有提高的對c-Met的選擇性，但仍然顧慮由於脫靶至其他與c-Met結構相似的蛋白質而導致的副作用。雖然相比之下抗體藥物有著極好的選擇性，但仍然存在由複雜生產過程導致的生產率問題和儲存過程中不穩定問題。因此，一直需求開發靶向c-Met功能的有效抑制劑。最近，人們發現核糖核酸介導的幹擾(RNAi )可以通過引起甚至對現有技術來說還不是藥物靶點的序列特異性基因沉默來幫助開發首要候選藥物。因此，RNAi被認為是一種能夠對靶點有限和合成藥物非特異性問題提供解決方案且可以克服化學合成藥物局限的技術。因而，許多關於RNAi在開發現有技術很難治療的多種疾病尤其是癌症的藥物中應用的研究取得了積極的進展。不過，已經發現siRNA (small interfering RNA)會引發固有的免疫反應,並且還會超預計地更頻繁引起非特異性RNAi作用。
有報導顯示，在哺乳動物細胞中，長的雙鏈SiRNA可以誘導有害的幹擾素反應；短的雙鏈siRNA也可以誘導對人身體或細胞有害的始初幹擾素反應；並且已經知道，許多siRNA會引起比預計更高的非特異性RNAi作用(Kleirman etal. Nature, 452:591-7，2008)。雖然已經嘗試開發靶向在癌症發展中起重要作用的C-Met的siRNA抗癌藥物，但到目前為止尚未取得顯著成果。siRNA的個體序列的基因抑制效應還未被提出，尤其是免疫活性還未被考慮。雖然，siRNA由於其高活性、極好靶特異性等優點而顯示出了作為新藥的巨大前景，但是對於治療性開發仍然有一些障礙需要克服，例如由於其可能被血液中的核酸酶降解而血穩定性低、由於帶負電荷而穿過細胞膜的能力較弱、由於快速被排洩而在血液中的半存留期較短，從而其組織分布有限、並且可誘導能夠作用於其他基因調節途徑的脫靶效
應。 最近，為改善這些缺點並使之能應用到臨床試驗中，在siRNA中引入化學修飾的研究取得了一 定進展(Davidson, Nat. Biotechnol. , 24:951-952，2006; Sioud andFurset, J. Biomed. Biotechnol. , 2006:23429, 2006)。

發明內容
因此，發明人開發了具有高序列特異性並因此可特異性結合到靶基因的轉錄本以增強RNAi活性且不會誘導任何免疫毒性的siRNA，並完成了本發明。—實施方案提供了可互補結合到c-Met mRNA轉錄本並因此可特異性抑制c-Met合成和/或表達的siRNA。另一實施方案提供了用於表達所述siRNA的表達載體。另一個實施方案提供了抑制C-Met合成和/或表達的藥物組合物，含有所述siRNA或所述siRNA表達載體作為活性成分。另一實施方案提供了含有所述siRNA或所述siRNA表達載體作為活性成分的抗癌組合物。另一實施方案提供了一種抑制C-Met合成和/或表達的方法,包括製備所述siRNA或所述siRNA表達載體；以及使所述siRNA或所述siRNA表達載體與表達c-Met的細胞相接觸，並將所述siRNA和/或所述siRNA表達載體用於在表達c-Met的細胞中抑制c-Met的合成和/或表達。又一實施方案提供了一種抑制癌細胞生長的方法，包括製備所述siRNA或所述siRNA表達載體；以及使所述siRNA或所述siRNA表達載體與表達c-Met的細胞相接觸，並將所述siRNA或所述siRNA表達載體用於在表達c-Met的癌細胞中抑制癌細胞生長。又一實施方案提供了一種預防和/或治療癌症的方法，包括製備所述siRNA或所述siRNA表達載體；以及將所述siRNA或所述siRNA表達載體以有效治療劑量給予患者，並將所述siRNA或所述siRNA表達載體用於預防和/或治療癌症。


圖Ia到圖Id顯示了 siRNA處理的細胞因子濃度變化，其中Ia表示α -幹擾素的濃度，Ib表示γ -幹擾素的濃度，Ic表示白介素-12的濃度，Id表示腫瘤壞死因子的濃度。
具體實施例方式本發明提供了可互補結合到c-Met mRNA轉錄本的鹼基序列並因此抑制所述細胞中c-Met合成和/或表達的siRNA、含有所述siRNA的藥物組合物以及其用途。本發明一方面提供了特異性抑制c-Met合成和/或表達的siRNA。另一方面提供了抑制c-Met合成和/或表達的藥物組合物，含有特異性抑制c-Met合成和/或表達的siRNA作為活性成分。另一方面提供了抑制癌細胞生長的藥劑或預防和/或治療癌症的藥物組合物(抗癌組合物)，含有可特異性抑制c-Met合成和/或表達的siRNA作為活性成分。本發明涉及抑制哺乳動物包括人體內c-Met mRNA、其可變剪接形式或變體或者相同譜系c-Met基因的表達的技術，這可以通過給予患者某一量的本發明siRNA以減少靶mRNA來實現。以下將詳細描述本發明。 c-Met可以源自於哺乳動物，優選人，或者它可以是與人相同譜系的c_Met或其突變體。術語「與人相同譜系」是指具有與人c-Met基因或源自其的mRNA有80%或更大序列同源性的基因或mRNA的哺乳動物，具體地，它可以包括人、靈長類、嚙齒類等。根據一個實施方案，對應於編碼c-Met的mRNA的正義鏈的cDNA序列可以是SEQID NO I。本發明的SiRNA可以靶向對應於選自由以下序列組成的區域的至少一個鹼基序列的mRNA或cDNA區域c_Met的mRNA或cDNA中的連續15_25bp，優選連續18_22bp，優選連續2-21bp。cDNA上優選的靶點區域總結在下表I中。因此，本發明的一個實施方案提供了靶向對應於選自SEQ ID NO: I的c-Met cDNA區域中SEQ ID NO. 2到21的至少一個鹼基序列的mRNA或cDNA區域的siRNA。具體地，提供了靶向對應於選自SEQ ID N0.3、18和21的鹼基序列的mRNA區域的siRNA。表lc_Met cDNA 上的靶區域(SEQ ID NO: I) (20)
權利要求
1.一種15到30bp的雙鏈SiRNA (小幹擾RNA)，其可靶向對應於選自下表1_1中描述的c-Met cDNA區域的至少一個的mRNA區域
2.權利要求I的siRNA，其中所述siRNA可靶向對應於選自SEQID NO 3、18和21的至少一個鹼基序列的mRNA區域。
3.權利要求I的siRNA，其中所述siRNA在3』末端、5』末端或兩個末端包含由I到5個核苷酸組成的懸突。
4.權利要求2的siRNA，其中所述siRNA包括選自下表6中描述的siRNAI到23的核苷酸序列 表6
5.權利要求4的siRNA，其中所述siRNA選自 siRNA 2，其包含SEQ ID NO. 24的正義序列和SEQ ID NO. 25的反義序列； siRNA 17，其包含SEQ ID NO. 54的正義序列和SEQ ID NO. 55的反義序列； siRNA 20，其包含SEQ ID NO. 60的正義序列和SEQ ID NO. 61的反義序列； siRNA 21，其包含SEQ ID NO. 62的正義序列和SEQ ID NO. 25的反義序列； siRNA 22，其包含SEQ ID NO. 63的正義序列和SEQ ID NO. 55的反義序列；以及 siRNA 23，其包含SEQ ID NO. 64的正義序列和SEQ ID NO. 61的反義序列。
6.權利要求I的siRNA，其中至少一個核糖核苷酸的糖或鹼基結構或者核糖核苷酸之間的鍵被化學修飾。
7.權利要求6的siRNA，其中所述化學修飾是以硼烷磷酸鍵或磷硫醯鍵修飾3』末端、5』末端或兩末端的磷酸二酯鍵。
8.權利要求6的siRNA，其中所述化學修飾是在3』末端、5』末端或兩末端引入ENA(乙烯橋接核酸)。
9.權利要求6的siRNA，其中所述化學修飾是以選自_NH2(氨基)、-C-烯丙基、-F(氟基)和-O-Me (甲基)的至少一個取代核糖環的2』 -OH (羥基)。
10.權利要求6的siRNA，其中所述化學修飾siRNA包括選自下表11_1中描述的siRNA24-40中的核苷酸序列 表11-1
11.一種表達載體，其包含權利要求1-10任一項的SiRNA。
12.權利要求11的表達載體，其中所述表達載體選自質粒、腺相關病毒載體、逆轉錄病毒載體、痘苗病毒載體和溶瘤腺病毒載體。
13.一種抗癌組合物，其含有權利要求1-10任一項的siRNA作為活性成分。
14.權利要求13的抗癌組合物，其包括與核酸遞送系統的複合物形式的siRNA。
15.權利要求14的抗癌組合物，其中所述核酸遞送系統選自病毒載體、非病毒載體、月旨質體、陽離子聚合物、微團、乳劑和固態脂質納米顆粒。
16.權利要求13的抗癌組合物，還包括抗癌化學治療物，或 抑制選自生長因子、生長因子受體、下遊信號轉導蛋白、病毒癌基因和抗癌劑抗性基因的一個的表達的siRNA。
17.一種抑制c-Met合成和/或表達的方法，包括製備權利要求1-10任一項的siRNA ；使所述siRNA與表達c-Met的細胞相接觸。
18.—種抑制癌細胞生長的方法，包括製備權利要求1-10任一項的siRNA ;使所述siRNA與表達c-Met的癌細胞相接觸。
19.一種預防和/或治療癌症的方法，包括製備權利要求1-10任一項的siRNA ;將所述siRNA以治療有效量給予患者。
全文摘要
公開了一種可互補結合到c-Met轉錄本(mRNA轉錄本)從而抑制c-Met表達而不引起免疫應答的小幹擾RNA(siRNA)，以及所述siRNA用於預防和/或治療癌症的用途。可互補結合到編碼c-Met的mRNA的該siRNA可以通過RNA幹擾(RNAi)來抑制在幾乎所有癌細胞中共同過表達的c-Met的表達，從而抑制癌細胞的增殖和轉移，因此所述siRNA可以用作抗癌劑。
文檔編號C12N15/11GK102782133SQ201080065020
公開日2012年11月14日 申請日期2010年12月28日 優先權日2009年12月31日
發明者印昌勳, 趙恩娥, 金善玉, 金詳熹 申請人:株式會社三養生物製藥