一種甲基化dna的測序方法及其應用的製作方法

2023-04-26 18:34:31 1

一種甲基化dna的測序方法及其應用的製作方法
【專利摘要】本發明涉及一種甲基化DNA的測序方法及其應用。基於目前成熟的高通量測序(Next Generation Sequencing)技術，首次引入羥甲基化修飾的寡核苷酸接頭，將DNA甲基化免疫共沉澱測序技術與亞硫酸氫鹽處理測序技術相結合，從而將不含有甲基化修飾的DNA片段去除，即只對含有甲基化修飾的DNA片段進行亞硫酸鹽處理，最終精確測定這些DNA片段上的甲基化修飾位點；該方法能夠使測定全基因組水平的DNA甲基化修飾位點所需的數據量降至常規方法的1/10，從而降低測序成本和信息處理量，更高效地對全基因組DNA甲基化進行高通量測序。
【專利說明】一種甲基化DNA的測序方法及其應用

【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物【技術領域】，特別涉及一種甲基化DNA的測序方法及其應用。

【背景技術】
[0002] DNA甲基化是表觀遺傳調控中的重要修飾之一，被稱之為哺乳動物DNA中除ATCG 四種鹼基以外的"第五種鹼基"。在哺乳動物胚胎幹細胞和大腦中它主要發生在CpG二核苷 酸中胞嘧啶苯環第五位碳原子上，少部分發生在CHG和CHH(H = A，T，C)上。作為一種共價 修飾，DNA甲基化在正常的分化發育和疾病發生中發揮重要作用，同時在更高等真核生物器 官的細胞分化中可以穩定遺傳，並且在斑馬魚中發現它可以通過精子傳給下一代。在細胞 分化、疾病和環境影響下，DAN甲基化狀態會發生巨大變化。因此，5mC位點的檢測以及DNA 甲基化水平的評估對發育和疾病發生中DNA甲基化狀態的揭示顯得尤為重要。
[0003] 由於2007年高通量測序技術的進步，一些基因組DNA甲基化檢測技術也得到發 展。在單分子水平定量檢測5mC方面，甲基化測序無疑是最強大和全面的一種方法。然而， 甲基化測序需要測到至少整個基因組30倍的測序深度，並且對於大樣本大基因組的DNA甲 基化組的測定，是極其昂貴的。簡化的代表性的重亞硫酸鹽測序（RRBS)實現單鹼基解析度 方案，但是只描繪了覆蓋整個基因組的5%並且局限於CpG島（CGIs)的甲基化圖譜。然而， 不同樣本間的甲基化組分析表明大部分組織和癌症特定的差異甲基化區域發生在CpG島 附近。甲基化DNA免疫共沉澱測序（MeDIP-seq)實現了高達67 %的CpG的覆蓋度，而RRBS 只覆蓋了最少的基因組水平的CpGs (12% )。但是，MeDIP-seq不能實現單鹼基解析度，同 時也不能檢測非CpG的甲基化狀。


【發明內容】

[0004] 為了克服MeDIP-Seq和MethylC-Seq的缺陷但又綜合兩者的優勢，我們將亞硫 酸鹽處理整合到MeDIP-seq的方法中，組成定義為甲基化DNA免疫沉澱亞硫酸鹽測序 (MB-seq)。
[0005] 由於在MeDIP方法中連接了甲基化接頭的未甲基化的片段會被非特異的拉下，另 外未甲基化的11 Iumina測序接頭中的胞啼陡在亞硫酸鹽處理後也會被轉化為尿啼陡，這 將導致接頭連接的DNA片段不能匹配Illumina測序，因此在MB-seq中這些接頭是不適用 的。基於羥甲基化的DNA片段不能被5mC抗體富集並且在亞硫酸處理過程中羥甲基化的胞 嘧啶與甲基化的胞嘧啶有同樣的效果，我們創造性地將羥甲基化的接頭（接頭中所有的胞 嘧啶都是羥甲基化的）引入MB-seq中。
[0006] 具體而言，本發明提供了下述內容：
[0007] -種甲基化DNA的測序方法，包括建庫步驟和測序步驟：
[0008] 其中建庫步驟是指獲得待檢測的甲基化DNA文庫的步驟，所述建庫步驟包括：
[0009] 1)基因組DNA的片段化及雙鏈DNA片段末端修復；
[0010] 2)將1)中得到的DNA片段與羥甲基化修飾的寡核苷酸接頭連接；
[0011] 3)富集步驟2)中的甲基化DNA片段；
[0012] 4)將步驟3)中得到的產物中未甲基化的胞嘧啶鹼基轉化為尿嘧啶鹼基；
[0013] 5)將4)中的單鏈DNA通過引物進行擴增以獲得雙鏈DNA ;
[0014] 6)去除接頭回收純化DNA。
[0015] 其中測序步驟是指對前述建庫步驟獲得的文庫進行序列測定，還包括如下步驟：
[0016] 7)對步驟6)中獲得的雙鏈DNA進行測序。
[0017] 其中建庫步驟和測序步驟中，步驟1)包括：
[0018] a)將基因組DNA片段化成為DNA片段；
[0019] b)將所述DNA片段進行末端修復以獲得具有平末端的DNA片段；
[0020] c)將2)中得到的DNA片段的3'末端加上A鹼基；
[0021] 本發明中，所述羥甲基化修飾的寡核苷酸接頭中所有的鹼基胞嘧啶都是羥甲基化 的。
[0022] 本發明中，步驟3)中的富集羥甲基化DNA通過MeDIP技術進行的。
[0023] 本發明中，步驟4)中通過亞硫酸鹽處理試劑盒將DNA中未甲基化的胞嘧啶鹼基轉 化為尿嘧啶鹼基。
[0024] 本發明中，步驟5)中通過高保真DNA聚合酶將單鏈DNA進行擴增以獲得雙鏈DNA。
[0025] 本發明中，步驟6)中用膠回收試劑盒通過凝膠電泳回收純化的DNA。
[0026] 本發明還提供了所述方法構建得到的DNA測序文庫。
[0027] 本發明中還提供了一種試劑盒，其中至少包含用於DNA末端修復的試劑，DNA 3' 端加 A的試劑，羥甲基化修飾的接頭試劑、通過MeDIP技術富集甲基化DNA的試劑，用於將 未甲基化的胞嘧啶轉化為尿嘧啶的亞硫酸氫鹽試劑，用於擴增的試劑，用於膠回收的試劑。 其中，所述擴增的試劑包括引物。
[0028] 本發明還包括所述試劑盒用於甲基化DNA文庫建庫或者用於甲基化DNA測序的用 途。
[0029] 本發明MB-seq能夠精確地檢測到單個5mC位點的甲基化水平並且基因組覆蓋度 高。相對於甲基化DNA免疫共沉澱測序（MeDIP-seq)準確性提高，無論是在測序深度還是 在測序質量評估方面，本技術都表現出明顯的優勢。同時，本技術在靈敏度與專一性方面 都能達到與全基因組亞硫酸鹽測序技術相近的效果。相對於全基因組亞硫酸鹽測序技術 (MethylC-seq)，所需數據量減少，僅需BS的1/10,成本下降。相對於簡化的具有代表性的 亞硫酸鹽測序（RRBS)，對基因組的覆蓋度大幅提高。MB-seq的技術對於不同起始量的DNA 重複性好。在技術成本上，在功能區甲基化測序數據飽和的情況下可比全基因組亞硫酸氫 鹽測序的數據量少90% -95%，節約每個樣本檢測成本80% -90%。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0030] 下面結合附圖對本發明作進一步說明：
[0031] 圖1是各種DNA甲基化測序方法檢測靈敏度的比較，包含MB-seq、MeDIP-seq、RRBS 及 MethylC-seq、；
[0032] 圖 2 是 MB-seq 與 MeDIP-seq 建庫流程；
[0033] 圖3是MB-seq技術1微克DNA起始量與500納克DNA起始量之間的技術重複性 相關係數；
[0034] 圖4是MB-seq技術200納克DNA起始量與50納克DNA起始量之間的技術重複性 相關係數；
[0035] 圖5是不同DNA甲基化測序方法（MB_seq、RRBS、MethylC_seq)不同測序深度下可 以覆蓋的全基因組CpG的百分數；
[0036] 圖6是不同DNA甲基化測序方法不同測序深度下可以覆蓋的重複序列元件中CpG 的百分數；
[0037] 圖7是三種亞硫酸鹽測序（MB_seq、RRBS、MethylC_seq)檢測到的mCpG重疊分析。

【具體實施方式】
[0038] 下面將結合本發明中的實施例和附圖，對本發明實施例中的技術方案進行清楚、 完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發明一部分實施例，而不是全部的實施例。基 於本發明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創造性勞動前提下所獲得的所有其 他實施例，都屬於本發明保護的範圍。
[0039] 實施例1 :
[0040] 試驗用DNA來自通過SV40T/t抗原和人類端粒酶催化後永生化的人類卵巢上皮細 胞系（T29)。具體操作過程如下：
[0041] 1.獲取基因組DNA
[0042] 取1'29細胞系，用0^^1^0嫩81〇〇(1&1188脫1(^(0丨38611公司）提取樣品0嫩。 將提取得到的DNA編號為MB，取其中200納克DNA樣品作為起始材料，參照圖2中MB-seq 的流程構建文庫，本實施例中構建的是Illumina Hiseq 2000Paired End文庫。
[0043] 2.片段化基因組DNA
[0044] 採用Covaris system(AB公司）將前述步驟1中的DNA樣品進行斷裂，樣品斷裂 結束後，將斷裂後的樣品在2%瓊脂糖凝膠上進行IXTAE電泳檢測，從所述電泳凝膠回收 待測DNA片段。為將樣品DNA片段控制在100?250bp範圍內，Covaris system斷裂具體 操作為：
[0045] 1)雙擊打開 Covaris 主程序"SonoLAB S-Series V2. 54，'後點擊"Start [Enter]，'， 待儀器排氣30分鐘，且水溫降為TC左右後方可使用。打開主程序之前須先確定打碎儀和 冷卻儀的電源開關是否打開，否則主程序會提示錯誤並重試。
[0046] 2)將樣品加入待用的130ul的covaris micro Tube中，樣品加入量5 μ g，最後將 終體積用TE緩衝液補至130μ 1，用移液器將樣品溶液吹打混勻。點擊"Configure"，設置參 數見表1 :
[0047] 表1片段化基因組DNA在Covaris system中的設置參數
[0048]

【權利要求】
1. 一種甲基化DNA的測序方法，其特徵在於，包括如下步驟： 1. DNA樣品的片段化； 2) 將1)中得到的DNA片段與羥甲基化修飾的寡核苷酸接頭連接； 3) 富集步驟2)中的甲基化DNA片段； 4) 將步驟3)中得到的產物中未甲基化的胞嘧啶鹼基轉化為尿嘧啶鹼基； 5) 將4)中的單鏈DNA通過引物進行擴增以獲得雙鏈DNA ; 6) 去除接頭回收純化DNA ; 7) 對步驟6)中獲得的雙鏈DNA進行測序。
2. 根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，步驟1)包括： a) 將基因組DNA片段化成為DNA片段； b) 將所述DNA片段進行末端修復以獲得具有平末端的DNA片段； c) 將b)中得到的DNA片段的3'末端加上A鹼基。
3. 根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述羥甲基化修飾的寡核苷酸接頭中所 有的鹼基胞嘧啶都是羥甲基化的。
4. 根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，步驟3)中的富集羥甲基化DNA通過MeDIP 技術進行。
5. 根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，步驟4)中通過亞硫酸鹽處理試劑盒將 DNA中未甲基化的胞嘧啶鹼基轉化為尿嘧啶鹼基。
6. 根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，步驟5)中通過高保真DNA聚合酶將單鏈 DNA進行擴增以獲得雙鏈DNA。
7. 根據權利要求1所述方法構建得到的DNA測序文庫。
8. -種試劑盒，其中至少包含所述用於DNA末端修復的試劑、DNA 3'端加A的試劑、羥 甲基化修飾的接頭試劑、通過MeDIP技術富集甲基化DNA的試劑、用於將未甲基化的胞嘧啶 轉化為尿嘧啶的亞硫酸氫鹽試劑、用於擴增的試劑、用於膠回收的試劑。
9. 根據權利要求8所述的試劑盒，所述擴增的試劑包括引物。
10. 權利要求8的試劑盒用於建立甲基化DNA文庫或者用於甲基化DNA測序的用途。
【文檔編號】C12Q1/68GK104372079SQ201410578592
【公開日】2015年2月25日 申請日期:2014年10月24日 優先權日:2014年10月24日
【發明者】蔡萬世, 伍鴻鵠, 王康利, 孫中生 申請人:中國科學院遺傳與發育生物學研究所