人鈣離子/鈣調蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ抑制性蛋白及用途的製作方法

2023-05-10 04:29:56

專利名稱：人鈣離子/鈣調蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ抑制性蛋白及用途的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物技術和醫學領域，具體地說，本發明涉及新的編碼人鈣離子/鈣調蛋白依賴性蛋白激酶II抑制性蛋白(Calcium/Calmodulin-DependentProtein Kinase II Inhibitor，簡稱為CaM-KIIN」)多肽的多核苷酸，以及此多核苷酸編碼的多肽。本發明還涉及此多核苷酸和多肽的用途和製備。本發明還涉及CaM-KIIN對細胞生長的抑制活性。本發明的CaM-KIIN是一種新的與細胞增殖、生長以及細胞周期信號有關的細胞內可溶性蛋白。
背景技術：
鈣離子/鈣調蛋白依賴性蛋白激酶II(CaMK II)是一種多功能的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是細胞內信號傳導系統的一個重要組成部分，是Ca2+/CaM調節蛋白家族中的一個主要成員。CaMK II是CaM的重要靶酶之一，許多酶或蛋白質都可以作為它的底物。CaMK II由α，β，γ，δ四種亞單位組成，編碼十多種同功酶。幾乎所有的亞單位都包含有催化區、調節區和結合區，調節區又是由自身抑制區(281-309)、鈣調蛋白結合區(296-311)和自身磷酸化位點(蘇氨酸286，305，306；絲氨酸314)組成。
CaMK II主要存在於神經組織，在某些區域可佔總蛋白量的2％(如鼠的海馬回)。除此以外，在哺乳動物的骨骼肌、心臟、肺、肝臟、胰腺、視網膜、腎、甲狀旁腺、乳腺、子宮、睪丸、小腸的刷狀緣等組織中都可檢測到。CaMK II的亞單位分布因組織而異，α和β亞單位只存在於神經組織，而γ和δ亞單位可存在於除腦以外的其它組織中。隨著對CaMK II的結構、組織分布和生物學功能研究的深入，人們發現CaMK II在多種生物學事件中均發揮重要功能。它在調節神經元的活動，肌肉的收縮，細胞周期的控制，細胞的分泌，DNA損傷的修補，碳水化合物的代謝，基因的表達等方面有著重要的生物學作用。
CaMK II的抑制劑是研究CaMK II生理功能的有效途徑之一。CaMK II的抑制劑有多種，主要有化學合成的抑制劑KN-62、KN-93、KN-92以及生物合成的抑制性多肽AIP。目前報導的天然的內源性抑制性蛋白僅有大鼠腦細胞來源的鈣離子/鈣調蛋白依賴性蛋白激酶II抑制性蛋白CaM-KIIN β和CaM-KIIN α。人源的內源性抑制性蛋白及其生物學功能和應用則未見國內外報導。
已知的大鼠來源的內源性CaMK II抑制性蛋白CaM-KIIN β和CaM-KIIN α具有特異性抑制CaMK II活性的能力。化學合成的CaMK II抑制劑KN-62、KN-93的作用是通過與CaM結合位點的相互作用，阻止CaM與CaMK II的結合，使得CaMK II不能自身磷酸化而不被激活。對於細胞的生理功能，二者可以以劑量依賴性方式阻止細胞的生長，引起細胞周期G1或S相的阻滯，從而導致細胞發生凋亡。KN-62還可以克服人卵巢癌細胞對於一種抗腫瘤藥(阿黴素)的抵抗，在腫瘤治療方面有著重要的作用。CaMK II抑制性劑的這種特異性抑制CaMK II活性的能力提示這些物質可能參與腫瘤生長和轉移的調節作用，由此成為抗腫瘤治療的效應物。
研究已表明，鈣離子/鈣調蛋白依賴性蛋白激酶II抑制性蛋白與多種生命活動相關。因此，為診斷和治療目的研究和開發新的鈣離子/鈣調蛋白依賴性蛋白激酶II抑制性蛋白有重要意義。然而，目前為止卻仍然沒有發現人的鈣離子/鈣調蛋白依賴性蛋白激酶II抑制性蛋白。

發明內容
本發明的目的是提供一種新的人鈣離子/鈣調蛋白依賴性蛋白激酶II抑制性蛋白(CaM-KIIN蛋白)以及其片段、類似物和衍生物。
本發明的另一目的是提供編碼這些多肽的多核苷酸。
本發明的另一目的是提供生產這些多肽的方法以及該多肽和編碼序列的用途。
本發明經過廣泛而深入的研究，發現了新型的人鈣離子/鈣調蛋白依賴性蛋白激酶II抑制性蛋白CaM-KIIN，它與已知大鼠來源的同源蛋白有極高的同源性。與化學性抑制劑對細胞的作用相似，人源CaM-KIIN可以阻遏細胞增殖，具有細胞生長抑制活性。因此，可以人源CaM-KIIN與其他抑制劑一樣可以通過特異性結合CaMKII，阻止CaMK II的磷酸化激活，調控多種生理和病理活動，發揮重要作用，並可能在抗感染、抗炎症反應、抗腫瘤以及神經生長修復、免疫功能調節等多個領域的免疫診斷和免疫治療方面具有重要的開發和應用價值。
在本發明的第一方面，提供新穎的分離出的CaM-KIIN多肽，該多肽是人源的，它包含具有SEQ ID NO2胺基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。較佳地，該多肽是具有SEQ ID NO2胺基酸序列的多肽。
在本發明的第二方面，提供編碼分離的這些多肽的多核苷酸，該多核苷酸包含一核苷酸序列，該核苷酸序列與選自下組的一種核苷酸序列有至少80％相同性(a)編碼上述人CaM-KIIN的多核苷酸；和(b)與多核苷酸(a)互補的多核苷酸。較佳地，該多核苷酸編碼具有SEQ ID NO2所示胺基酸序列的多肽。更佳地，該多核苷酸的序列是選自下組的一種(a)具有SEQ ID NO1中179-415位的序列；(b)具有SEQ ID NO1中1-591位的序列。
在本發明的第三方面，提供了含有上述多核苷酸的載體，以及被該載體轉化或轉導的宿主細胞或者被上述多核苷酸直接轉化或轉導的宿主細胞。
在本發明的第四方面，提供了製備具有人CaM-KIIN蛋白活性的多肽的方法，該方法包含(a)在適合表達人CaM-KIIN蛋白的條件下，培養上述被轉化或轉導的宿主細胞；(b)從培養物中分離出具有人CaM-KIIN蛋白活性的多肽。
在本發明的第五方面，提供了與上述的人CaM-KIIN多肽特異性結合的抗體。還提供了可用於檢測的核酸分子，它含有上述的多核苷酸中連續的10-591個核苷酸。
在本發明的第六方面，提供了模擬、促進、拮抗人CaM-KIIN多肽活性的化合物，以及抑制人CaM-KIIN多肽的表達的化合物。還提供了篩選和/或製備這些化合物的方法。較佳地，該化合物是人CaM-KIIN多肽的編碼序列或其片段的反義序列。
在本發明的第七方面，提供了檢測樣品中是否存在CaM-KIIN蛋白的方法，它包括將樣品與CaM-KIIN蛋白的特異性抗體接觸，觀察是否形成抗體複合物，形成了抗體複合物就表示樣品中存在CaM-KIIN蛋白。
在本發明的第八方面，提供了一種檢測與人CaM-KIIN多肽異常表達相關的疾病或疾病易感性的方法，該方法包括檢測編碼所述多肽的核酸序列中是否存在突變。
在本發明的第九方面，提供了本發明多肽和編碼序列的用途。例如本發明多肽可被用於篩選促進人CaM-KIIN多肽活性的激動劑，或者篩選抑制人CaM-KIIN多肽活性的拮抗劑、或者被用於肽指紋圖譜鑑定。本發明的人CaM-KIIN蛋白的編碼序列或其片段，可被作為引物用於PCR擴增反應，或者作為探針用於雜交反應，或者用於製造基因晶片或微陣列。
在本發明的第十方面，提供了一種藥物組合物，它含有安全有效量的本發明的人CaM-KIIN多肽或其激動劑、拮抗劑以及藥學上可接受的載體。這些藥物組合物可治療腫瘤、炎症、神經系統和心血管病等病症。
本發明的其它方面由於本文的技術的公開，對本領域的技術人員而言是顯而易見的。


下列附圖用於說明本發明的具體實施方案，而不用於限定由權利要求書所界定的本發明範圍。
圖1是本發明的人CaM-KIIN的cDNA序列，其中非編碼序列用小寫字母表示，編碼序列用大寫常規字母表示。
圖2是本發明的人CaM-KIIN蛋白的全長胺基酸序列。
圖3是本發明的人CaM-KIIN蛋白與大鼠來源其他鈣離子/鈣調蛋白依賴性蛋白激酶II抑制性蛋白的胺基酸序列同源性比較圖。上方序列是人CaM-KIIN，下方序列是大鼠來源的CaM-KIIN蛋白。相同的胺基酸在多個序列之間用黑體標出，相似的胺基酸用灰體標出。
圖4是本發明的人CaM-KIIN RT-PCR表達分析圖譜。提示CaM-KIIN表達於某些腫瘤細胞中；在人外周血單核細胞來源的樹突狀細胞成熟並受KLH刺激的活化過程中具有一定的表達模式。
圖5是本發明的人CaM-KIIN Northern印跡雜交所顯示的分布圖。提示CaM-KIIN是一種在特定組織分布的分子。
圖6是本發明的人CaM-KIIN轉染細胞的光鏡觀察照片。提示其具有細胞生長抑制活性。
圖7是本發明的人CaM-KIIN轉染細胞的細胞增殖分析實驗。提示其具有細胞生長抑制活性。
具體實施例方式
在本發明中，術語「CaM-KIIN蛋白」、「CaM-KIIN多肽」或「鈣離子/鈣調蛋白依賴性蛋白激酶II抑制性蛋白」可互換使用，都指具有人鈣離子/鈣調蛋白依賴性蛋白激酶II抑制性蛋白CaM-KIIN胺基酸序列(SEQ ID NO2)的蛋白或多肽。它們包括含有或不含起始甲硫氨酸的鈣離子/鈣調蛋白依賴性蛋白激酶II抑制性蛋白CaM-KIIN。
如本文所用，「分離的」是指物質從其原始環境中分離出來(如果是天然的物質，原始環境即是天然環境)。如活體細胞內的天然狀態下的多聚核苷酸和多肽是沒有分離純化的，但同樣的多聚核苷酸或多肽如從天然狀態中同存在的其他物質中分開，則為分離純化的。
如本文所用，「分離的CaM-KIIN蛋白或多肽」是指CaM-KIIN多肽基本上不含天然與其相關的其它蛋白、脂類、糖類或其它物質。本領域的技術人員能用標準的蛋白質純化技術純化CaM-KIIN蛋白。基本上純的多肽在非還原聚丙烯醯胺凝膠上能產生單一的主帶。
本發明的多肽可以是重組多肽、天然多肽、合成多肽，優選重組多肽。本發明的多肽可以是天然純化的產物，或是化學合成的產物，或使用重組技術從原核或真核宿主(例如，細菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動物細胞)中產生。根據重組生產方案所用的宿主，本發明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本發明的多肽還可包括或不包括起始的甲硫氨酸殘基。
本發明還包括人CaM-KIIN蛋白的片段、衍生物和類似物。如本文所用，術語「片段」、「衍生物」和「類似物」是指基本上保持本發明的天然人CaM-KIIN蛋白相同的生物學功能或活性的多肽。本發明的多肽片段、衍生物或類似物可以是(i)有一個或多個保守或非保守性胺基酸殘基(優選保守性胺基酸殘基)被取代的多肽，而這樣的取代的胺基酸殘基可以是也可以不是由遺傳密碼編碼的，或(ii)在一個或多個胺基酸殘基中具有取代基團的多肽，或(iii)成熟多肽與另一個化合物(比如延長多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的胺基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前導序列或分泌序列或用來純化此多肽的序列或蛋白原序列，或與抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根據本文的教導，這些片段、衍生物和類似物屬於本領域熟練技術人員公知的範圍。
在本發明中，術語「人CaM-KIIN多肽」指具有人CaM-KIIN蛋白活性的SEQ IDNO.2序列的多肽。該術語還包括具有與人CaM-KIIN蛋白相同功能的、SEQ ID NO.2序列的變異形式。這些變異形式包括(但並不限於)若干個(通常為1-20個，更佳地1-10個，最佳地1-5個)胺基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數個(通常為20個以內，較佳地為10個以內，更佳地為5個以內)胺基酸。例如，在本領域中，用性能相近或相似的胺基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數個胺基酸通常也不會改變蛋白質的功能。該術語還包括人CaM-KIIN蛋白的活性片段和活性衍生物。
該多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導突變體、在高或低的嚴緊度條件下能與人CaM-KIIN DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗人CaM-KIIN多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發明還提供了其他多肽，如包含人CaM-KIIN多肽或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長的多肽外，本發明還包括了人CaM-KIIN多肽的可溶性片段。通常，該片段具有人CaM-KIIN多肽序列的至少約10個連續胺基酸，通常至少約30個連續胺基酸，較佳地至少約50個連續胺基酸，最佳地至少約70個連續胺基酸。
發明還提供人CaM-KIIN蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然人CaM-KIIN多肽的差別可以是胺基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導的遺傳變異體。誘導變異體可以通過各種技術得到，如通過輻射或暴露於誘變劑而產生隨機誘變，還可通過定點誘變法或其他已知分子生物學的技術。類似物還包括具有不同於天然L-胺基酸的殘基(如D-胺基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的胺基酸(如β、γ-胺基酸)的類似物。應理解，本發明的多肽並不限於上述例舉的代表性的多肽。
修飾(通常不改變一級結構)形式包括體內或體外的多肽的化學衍生形式如乙醯化或羧基化。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進一步加工步驟中進行糖基化修飾而產生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露於進行糖基化的酶(如哺乳動物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化胺基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優化了溶解性能的多肽。
在本發明中，「人CaM-KIIN蛋白保守性變異多肽」指與SEQ ID NO2的胺基酸序列相比，有至多10個，較佳地至多8個，更佳地至多5個，最佳地至多3個胺基酸被性質相似或相近的胺基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據表1進行胺基酸替換而產生。
表1

本發明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。編碼成熟多肽的編碼區序列可以與SEQ ID NO1所示的編碼區序列相同或者是簡併的變異體。如本文所用，「簡併的變異體」在本發明中是指編碼具有SEQ ID NO2的蛋白質，但與SEQ ID NO1所示的編碼區序列有差別的核酸序列。
編碼SEQ ID NO2的成熟多肽的多核苷酸包括只編碼成熟多肽的編碼序列；成熟多肽的編碼序列和各種附加編碼序列；成熟多肽的編碼序列(和任選的附加編碼序列)以及非編碼序列。
術語「編碼多肽的多核苷酸」可以是包括編碼此多肽的多核苷酸，也可以是還包括附加編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。
本發明還涉及上述多核苷酸的變異體，其編碼與本發明有相同的胺基酸序列的多肽或多肽的片段、類似物和衍生物。此多核苷酸的變異體可以是天然發生的等位變異體或非天然發生的變異體。這些核苷酸變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本領域所知的，等位變異體是一個多核苷酸的替換形式，它可能是一個或多個核苷酸的取代、缺失或插入，但不會從實質上改變其編碼的多肽的功能。
本發明還涉及與上述的序列雜交且兩個序列之間具有至少50％，較佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本發明特別涉及在嚴格條件下與本發明所述多核苷酸可雜交的多核苷酸。在本發明中，「嚴格條件」是指(1)在較低離子強度和較高溫度下的雜交和洗脫，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)雜交時加有變性劑，如50％(v/v)甲醯胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)僅在兩條序列之間的相同性至少在90％以上，更好是95％以上時才發生雜交。並且，可雜交的多核苷酸編碼的多肽與SEQ ID NO2所示的成熟多肽有相同的生物學功能和活性。
本發明還涉及與上述的序列雜交的核酸片段。如本文所用，「核酸片段」的長度至少含15個核苷酸，較好是至少30個核苷酸，更好是至少50個核苷酸，最好是至少100個核苷酸以上。核酸片段可用於核酸的擴增技術(如PCR)以確定和/或分離編碼CaM-KIIN蛋白的多聚核苷酸。
本發明中的多肽和多核苷酸優選以分離的形式提供，更佳地被純化至均質。
本發明的人CaM-KIIN核苷酸全長序列或其片段通常可以用PCR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。對於PCR擴增法，可根據本發明所公開的有關核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設計引物，並用市售的cDNA庫或按本領域技術人員已知的常規方法所製備的cDNA庫作為模板，擴增而得有關序列。當序列較長時，常常需要進行兩次或多次PCR擴增，然後再將各次擴增出的片段按正確次序拼接在一起。
一旦獲得了有關的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關序列。這通常是將其克隆入載體，再轉入細胞，然後通過常規方法從增殖後的宿主細胞中分離得到有關序列。
此外，還可用人工合成的方法來合成有關序列，尤其是片段長度較短時。通常，通過先合成多個小片段，然後再進行連接可獲得序列很長的片段。
目前，已經可以完全通過化學合成來得到編碼本發明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然後可將該DNA序列引入本領域中已知的各種現有的DNA分子(或如載體)和細胞中。此外，還可通過化學合成將突變引入本發明蛋白序列中。
應用PCR技術擴增DNA/RNA的方法(Saiki，et al.Science1985；2301350-1354)被優選用於獲得本發明的基因。特別是很難從文庫中得到全長的cDNA時，可優選使用RACE法(RACE-cDNA末端快速擴增法)，用於PCR的引物可根據本文所公開的本發明的序列信息適當地選擇，並可用常規方法合成。可用常規方法如通過凝膠電泳分離和純化擴增的DNA/RNA片段。
本發明也涉及包含本發明的多核苷酸的載體，以及用本發明的載體或CaM-KIIN蛋白編碼序列經基因工程產生的宿主細胞，以及經重組技術產生本發明所述多肽的方法。
通過常規的重組DNA技術(Science，1984；2241431)，可利用本發明的多聚核苷酸序列可用來表達或生產重組的CaM-KIIN多肽。一般來說有以下步驟(1).用本發明的編碼人CaM-KIIN多肽的多核苷酸(或變異體)，或用含有該多核苷酸的重組表達載體轉化或轉導合適的宿主細胞；(2).在合適的培養基中培養的宿主細胞；(3).從培養基或細胞中分離、純化蛋白質。
本發明中，人CaM-KIIN多核苷酸序列可插入到重組表達載體中。術語「重組表達載體」指本領域熟知的細菌質粒、噬菌體、酵母質粒、植物細胞病毒、哺乳動物細胞病毒如腺病毒、逆轉錄病毒或其他載體。在本發明中適用的載體包括但不限於在細菌中表達的基於T7的表達載體(Rosenberg，et al.Gene，1987，56125)；在哺乳動物細胞中表達的pMSXND表達載體(Lee and Nathans，J Bio Chem2633521，1988)和在昆蟲細胞中表達的來源於杆狀病毒的載體。總之，只要能在宿主體內複製和穩定，任何質粒和載體都可以用。表達載體的一個重要特徵是通常含有複製起點、啟動子、標記基因和翻譯控制元件。
本領域的技術人員熟知的方法能用於構建含人CaM-KIIN編碼DNA序列和合適的轉錄/翻譯控制信號的表達載體。這些方法包括體外重組DNA技術、DNA合成技術、體內重組技術等(Sambroook，et al.Molecular Cloning，a Laboratory Manual，cold Spring Harbor Laboratory.New York，1989)。所述的DNA序列可有效連接到表達載體中的適當啟動子上，以指導mRNA合成。這些啟動子的代表性例子有大腸桿菌的lac或trp啟動子；λ噬菌體PL啟動子；真核啟動子包括CMV立即早期啟動子、HSV胸苷激酶啟動子、早期和晚期SV40啟動子、反轉錄病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核細胞或其病毒中表達的啟動子。表達載體還包括翻譯起始用的核糖體結合位點和轉錄終止子。
此外，表達載體優選地包含一個或多個選擇性標記基因，以提供用於選擇轉化的宿主細胞的表型性狀，如真核細胞培養用的二氫葉酸還原酶、新黴素抗性以及綠色螢光蛋白(GFP)，或用於大腸桿菌的四環素或氨苄青黴素抗性。
包含上述的適當DNA序列以及適當啟動子或者控制序列的載體，可以用於轉化適當的宿主細胞，以使其能夠表達蛋白質。
宿主細胞可以是原核細胞，如細菌細胞；或是低等真核細胞，如酵母細胞；或是高等真核細胞，如哺乳動物細胞。代表性例子有大腸桿菌，鏈黴菌屬；鼠傷寒沙門氏菌的細菌細胞；真菌細胞如酵母；植物細胞；果蠅S2或Sf9的昆蟲細胞；CHO、COS、293細胞、或Bowes黑素瘤細胞的動物細胞等。
本發明的多核苷酸在高等真核細胞中表達時，如果在載體中插入增強子序列時將會使轉錄得到增強。增強子是DNA的順式作用因子，通常大約有10到300個鹼基對，作用於啟動子以增強基因的轉錄。
本領域一般技術人員都清楚如何選擇適當的載體、啟動子、增強子和宿主細胞。
用重組DNA轉化宿主細胞可用本領域技術人員熟知的常規技術進行。當宿主為原核生物如大腸桿菌時，能吸收DNA的感受態細胞可在指數生長期後收穫，用CaCl2法處理，所用的步驟在本領域眾所周知。另一種方法是使用MgCl2。如果需要，轉化也可用電穿孔的方法進行。當宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉染方法磷酸鈣共沉澱法，常規機械方法如顯微注射、電穿孔、脂質體包裝等。
獲得的轉化子可以用常規方法培養，表達本發明的基因所編碼的多肽。根據所用的宿主細胞，培養中所用的培養基可選自各種常規培養基。在適於宿主細胞生長的條件下進行培養。當宿主細胞生長到適當的細胞密度後，用合適的方法(如溫度轉換或化學誘導)誘導選擇的啟動子，將細胞再培養一段時間。
在上面的方法中的重組多肽可在細胞內、或在細胞膜上表達、或分泌到細胞外。如果需要，可利用其物理的、化學的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領域技術人員所熟知的。這些方法的例子包括但並不限於常規的復性處理、用蛋白沉澱劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術及這些方法的結合。
重組的人CaM-KIIN蛋白或多肽有多方面的用途。這些用途包括(但不限於)直接做為藥物治療CaM-KIIN蛋白功能低下或喪失所致的疾病，和用於篩選促進或對抗CaM-KIIN蛋白功能的抗體、多肽或其它配體。用表達的重組人CaM-KIIN蛋白篩選多肽庫可用於尋找有治療價值的能抑制或刺激人CaM-KIIN蛋白功能的多肽分子。
另一方面，本發明還包括對人CaM-KIIN DNA或是其片段編碼的多肽具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。這裡，「特異性」是指抗體能結合於人CaM-KIIN基因產物或片段。較佳地，指那些能與人CaM-KIIN基因產物或片段結合但不識別和結合於其它非相關抗原分子的抗體。本發明中抗體包括那些能夠結合併抑制人CaM-KIIN蛋白的分子，也包括那些並不影響人CaM-KIIN蛋白功能的抗體。本發明還包括那些能與修飾或未經修飾形式的人CaM-KIIN基因產物結合的抗體。
本發明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab′或(Fab)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子；或嵌合抗體，如具有鼠抗體結合特異性但仍保留來自人的抗體部分的抗體。
本發明的抗體可以通過本領域內技術人員已知的各種技術進行製備。例如，純化的人CaM-KIIN基因產物或者其具有抗原性的片段，可被施用於動物以誘導多克隆抗體的產生。與之相似的，表達人CaM-KIIN蛋白或其具有抗原性的片段的細胞可用來免疫動物來生產抗體。本發明的單克隆抗體可以利用雜交瘤技術來製備。本發明的抗體包括能阻斷人CaM-KIIN蛋白功能的抗體以及不影響人CaM-KIIN蛋白功能的抗體。本發明的各類抗體可以利用人CaM-KIIN基因產物的片段或功能區，通過常規免疫技術獲得。這些片段或功能區可以利用重組方法製備或利用多肽合成儀合成。與人CaM-KIIN基因產物的未修飾形式結合的抗體可以用原核細胞(例如E.Coli)中生產的基因產物來免疫動物而產生；與翻譯後修飾形式結合的抗體(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核細胞(例如酵母或昆蟲細胞)中產生的基因產物來免疫動物而獲得。
抗人CaM-KIIN蛋白的抗體可用於免疫組織化學技術中，檢測活檢標本中的人CaM-KIIN蛋白。
本發明中的抗體可用於治療或預防與人CaM-KIIN蛋白相關的疾病。給予適當劑量的抗體可以刺激或阻斷人CaM-KIIN蛋白的產生或活性。
抗體也可用於設計成針對體內某一特殊部位的免疫毒素。如人CaM-KIIN蛋白高親和性的單克隆抗體可與細菌或植物毒素(如白喉毒素，蓖麻蛋白，紅豆鹼等)共價結合。一種通常的方法是用巰基交聯劑如SPDP，攻擊抗體的氨基，通過二硫鍵的交換，將毒素結合於抗體上，這種雜交抗體可用於殺滅人CaM-KIIN蛋白陽性的細胞。
多克隆抗體的生產可用人CaM-KIIN蛋白或多肽免疫動物，如家兔，小鼠，大鼠等。多種佐劑可用於增強免疫反應，包括但不限於弗氏佐劑等。
利用本發明蛋白，通過各種常規篩選方法，可篩選出與CaM-KIIN蛋白發生相互作用的物質，如配體、抑制劑、激動劑或拮抗劑等。
本發明蛋白及其抗體、抑制劑、激動劑、拮抗劑或受體等，當在治療上進行施用(給藥)時，可提供不同的效果。通常，可將這些物質配製於無毒的、惰性的和藥學上可接受的水性載體介質中，其中pH通常約為5-8，較佳地pH約為6-8，儘管pH值可隨被配製物質的性質以及待治療的病症而有所變化。配製好的藥物組合物可以通過常規途徑進行給藥，其中包括(但並不限於)肌內、腹膜內、靜脈內、皮下、皮內、或局部給藥。
本發明的多肽可直接用於疾病治療，例如，用於腫瘤等方面的治療。在使用本發明CaM-KIIN蛋白時，還可同時使用其他治療劑，如IFN-α、IFN-β、TNF-α、TNF-β等。
本發明還提供了一種藥物組合物，它含有安全有效量的本發明CaM-KIIN多肽或其激動劑、拮抗劑以及藥學上可接受的載體或賦形劑。這類載體包括(但並不限於)鹽水、緩衝液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥物製劑應與給藥方式相匹配。本發明的藥物組合物可以被製成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規方法進行製備。諸如片劑和膠囊之類的藥物組合物，可通過常規方法進行製備。藥物組合物如針劑、溶液、片劑和膠囊宜在無菌條件下製造。活性成分的給藥量是治療有效量，例如每天約1微克/千克體重-約5毫克/千克體重。此外，本發明的多肽還可與其他治療劑一起使用。
使用藥物組合物時，是將安全有效量的CaM-KIIN蛋白或其拮抗劑、激動劑施用於哺乳動物，其中該安全有效量通常至少約10微克/千克體重，而且在大多數情況下不超過約8毫克/千克體重，較佳地該劑量是約10微克/千克體重-約1毫克/千克體重。當然，具體劑量還應考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫師技能範圍之內的。
人CaM-KIIN蛋白的多聚核苷酸也可用於多種治療目的。基因治療技術可用於治療由於CaM-KIIN蛋白的無表達或異常/無活性的CaM-KIIN蛋白的表達所致的細胞增殖、發育或代謝異常。重組的基因治療載體(如病毒載體)可設計成表達變異的CaM-KIIN蛋白，以抑制內源性的CaM-KIIN蛋白活性。來源於病毒的表達載體如逆轉錄病毒、腺病毒、腺病毒相關病毒、單純皰疹病毒、細小病毒等可用於將CaM-KIIN基因轉移至細胞內。構建攜帶CaM-KIIN基因的重組病毒載體的方法可見於已有文獻(Sambrook，et al.)。另外重組人CaM-KIIN基因可包裝到脂質體中，然後再轉移至細胞內。
抑制人CaM-KIIN mRNA的寡聚核苷酸(包括反義RNA和DNA)以及核酶也在本發明的範圍之內。核酶是一種能特異性分解特定RNA的酶樣RNA分子，其作用機制是核酶分子與互補的靶RNA特異性雜交後進行核酸內切作用。反義的RNA和DNA及核酶可用已有的任何RNA或DNA合成技術獲得，如固相磷酸醯胺化學合成法合成寡核苷酸的技術已廣泛應用。反義RNA分子可通過編碼該RNA的DNA序列在體外或體內轉錄獲得。這種DNA序列已整合到載體的RNA聚合酶啟動子的下遊。為了增加核酸分子的穩定性，可用多種方法對其進行修飾，如增加兩側的序列長度，核糖核苷之間的連接應用磷酸硫酯鍵或肽鍵而非磷酸二酯鍵。
多聚核苷酸導入組織或細胞內的方法包括將多聚核苷酸直接注入到體內組織中；或在體外通過載體(如病毒、噬菌體或質粒等)先將多聚核苷酸導入細胞中，再將細胞移植到體內等。
能與人CaM-KIIN蛋白結合的多肽分子可通過篩選由各種可能組合的胺基酸結合於固相物組成的隨機多肽庫而獲得。篩選時，必須對人CaM-KIIN蛋白分子進行標記。
本發明還涉及定量和定位檢測人CaM-KIIN蛋白水平的診斷試驗方法。這些試驗是本領域所熟知的，且包括FISH測定和放射免疫測定。試驗中所檢測的人CaM-KIIN蛋白水平，可以用作解釋人CaM-KIIN蛋白在各種疾病中的重要性和用於診斷CaM-KIIN蛋白起作用的疾病。
一種檢測檢測樣品中是否存在CaM-KIIN蛋白的方法是利用CaM-KIIN蛋白的特異性抗體進行檢測，它包括將樣品與CaM-KIIN蛋白特異性抗體接觸；觀察是否形成抗體複合物，形成了抗體複合物就表示樣品中存在CaM-KIIN蛋白。
CaM-KIIN蛋白的多聚核苷酸可用於CaM-KIIN蛋白相關疾病的診斷和治療。在診斷方面，CaM-KIIN蛋白的多聚核苷酸可用於檢測CaM-KIIN蛋白的表達與否或在疾病狀態下CaM-KIIN蛋白的異常表達。如CaM-KIINDNA序列可用於對活檢標本的雜交以判斷CaM-KIIN蛋白的表達異常。雜交技術包括Southern印跡法，Northern印跡法、原位雜交等。這些技術方法都是公開的成熟技術，相關的試劑盒都可從商業途徑得到。本發明的多核苷酸的一部分或全部可作為探針固定在微陣列(microarray)或DNA晶片(又稱為「基因晶片」)上，用於分析組織中基因的差異表達分析和基因診斷。用CaM-KIIN蛋白特異的引物進行RNA-聚合酶鏈反應(RT-PCR)體外擴增也可檢測CaM-KIIN蛋白的轉錄產物。
檢測CaM-KIIN基因的突變也可用於診斷CaM-KIIN蛋白相關的疾病。CaM-KIIN蛋白突變的形式包括與正常野生型CaM-KIIN DNA序列相比的點突變、易位、缺失、重組和其它任何異常等。可用已有的技術如Southern印跡法、DNA序列分析、PCR和原位雜交檢測突變。另外，突變有可能影響蛋白的表達，因此用Northern印跡法、Western印跡法可間接判斷基因有無突變。
本發明的序列對染色體鑑定也是有價值的。簡而言之，根據本發明CaM-KIIN蛋白的cDNA製備PCR引物(優選15-35bp)，可以將序列定位於染色體上。然後，將這些引物用於PCR篩選含各條人染色體的體細胞雜合細胞。只有那些含有相應於引物的人基因的雜合細胞會產生擴增的片段。
一旦序列被定位到準確的染色體位置，此序列在染色體上的物理位置就可以與基因圖數據相關聯。這些數據可見於例如，V.Mckusick，Mendelian Inheritancein Man(可通過與Johns Hopkins University Welch Medical Library聯機獲得)。然後可通過連鎖分析，確定基因與業已定位到染色體區域上的疾病之間的關係。
在本發明的一個實例中，提供了一種分離的多核苷酸，它編碼具有SEQ ID NO2所示胺基酸序列的多肽。本發明的多核苷酸是從人樹突狀細胞cDNA文庫中分離出的。其序列如SEQ ID NO1所示，它包含的多核苷酸序列全長為591個鹼基，其開放讀框位於179-415位，編碼全長為79個胺基酸的人CaM-KIIN蛋白(SEQ IDNO2)。該CaM-KIIN蛋白屬於鈣離子/鈣調蛋白依賴性蛋白激酶II抑制性蛋白家族分子，與大鼠來源的鈣離子/鈣調蛋白依賴性蛋白激酶II抑制性蛋白alpha(CaM-KIIN alpha)和鈣離子/鈣調蛋白依賴性蛋白激酶II抑制性蛋白beta(CaM-KIIN beta)胺基酸序列高度同源，其中與CaM-KIIN beta一致性和相似性可高達98％，與CaM-KIIN alpha一致性為65％，相似性則為78％。人CaM-KIIN蛋白質分子量為8.6kDa，等電點5.16。RT-PCR分析表明，CaM-KIIN在某些腫瘤細胞中有表達，同時在非成熟、成熟以及經抗原KLH刺激的外周血單核細胞來源的樹突狀細胞中存在不同程度的表達。Northern印跡分析表明在腎臟、肝臟、心臟、骨骼肌和胎盤等組織中，以及HeLa細胞S3、MOLT-4、Raji和K-562細胞系中具有特定表達。細胞生長實驗證實CaM-KIIN能夠阻遏細胞增殖，具有細胞生長抑制活性。已進行的研究提示，CaM-KIIN可能與其他抑制劑一樣可以通過特異性結合CaMK II，阻止CaMK II的磷酸化激活，調控多種生理和病理活動，發揮重要作用，並可能在抗感染、抗炎症反應、抗腫瘤以及神經生長修復、免疫功能調節等多個領域的免疫診斷和免疫治療方面具有重要的開發和應用價值。因此，CaM-KIIN蛋白或其相關的拮抗劑、激動劑等可為治療腫瘤、炎症、神經系統和心血管病等疾病提供新的免疫診斷和靶向治療途徑，因而具有巨大的應用前景。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkCold SpringHarbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。
實施例1人CaM-KIIN cDNA的克隆用Trizol試劑(Life Technologies公司)提取人樹突狀細胞總RNA。然後，從總RNA中分離poly(A)mRNA。將poly(A)mRNA經逆轉錄形成cDNA後，用SuperScriptII克隆試劑盒(購自Gibco)將cDNA片段定向插入到載體的多克隆位點上，轉化DH5α細菌形成cDNA質粒文庫。用雙脫氧法測定隨機挑選克隆的5′末端的序列。將測定的cDNA序列與已有的公共DNA序列資料庫進行比較，結果發現有一個cDNA克隆的DNA序列為新的全長cDNA。通過合成一系列引物對新克隆所含的DNA序列進行雙向測定。計算機分析表明，克隆所含的全長cDNA是一個新的cDNA序列(如SEQ ID NO1所示)，編碼一個新的蛋白質(如SEQ ID NO2所示)。此蛋白質被命名為人鈣離子/鈣調蛋白依賴性蛋白激酶II抑制性蛋白(Calcium/Calmodulin-Dependent Protein Kinase II Inhibitor，CaM-KIIN)，其編碼基因命名為人鈣離子/鈣調蛋白依賴性蛋白激酶II抑制性蛋白基因，即CaM-KIIN基因。
CaM-KIIN的序列SEQ ID NO1全長為591bp(圖1)，包括178bp的5′端非編碼區和173bp的3′端非編碼區，編碼區為179-415位，編碼含79個胺基酸的多肽(圖2)。理論上計算未糖基化的成熟分子的分子量約為8.6kD。
BLAST分析表明其與大鼠來源的鈣離子/鈣調蛋白依賴性蛋白激酶II抑制性蛋白CaM-KIIN beta高度同源，一致性和相似性可高達98％(圖3)；與大鼠來源的鈣離子/鈣調蛋白依賴性蛋白激酶II抑制性蛋白CaM-KIIN alpha一致性為65％，相似性則為78％(圖3)。這編碼人CaM-KIIN屬於鈣離子/鈣調蛋白依賴性蛋白激酶II抑制性蛋白家族分子。
實施例2用RT-PCR方法獲得人CaM-KIIN編碼序列及對細胞表達的分析(1)用RT-PCR方法獲得人CaM-KIIN編碼序列用Trizol試劑提取處於對數生長期相應細胞系、人外周血單核細胞及經LPS刺激不同時間的人外周血單核細胞來源的樹突狀細胞總RNA，取5μg細胞總RNA與1μg Oligo-dT12-18混合，進行反轉錄。反轉錄體系為20μl，反應結束後加80μl ddH2O進行稀釋。PCR擴增CaM-KIIN所用的引物如下有義引物5′ATGTCCGAGATCCTGCCCTA(SEQ ID NO3)，反義引物5′TGGTGCTGAAGCGGACAGCT(SEQID NO4)，同時以β-肌動蛋白作為陽性對照。PCR反應體積為50μl，其中含反轉錄模板10μl、0.5mM引物、0.2mM dNTP和1U rTaq DNA聚合酶(Takara Inc.)，擴增參數為95℃ 15秒、57℃ 30秒、72℃ 30秒，28個循環後PCR產物行1.5％瓊脂糖凝膠電泳初步確認。對擴增產物的DNA序列進行測序，結果表明該PCR產物的編碼DNA序列與SEQ ID NO1所示的179-591完全相同。
(2)用RT-PCR方法對CaM-KIIN細胞表達的分析取不同組織和細胞，按上述相同反應條件進行RT-PCR，獲得人CaM-KIINRT-PCR表達分析圖譜(圖4)。結果提示。CaM-KIIN表達於某些腫瘤細胞中，如MCF-7、A172、HeLa、SMMC7721、PC-3、A549、THP-1、U937、Jurkat、Raji、Daudi細胞系；在人外周血單核細胞來源的樹突狀細胞成熟並受KLH刺激的活化過程中具有一定的表達模式；在人外周血來源的T、B細胞中未見表達。
實施例3人CaM-KIIN的Northern印跡分析按如下常規方法進行Northern印跡待檢濾膜置於10ml經68℃預熱的雜交液，在雜交爐(Bellco)中於68℃預雜交30分鐘；將標記好的cDNA探針於95～100℃變性2～5分鐘，置冰上迅速冷卻後加入雜交液(cDNA探針終濃度為2～10ng/ml或1～2×106cpm/ml)，充分混勻，於68℃雜交2小時。雜交結束後，濾膜用2×SSC、0.05％SDS室溫淋洗數次，繼振蕩衝洗30～40分鐘，其間更換洗液數次。隨後用0.1×SSC、0.1％SDS於50℃振蕩衝洗20～40分鐘。最後濾膜用塑料保鮮膜包裹，於-70℃曝光X線膠片24～48小時。
Northern印跡雜交結果顯示在腎臟、肝臟、心臟、骨骼肌和胎盤(5.2kb)中，以及腦(1.65kb)等許多正常組織中有不同程度表達；在HeLa細胞S3、淋巴母細胞白血病MOLT-4、Burkitt淋巴瘤Raji和慢性髓系白血病K-562細胞系(5.2kb)中，以及HeLa cell S3和Burkitt淋巴瘤Raji(1.65kb)等腫瘤細胞系中有不同程度的表達(圖5)。這表明CaM-KIIN蛋白是一種特定表達的蛋白。
實施例4CaM-KIIN的細胞生長抑制活性將含全長CaM-KIIN的質粒DNA以LipofectAMINE試劑(Life Technologies公司)轉染LoVo細胞，以未轉染組做為空白對照組(control)，以pcDNA3.1質粒載體作為模擬對照組(mock)。轉染後24、48和72小時進行鏡下觀察在鏡下觀察細胞生長狀態並拍照。
結果如圖6所示，轉染24小時後LoVo細胞表現為伸展較差，細胞發生皺縮，胞漿內的顆粒增多；轉染48小時後，細胞貼壁不牢，大量的細胞懸浮且有很多死細胞出現；轉染72小時後，可見有大量的LoVo細胞死亡，存活的LoVo細胞極少且形態非常不規則。空白對照組和模擬對照組細胞轉染前後在形態上沒有顯著差異。這表明，CaM-KIIN對細胞生長有抑制活性。
實施例5CaM-KIIN的細胞生長抑制活性檢測如實施例4，將含全長CaM-KIIN的質粒DNA以LipofectAMINE試劑(LifeTechnologies公司)轉染HeLa細胞和LoVo細胞，以未轉染組做為空白對照組(control)，以pcDNA3.1質粒載體作為模擬對照組(mock)。轉染後0、24、48和72小時進行細胞增殖的MTT檢測(噻唑南比色法檢測)，結果表示為OD值對時間的曲線。
結果如圖7A和7B所示，轉染人全長CaM-KIIN cDNA後，LoVo細胞的增殖曲線比空白對照組和模擬對照組顯著降低。LoVo細胞在轉染24小時後增殖曲線即呈明顯下降趨勢，48小時後實驗組的細胞數大約是空白對照組和模擬對照組的一半，72小時後又僅為1/3。LoVo細胞空白對照組和模擬對照組的增殖曲線沒有顯著差異。HeLa細胞在轉染人全長CaM-KIIN cDNA前、後沒有明顯變化。
實施例6CaM-KIIN的重組表達在該實施例中，以實施例2中獲得的RT-PCR擴增產物為模板，用序列如下的5』和3』端的PCR寡核苷酸引物進行擴增，獲得人CaM-KIIN DNA作為插入片段。
PCR反應中使用的5』端寡核苷酸引物序列為5』-ACGAATTCCCATGTCCGAGATCCTGC-3』(SEQ ID NO5)該引物含有EcoR I限制性內切酶的酶切位點，在該酶切位點之後是人CaM-KIIN的部分編碼序列；3』端引物序列為5』-ACGAATTCGCACTCCGGACGGCGGCT-3』(SEQ ID NO6)該引物含有EcoR I限制性內切酶的酶切位點和人CaM-KIIN的部分編碼序列。
將獲得的PCR產物純化後經EcoRI酶切再與質粒pGEM-3ZF按常規方法重組並轉化至感受態大腸桿菌BL21，挑取陽性克隆鑑定後純化並測序(ABI公司的377型測序儀，BigDye Terminator試劑盒，PE公司)。將正確序列的人CaM-KIIN cDNAEcoR I酶切片段克隆至表達載體pGEX-2T(Pharmacia公司)，形成形成載體pGEX-2T-人CaM-KIIN，然後轉化大腸桿菌BL21。陽性克隆用EcoRI酶切鑑定，正向克隆用BamH I酶切鑑定，產物行0.8％瓊脂糖凝膠電泳分析。經測序證實，已插入了所設計的CaM-KIIN編碼序列。
挑表達CaM-KIIN的陽性BL21克隆接種於100ml 2×YTA培養基中，37℃ 300rpm振蕩培養12-15hr，1∶10稀釋於預熱的2×YTA培養基繼續振蕩培養1.5hr，加100mMIPTG至0.1mM後30℃誘導2-6hr，5,000g 4℃離心10min去上清，置冰上用50ml 1×PBS(0.14M NaCl，2.7mM KCl，10.1mM Na2HPO4，1.8mM KH2PO4，pH7.3)重懸，超聲(B.Braun Labsonic U)破碎後再加入20％Triton X-100至1％輕搖30min，然後12,000g 4℃離心10min，上清用0.8μm濾膜過濾後，過1ml 50％穀胱甘肽Sepharose 4B層析柱，1×PBS充分洗滌後，加入500ul穀胱甘肽洗脫緩衝液(10mM穀胱甘肽，50mM Tris-HCl，pH8.0)室溫靜置30分鐘後收集洗脫液，重複洗脫2-3次，得到人CaM-KIIN蛋白。
用Edams水解法進行N-端胺基酸序列分析，結果N-端10個胺基酸與SEQ IDNO2所示的N-端10個胺基酸殘基完全相同。
實施例7抗CaM-KIIN抗體的製備將實施例6中獲得的重組蛋白人CaM-KIIN用來免疫動物以產生抗體，具體方法如下。重組分子用層析法進行分離後備用。也可用SDS-PAGE凝膠電泳法進行分離，將電泳條帶從凝膠中切下，並用等體積的完全Freund’s佐劑乳化。用50-100μg/0.2ml乳化過的蛋白，對小鼠進行腹膜內注射。14天後，用非完全Freund’s佐劑乳化的同樣抗原，對小鼠以50-100μg/0.2ml的劑量進行腹膜內注射以加強免疫。每隔14天進行一次加強免疫，至少進行三次。獲得的抗血清的特異反應活性用它在體外沉澱人CaM-KIIN基因翻譯產物的能力加以評估。結果發現，抗體可特異性地與本發明蛋白發生結合。
在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之後，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申請所附權利要求書所限定的範圍。
序列表110第二軍醫大學免疫學研究所120人鈣離子/鈣調蛋白依賴性蛋白激酶II抑制性蛋白及用途1300137281606170PatentIn version 3.02101211591212DNA213Homo sapiens220221CDS222(179)..(415)4001cggcccggga ggcggaggcg cgggggagga ggccccgctt ggctcctcag ccccggatgc 60tgcatgactt catccttccg ccggctcccc tgctgaggta gggccggtcc ggcagcaagc120ccgccgcccg cgccccgccg cagtcccgct cccgccccgc gcccaccccg cgcccgcc 178atg tcc gag atc ctg ccc tac agc gaa gac aag atg ggc cgc ttc ggc 226Met Ser Glu Ile Leu Pro Tyr Ser Glu Asp Lys Met Gly Arg Phe Gly1 5 10 15gca gac ccc gag ggc tcc gac ctc tcc ttc agc tgc cgc ctg cag gac 274Ala Asp Pro Glu Gly Ser Asp Leu Ser Phe Ser Cys Arg Leu Gln Asp20 25 30acc aac tcc ttc ttc gcg ggc aac cag gcc aag cga ccc ccc aag ctg 322Thr Asn Ser Phe Phe Ala Gly Asn Gln Ala Lys Arg Pro Pro Lys Leu35 40 45ggc cag atc ggc cga gcc aag cga gtg gtg atc gag gat gac cgg ata 370Gly Gln Ile Gly Arg Ala Lys Arg Val Val Ile Glu Asp Asp Arg Ile50 55 60gac gac gtg ctg aag ggg atg ggg gag aag ccg ccg tcc gga gtg 415Asp Asp Val Leu Lys Gly Met Gly Glu Lys Pro Pro Ser Gly Val65 70 75tagacgcgcc ggctcgggcg gcgggctccg ggcccagcct cgcagcggcc aggagcgcgg475gccggcgatg cggctgccgg cgcccccccg ccccggccca ggcgcccgcg ggcgggggct535gcagggccgt gccgccgccg ccgccaggca ctccggagct gtccgcttca gcacca591210221179212PRT213Homo sapiens4002Met Ser Glu Ile Leu Pro Tyr Ser Glu Asp Lys Met Gly Arg Phe Gly1 5 10 15Ala Asp Pro Glu Gly Ser Asp Leu Ser Phe Ser Cys Arg Leu Gln Asp20 25 30Thr Asn Ser Phe Phe Ala Gly Asn Gln Ala Lys Arg Pro Pro Lys Leu35 40 45Gly Gln Ile Gly Arg Ala Lys Arg Val Val Ile Glu Asp Asp Arg Ile50 55 60Asp Asp Val Leu Lys Gly Met Gly Glu Lys Pro Pro Ser Gly Val65 70 75210321120212DNA213合成的寡核苷酸4003atgtccgaga tcctgcccta20210421120212DNA213合成的寡核苷酸4004tggtgctgaa gcggacagct 20210521126212DNA213合成的寡核苷酸4005acgaattccc atgtccgaga tcctgc 26210621126212DNA213合成的寡核苷酸4006acgaattcgc actccggacg gcggct 2權利要求
1.一種分離的人CaM～KIIN多肽，其特徵在於，它包含具有SEQ ID NO2胺基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。
2.如權利要求1所述的多肽，其特徵在於，該多肽是具有SEQ ID NO2胺基酸序列的多肽。
3.一種分離的多核苷酸，其特徵在於，它包含一核苷酸序列，該核苷酸序列與選自下組的一種核苷酸序列有至少80％相同性(a)編碼如權利要求1和2所述多肽的多核苷酸；(b)與多核苷酸(a)互補的多核苷酸。
4.如權利要求3所述的多核苷酸，其特徵在於，該多核苷酸編碼具有SEQ ID NO2所示胺基酸序列的多肽。
5.如權利要求3所述的多核苷酸，其特徵在於，該多核苷酸的序列選自下組的一種(a)具有SEQ ID NO1中179-415位的序列；(b)具有SEQ ID NO1中1-591位的序列。
6.一種載體，其特徵在於，它含有權利要求3所述的多核苷酸。
7.一種遺傳工程化的宿主細胞，其特徵在於，它含有權利要求6所述的載體。
8.一種具有人CaM-KIIN多肽活性的多肽的製備方法，其特徵在於，該方法包含(a)在適合表達人CaM-KIIN多肽的條件下，培養權利要求7所述的宿主細胞；(b)從培養物中分離出具有人CaM-KIIN多肽活性的多肽。
9.一種能與權利要求1所述的人CaM-KIIN多肽特異性結合的抗體。
10.一種藥物組合物，其特徵在於，它含有安全有效量的權利要求1所述的多肽以及藥學上可接受的載體。
全文摘要
本發明涉及了一種新型鈣離子/鈣調蛋白依賴性蛋白激酶II抑制性蛋白(Calcium/Calmodulin－DependentProtein Kinase II Inhibitor，CaM－KIIN)。本發明提供編碼此蛋白分子的多核苷酸和經重組技術產生這種蛋白分子的方法。本發明還公開了這種新型鈣離子/鈣調蛋白依賴性蛋白激酶II抑制性蛋白及其編碼序列的用途。本發明還證實了CaM－KIIN能夠抑制細胞生長。本發明還公開了抗此蛋白分子用於疾病的診斷及治療的策略，特別是可用於癌症治療。
文檔編號C12N15/10GK1394873SQ0111335
公開日2003年2月5日 申請日期2001年7月11日 優先權日2001年7月11日
發明者李楠, 章衛平, 張君, 曹雪濤 申請人:第二軍醫大學免疫學研究所