經修飾的細胞因子的純化的製作方法

2023-04-26 07:26:11 1

專利名稱：經修飾的細胞因子的純化的製作方法
技術領域：
本發明涉及從異構體混合物中分離達貝泊汀(darb印oetin)的低pi異構體的方法。
背景技術：
促紅細胞生成素或EPO是糖基化的細胞因子，其由肝和腎細胞產生，並且調節紅 細胞的產生。純化的重組人EPO可給病人服用，以治療與紅細胞供給缺乏相關的疾病，例如 貧血和慢性腎衰竭。人EPO分子的多肽骨架具有不變的胺基酸序列；然而，糖側鏈在含糖量和結構方 面呈現出微觀不均一性(Sasaki H 等人，J. Biol. Chem.，1987 ；262 :12059_76，Rush RS 等 人，Anal. Chem.，1995 ；67 1442-52 和 Rush RS 等人，Anal. Chem.，1993 ；65 1834-42)。帶 負電荷的唾液酸分子通常將糖鏈的每一個臂的末端封閉。因此，糖鏈的可變性質(整體上) 和唾液酸的含量(特別地)會產生帶有不同電荷的EPO異構體(Rush RS等人，Anal. Chem.， 1995 ；67 1442-52)。Egrie 及其同事(Egrie JC.和 Browne JK.，Br. J. Cancer, 2001 ；84， 3-10 和 Egrie 等人，Glycoconj. J.，1993 ；10 :263_269)發現了 rHuEPO 的糖部分上的唾液 酸基團數量與其血清半衰期及生物活性之間的直接聯繫。具有更多唾液酸殘基的促紅細胞 生成素異構體顯示出更強的生物活性，因為唾液酸殘基會阻止在體內的快速清除。達貝泊汀是新的紅細胞生成促進蛋白或具有五個N-連接的糖鏈和多至22個唾 液酸的EPO類似物。相反，重組人EPO具有三個N-連接的糖鏈和最多14個唾液酸(Egrie JC.和 Browne JK.，Br. J. Cancer，2001 ;84，3-10 和 Elliot S 等人，Blood，2000 ；96 8 2a)。 由於額外的糖基化，達貝泊汀相對於重組人EPO顯示出長三倍的血清半衰期和增加的體內 活性。達貝泊汀的異構體的產生主要是由於它們的糖基含量不同以及帶負電荷的末端唾液 酸殘基的數量不同。具有更高唾液酸含量的異構體具有低Pl。這些具有低Pl的達貝泊汀 的異構體已被證明具有更高的治療價值，例如Amgen Corporation的以ARANESP 形式銷售 的產品。 文獻公開了通過單獨使用陰離子交換色譜或使用陰離子交換色譜與疏水相互作 用或排阻色譜技術的組合來純化EPO及其類似物。國際申請公布號WO 00/27869公開了促紅細胞生成素的純化方法，其由以下順序 的步驟組成疏水相互作用、陰離子交換、陽離子交換和排阻色譜步驟。國際申請公布號WO 03/045996公開了通過反相色譜、陰離子交換和排阻色譜的重組人促紅細胞生成素的色譜 純化。Gokana 等人，Journal of Chromatography，第 701 卷，1997，109-118 頁，描述了通過 DEAE-S印hacel色譜的重組人促紅細胞生成素異構體的色譜分離方法。因此，上述公開具有一系列複雜的色譜步驟，用於促紅細胞生成素及其類似物的 純化。然而，需要用於從異構體混合物中分離達貝泊汀的低Pl異構體的簡單而有效的方 法。
發明內容
本發明的一些方面提供了分離達貝泊汀的異構體的方法。在一些實施方案中，所 述方法用於達貝泊汀的低Pi異構體的分離。在一些具體的實施方案中，所述方法用於Pi 為約4. 5或更小的異構體的分離。異構體的分離或純化使用至少一個在流通模式(flow-through mode)下的陽離子 交換色譜步驟來完成。所述方法使用一定範圍的PH和鹽濃度，以從達貝泊汀異構體的混合 物中分離低Pl異構體。一方面，本發明提供了從達貝泊汀異構體的混合物中分離達貝泊汀的低Pl異構 體的方法，所述方法包括至少一個在流通模式下的陽離子交換色譜步驟。一方面，本發明提供了從達貝泊汀異構體的混合物中分離達貝泊汀的低Pl異構 體的方法，所述方法包括至少一個在流通模式下的陽離子交換色譜步驟且進一步包括至少 一個陰離子交換色譜步驟。一方面，本發明提供了從達貝泊汀異構體的混合物中分離達貝泊汀的低Pl異構 體的方法，所述方法包括至少一個在流通模式下的陽離子交換色譜步驟和進一步包括至少 一個混合模式交換色譜步驟。


圖1是實施例6的實驗中得到的等電聚焦凝膠，其顯示了實施例5中描述的Q瓊 脂糖凝膠步驟的洗脫液中得到的低Pi異構體。圖2是實施例6的實驗中得到的等電聚焦凝膠，其顯示了如實施例4中所述進行 的CM-瓊脂糖凝膠步驟的流通液(flow-through)中得到的低pi異構體。
具體實施例方式本發明的一些方面涉及通過在流通模式下的陽離子交換色譜分離達貝泊汀的低 Pi異構體的方法。本發明包括包含至少一個在流通模式下的陽離子交換色譜步驟的方法，其中從異 構體的混合物中分離低Pl異構體。這同時作為病毒滅活步驟，這是由於該步驟中使用低PH 範圍的緩衝劑，以得到所需的異構體。此處使用的術語「異構體」是指具有相同的胺基酸序列，但由於糖基化、醯基化、脫 醯胺基或硫酸化的不同而具有不同的電荷，且因此具有不同的等電點的蛋白。「等電點」或「pi」是其中特定的分子或表面不帶有淨電荷的pH值。多肽的「pi」 是指其中所述多肽的正電荷和其負電荷平衡的PH值。「pi」可以通過各種已知的方法估算， 例如從多肽上的胺基酸和/或唾液酸殘基的淨電荷估算或通過使用等電聚焦、層析聚焦等 估算。低pi異構體是具有約4. 5或更低的pi的異構體。在一個實施方案中，低pi異構體通過包括陰離子交換色譜步驟或混合模式色譜 步驟的方法分離得到，所述混合模式色譜步驟包括至少一個在流通模式下的陽離子交換色 i普步馬聚ο在另一個實施方案中，通過包括陰離子交換步驟或混合模式色譜步驟以及在流通模式下的陽離子交換色譜步驟、任選存在的之後的另一個陰離子交換步驟或混合模式色譜 步驟的方法將低pi異構體從異構體混合物中分離。在另一個實施方案中，通過包括陰離子交換或混合模式色譜步驟、在流通模式下 的第一陽離子交換色譜步驟以及在流通模式下的第二陽離子交換色譜步驟的方法將低Pi 異構體從其異構 體混合物中分離。在另一個實施方案中，通過包括陰離子交換或混合模式色譜、在流通模式下的第 一陽離子交換色譜和在流通模式下的第二陽離子交換色譜、之後的另一個陰離子交換或混 合模式色譜步驟的方法將低Pi異構體從其它異構體混合物中分離或純化。在另一個實施方案中，通過包括陰離子交換色譜步驟、在流通模式下的第一陽離 子交換色譜和在流通模式下的第二陽離子交換色譜、之後的混合模式色譜步驟的方法將低 Pi異構體從其它異構體混合物中分離或純化出來。這裡提到的實施方案在色譜步驟之間可以任選地包括切向流過濾、濃縮、滲濾或 超濾步驟中的任意步驟。這裡提到的實施方案可以包括一個或多個病毒滅活步驟或無菌過濾或納濾步驟。實施方案中提到的陰離子交換色譜可以採用任何弱或強的陰離子交換色譜樹脂 或膜進行，所述樹脂或膜起到弱或強的陰離子交換劑的作用。陰離子交換色譜樹脂或膜的 實例是Q-瓊脂糖凝膠色譜樹脂或膜。實施方案中提到的陽離子交換色譜可以採用任何弱或強的陽離子交換色譜樹脂 或膜進行，所述樹脂或膜起到弱或強的陽離子交換劑的作用。弱陽離子交換樹脂的實例是 羧甲基-瓊脂糖凝膠(CM-瓊脂糖凝膠)或具有類似的羧甲基配體的樹脂。實施方案中提到的混合模式色譜是指其中包含一種以上色譜分離原理(通常為 離子和疏水原理)起作用的色譜樹脂。因此，混合模式樹脂是指具有陽離子或陰離子、疏水 基團或配體的固相。術語「固相」是指任何非水性基質。混合模式色譜配體顯示出疏水或 電荷相互作用之一或兩者兼備。混合模式樹脂的實例是Captoadhere樹脂或通過類似方式 起作用的任何混合模式樹脂。陽離子交換步驟中的「流通模式」是指其中所期望的蛋白不與柱結合且在上樣或 上樣後的洗脫步驟中在流通溶液中獲得的過程。流通液中的期望的蛋白可以以各個級分的 形式收集並合併到一起或可以以單個級分的形式收集。在陽離子交換色譜步驟中，用於將蛋白上樣的緩衝劑的pH值為約2至約5，或2. 8 至約4. 8，或約3至約3. 5。本文在洗脫步驟中用於獲得蛋白的緩衝劑的pH值為約2至約 5，或約2. 8至約4，或約3至約3. 5。在第一陽離子交換步驟中的使用的緩衝劑的pH值可以與第二陽離子交換步驟中 的使用的PH值不同。用於配製緩衝溶液的緩衝劑可以包括乙酸鈉或檸檬酸鈉或磷酸鹽緩衝劑，以及它 們的鹽或衍生物。在一些實施方案中，緩衝劑的濃度為約IOmM至約IOOmM,或約40至約 90mM,或約75至約85mM。參考以下實施例，對本發明的某些具體方面和實施方案進行更詳細的描述，提供 以下實施例的目的僅用於解釋說明。這些實施例不應以任何方式被視為對本發明範圍的限 制。
實施例實施例1蛋白的表汰和收穫。

通過將CHO-S親本細胞系用獲自達貝泊汀α表達載體(pCS_達貝泊汀-WPE (新 ori))的逆轉錄病毒載體(retrovector)轉導得到中國倉鼠卵巢(Chinese Hamster Ovary, CH0)生產細胞系。轉導後，在T型瓶中，10-14天後匯合的(pooled)細胞群表達多至 36 μ g/rl的達貝泊汀α。將匯合的細胞群稀釋至非常低的細胞密度(1_3活細胞/200 μ 1 培養基)並平鋪於96孔微量滴定板上以形成源於單一細胞的克隆細胞系。篩選用於達貝 泊汀α生產的克隆並選擇高產率的克隆用於表達。在被接種到生產反應器前，在3個旋轉器(spinner)階段以及1個種子反應器階 段中將表達達貝泊汀α的細胞從主細胞庫擴展。PF CHO培養基用於在旋轉器中培養細胞，以得到良好的細胞生長和高生存力。所 述PF-CHO培養基每升培養基包括PF-CH0主粉末6. 0g，PF-CHO基礎粉末10. 4g，L-穀氨醯 胺0.58g，Pluronic F-68 1. 0g，碳酸氫鈉2. 0g。在接種前將培養基的pH值設定為7。將獲 自主細胞庫的細胞接種在包含PF-CHO培養基的旋轉器瓶中，初始細胞計數為0. 2百萬細胞 /mL。將旋轉器瓶在保持在37°C下的5% CO2的溫育器中進行溫育。溫育72小時後，當細胞 密度達到1百萬細胞/mL時，將細胞收穫並轉入另一階段。經過在旋轉器瓶中轉換的3個 階段後，將細胞接種到包含4L SFM-6(1)培養基的6. 5L的種子反應器中，初始細胞密度為 0. 2百萬細胞/mL。所述SFM-6(1)培養基包括「DMEM/F-12」基礎培養基、胺基酸、胰島素、 維生素、微量元素、植物蛋白腖、碳酸氫鈉和果糖。在種子反應器中，將PH值保持在7.0，將 培養溫度控制在37. 0°C。通過控制攪動和曝氣使溶解氧保持在40%。72小時後當細胞密 度達到1百萬細胞/mL時，無菌收穫培養物且將細胞轉入IlL的包含10LSFM-6(2)培養基 的生產反應器中，初始細胞密度為0. 2百萬細胞/mL。12天後收穫培養物，以收集包含目標 產物的上清液。實施例2通過陰離子交換餼譜或Captoadhere餼譜捕獲。在粗提取物澄清後，將澄清的細胞培養液濃縮，並通過使用pH值為7. 1的25mM 三羥甲基氨基甲烷、60mM NaCl緩衝劑進行滲濾(使用截留分子量為30kDa的切向流過濾 (TFF))降低電導率。隨後將濃縮後的細胞培養液上樣至經5個柱體積(CV)的25mM三羥甲 基氨基甲烷、60mM NaCl、pH值7. 1的緩衝劑預平衡的Q-瓊脂糖凝膠柱。然後，用5CV的平 衡緩衝劑(25mM三羥甲基氨基甲烷、60mMNaCl，pH值7. 1)洗滌柱。然後，用pH值為4.0的 SOmM乙酸鈉、40-120mM NaCl緩衝劑進行低pH值洗滌。再次用平衡緩衝劑洗滌。上樣至柱 上的期望的蛋白用PH值為7. 1的25mM三羥甲基氨基甲烷、140-300mM NaCl緩衝劑洗脫。此外，可使用CaptoAdhere (混合模式色譜柱)替代Q-瓊脂糖凝膠柱。用5CV的 20mM磷酸鹽，60mM NaCl，pH值7. 1 士0. 2的緩衝劑預平衡CaptoAdhere柱。然後用5CV的平 衡緩衝劑(20mM磷酸鹽，60mM NaCl，pH值7. 1 士 0. 2)洗滌柱。接著用pH值為4. 0的80mM 乙酸鈉、40-120mM NaCl緩衝劑進行低pH值洗滌。再次用平衡緩衝劑洗滌。上樣至色譜柱 上的期望的蛋白用PH值緩衝為7. 1 士0. 2的20mM磷酸鹽、140-300mM NaCl洗脫。實施例3
第一陽離子交換餼譜。將由實施例2得到的洗脫液級分合併並濃縮，並通過使用PH值為4. 8的73mM乙 酸鈉緩衝劑的TFF步驟的滲濾過程使電導率降低。該步驟作為緩衝劑交換步驟，其中使所 述合併的Q-瓊脂糖凝膠柱洗脫液進入到pH為4. 8的73mM乙酸鈉緩衝劑中。隨後將所述 緩衝劑交換樣品上樣至已用5CV的pH為4. 8的73mM乙酸鈉緩衝劑預平衡的CM-瓊脂糖凝 膠柱上。在上樣樣品時期望的產物在流通液中得到，而雜質則結合到色譜柱上。上樣後，用 3CV的pH為4. 8的73mM乙酸鈉緩衝劑洗滌柱。期望的產物也在洗滌步驟中以流通液的形 式得到。結合在柱上的雜質隨後用PH為7. 1的25mM三羥甲基氨基甲烷、500mM NaCl緩衝 劑洗脫。實施例4第二陽離子交換餼譜。將由實施例3得到的流通液級分或由實施例2得到的洗脫液級分合併、濃縮並使 用TFF與包含83mM乙酸鈉(或80_85mM乙酸鈉)的pH為3. 3 (或pH 3. 0-3. 5)的緩衝劑交 換。將由TFF得到的樣品上樣至用5CV的pH為3. 3的83mM乙酸鈉緩衝液預平衡的CM-瓊 脂糖凝膠柱。在上樣樣品時期望的產物在流通液中得到。發現此步驟中使用的緩衝劑的PH 值對得到流通液中的所需的異構體至關重要。此外，上述過程持續超過30分鐘，因此其同 時也作為病毒滅活步驟。上樣後，將色譜柱用9CV的pH為4. 8的73mM乙酸鈉緩衝劑洗滌。 期望的產物也在洗滌步驟中的流通液中得到。結合在柱上的雜質隨後用PH為7. 1的25mM 三羥甲基氨基甲烷、500mM NaCl緩衝劑洗脫。實施例5 陰離子交換餼譜步驟或Captoadhere餼譜步驟。將由實施例4得到的流通液級分上樣至已用含有25mM三羥甲基氨基甲烷、60mM NaCl, pH為7. 1的緩衝劑預平衡的Q-瓊脂糖凝膠柱上。用相同的緩衝劑洗滌柱。期望的 產物結合到色譜柱上，並用PH緩衝為6. 0的40mM磷酸鹽，280mMNaCl洗脫。或者，可使用CaptoAdhere (混合模式色譜柱)代替Q-瓊脂糖凝膠柱。在這種情 況下，該柱用5CV的pH為6. 0的20mM磷酸鹽緩衝劑預平衡，並再次用相同的緩衝劑(5CV) 洗滌。隨後用4CV的包含40mM磷酸鹽和280mMNaCl、pH為6. 0的緩衝劑洗脫結合在色譜柱 上的期望的蛋白。該步驟(實施例5)作為濃縮和緩衝劑交換步驟，因此不需要另一個TFF。此外，這 提供了比常規TFF更可控的環境。實施例6等電聚焦。通過等電聚焦(IEF)分析實施例4的流通液級分和由實施例5得到的洗脫液。使 用水、尿素、30%丙烯醯胺和兩性電解質(pH範圍2-4和3-10)製備IEF凝膠。將上述組分 小心地混合併向混合物中加入10重量/體積％過硫酸氨和TEMED，將上述混合物注入凝膠 夾層裝置(gel sandwich apparatus,BIORAD Mini Protean Cell)並配備梳。使凝膠在室 溫下聚合45分鐘。將少量的蛋白溶液與等體積的樣品緩衝劑(甘油、兩性電解質和Milli Q水)混合併載入到凝膠中。隨後將凝膠放入BIORAD Mini Protean Cell裝置中並在不同 的室中充入陰極緩衝劑(25mM氫氧化鈉)和陽極緩衝劑(25mM正磷酸)。在室溫下，將由實施例4得到的流通液級分或由實施例5得到的洗脫液在200V恆壓下運行1. 5小時，用於兩 性電解質的預聚焦，然後在室溫下，將電壓增加到400V並再運行1. 5小時。運行後，將凝膠 小心地除去，並如現有技術中公開的那樣，使用考馬斯藍染色或銀染色。圖1顯示了由根據以上所述進行的實驗得到的等電聚焦凝膠，顯示了實施例5中 描述的Q瓊脂糖凝膠步驟的洗脫液中得到的低Pl異構體。泳道A至F是根據本發明進行 的不同純化批次；即，使表達達貝泊汀α的細胞培養物的收穫物經歷如實施例2所述的陰 離子交換色譜，然後經歷如實施例4所示的在流通模式下的陽離子交換色譜，然後經歷如 實施例5所示陰離子交換色譜。

圖2顯示了由根據以上所述進行的實驗得到的等電聚焦凝膠，顯示了如實施例4 中所述進行的CM-瓊脂糖凝膠步驟的流通液中得到的低pi異構體。圖中的泳道A至C和 F至I是根據本發明進行的不同純化批次；S卩，使表達達貝泊汀α的細胞培養物的收穫物 經歷如實施例2所述的陰離子交換色譜，然後經歷如實施例4所示的在流通模式下的陽離 子交換色譜。泳道D和E是可商購的達貝泊汀α樣品ARANESP 中觀察到的異構體(pi 2. 8-3. 3)，並用作用於對比的標準品。
權利要求
1.從達貝泊汀異構體的混合物中分離達貝泊汀的低Pi異構體的方法，所述方法包括 至少一個在流通模式下的陽離子交換色譜步驟。
2.如權利要求1所述的方法，其中所述異構體具有小於約4.5的pi值。
3.如權利要求1所述的方法，其進一步包括至少一個陰離子交換色譜步驟。
4.如權利要求3所述的方法，其中至少一個陰離子交換色譜步驟在至少一個陽離子交 換色譜步驟之前。
5.如權利要求3所述的方法，其中至少一個陰離子交換色譜步驟在至少一個陽離子交 換色譜步驟之後。
6.如權利要求3所述的方法，其中至少一個陰離子交換色譜步驟在至少一個陽離子交 換色譜步驟之前且至少一個陰離子交換色譜步驟在至少一個陽離子交換色譜步驟之後。
7.如權利要求1所述的方法，其包括兩個陽離子交換色譜步驟。
8.如權利要求7所述的方法，其中至少一個陰離子交換色譜步驟在至少一個陽離子交 換色譜步驟之前。
9.如權利要求7所述的方法，其中至少一個陰離子交換色譜步驟在至少一個陽離子交 換色譜步驟之後。
10.如權利要求7所述的方法，其中至少一個陰離子交換色譜步驟在至少一個陽離子 交換色譜步驟之前且至少一個陰離子交換色譜步驟在至少一個陽離子交換色譜步驟之後。
11.如權利要求1所述的方法，其進一步包括至少一個混合模式色譜步驟。
12.如權利要求11所述的方法，其中至少一個混合模式色譜步驟在至少一個陽離子交 換色譜步驟之前。
13.如權利要求11所述的方法，其中至少一個混合模式色譜步驟在至少一個陽離子交 換色譜步驟之後。
14.如權利要求11所述的方法，其中至少一個混合模式色譜步驟在至少一個陽離子交 換色譜步驟之前且至少一個混合模式色譜步驟在至少一個陽離子交換色譜步驟之後。
15.如權利要求11所述的方法，其包括兩個陽離子交換色譜步驟。
16.如權利要求15所述的方法，其中至少一個混合模式色譜步驟在至少一個陽離子交 換色譜步驟之前。
17.如權利要求15所述的方法，其中至少一個混合模式色譜步驟在至少一個陽離子交 換色譜步驟之後。
18.如權利要求15所述的方法，其中至少一個混合模式色譜步驟在至少一個陽離子交 換色譜步驟之前且至少一個混合模式色譜步驟在至少一個陽離子交換色譜步驟之後。
19.如權利要求3所述的方法，其包括至少一個混合模式色譜步驟。
20.如權利要求19所述的方法，其中至少一個混合模式色譜步驟在陽離子交換色譜步 驟之前。
21.如權利要求19所述的方法，其中至少一個混合模式色譜步驟在陽離子交換色譜步驟之後ο
22.如權利要求19所述的方法，其中至少一個混合模式色譜步驟在至少一個陽離子交 換色譜步驟之前且至少一個陰離子交換色譜步驟在至少一個陽離子交換色譜步驟之後。
23.如權利要求19所述的方法，其中至少一個陰離子交換色譜步驟在至少一個陽離子交換色譜步驟之前且至少一個混合模式色譜步驟在至少一個陽離子交換色譜步驟之後。
24.如權利要求19所述的方法，其包括兩個陽離子交換色譜步驟。
25.如權利要求M所述的方法，其中所述混合模式色譜步驟在至少一個陽離子交換色 譜步驟之前。
26.如權利要求M所述的方法，其中所述混合模式色譜步驟在至少一個陽離子交換色譜步驟之後ο
27.如權利要求M所述的方法，其中所述混合模式色譜步驟在至少一個陽離子交換色 譜步驟之前且所述陰離子交換色譜步驟在至少一個陽離子交換色譜步驟之後。
28.如權利要求M所述的方法，其中所述陰離子交換色譜步驟在至少一個陽離子交換 色譜步驟之前且所述混合模式色譜步驟在至少一個陽離子交換色譜步驟之後。
29.如權利要求1- 之一所述的方法，其中所述流通液在約2-5.5的pH值下得到。
30.如權利要求四所述的方法，其中所述流通液在約3-5的pH值下得到。
31.如權利要求30所述的方法，其中所述流通液在約3.3的pH值下得到。
32.如權利要求31所述的方法，其中所述流通液在約4.8的pH值下得到。
全文摘要
本發明提供了純化經修飾的細胞因子的有效方法。所述方法包括使用色譜技術純化期望的細胞因子。經純化的細胞因子可用作治療組分。
文檔編號C07K14/52GK102076705SQ200980124118
公開日2011年5月25日 申請日期2009年6月23日 優先權日2008年6月24日
發明者A·維韋克, C·羅伊, D·科蒂察 申請人:雷迪博士實驗室公司, 雷迪博士實驗室有限公司