一種發酵乳製品中乳酸菌的檢測方法

2023-05-09 21:35:46

一種發酵乳製品中乳酸菌的檢測方法
【專利摘要】本發明涉及一種發酵乳製品中乳酸菌的檢測方法。該檢測方法包括以下步驟：先對樣品進行細菌培養，再對培養菌落進行革蘭氏染色，並在顯微鏡下觀察細菌形態，然後製備菌懸液，離心，製備待測樣品溶液，再進行DNA提取，最後進行PCR擴增及電泳檢測，觀察檢測結果，若電泳檢測出現唯一一條PCR擴增條帶，判斷為陽性，若出現了該條帶的同時也出現了其他條帶，判斷為陰性，且繼續對PCR擴增產物進行illuminagenomeanalyzer測序，測得序列登陸NCBI主頁進行BLAST對比分析。本發明先行革蘭氏染色及生物顯微鏡觀察，可對樣品中乳酸菌進行初步篩選與分離鑑定，再採用PCR擴增及凝膠電泳從分子水平上對乳酸菌鑑定其種屬，檢測結果準確。
【專利說明】 一種發酵乳製品中乳酸菌的檢測方法
[0001]

【技術領域】
[0002]本發明屬於食品檢測領域，具體涉及一種發酵乳製品中乳酸菌的檢測方法。

【背景技術】
[0003]凡能發酵碳水化合物產物乳酸的細菌統稱為乳酸菌，乳酸菌是一種革蘭氏陽性菌，根據其種系進化過程中形成的不同生化指標可將其分為:低GC含量組，如乳酸桿菌屬、腸球菌屬及乳酸球菌屬等，高GC含量的雙歧桿菌，這些菌種形態結構、代謝特徵及生理學特點等均不這完全相同。人類及其他動物體內如腸道、陰道黏膜等部位均天然存在著乳酸菌。乳酸菌可幫助調節腸道微生物平衡，促進營養吸收，可改善肝功能，防止乳糖不耐症，還有抗癌及抗衰老等作用。將乳酸菌用於食品中，可提高食品附加值及保藏性。正因為乳酸菌的上述優點，目前，乳酸菌已作為益生菌在乳製品中廣泛添加，同時，也廣泛用於藥品領域中。此外，乳酸菌在工業領域中也有廣泛應用，如用其發酵產生蘋果酸及乳酸來釀造蘋果酒及葡萄酒。
[0004]雖然乳酸菌在生活各大領域中均有廣泛應用，但隨著食物種類的增多，乳酸菌應用也帶來了一系列的安全問題，其質量問題也日益嚴重化與多樣化。目前，市場上發酵乳製品種類繁多，且均宣稱含有多種乳酸菌，給消費者的選擇及相關部門的質量監督均帶來較大困難。因此，對食品尤其是發酵乳製品中的乳酸菌種類進行定性檢測以更好的對發酵乳製品進行質量管理，保障消費者的權利具有重要意義。
[0005]乳酸菌的傳統定性檢測方法採用生理生化反應及選擇性培養基進行分離培養計數，但這些方法易受培養條件及菌種特性等多種主客觀因素的影響，檢測過程費時長，檢測結果穩定性及可靠性均較差，因此，將其用於市售發酵乳製品的大樣本隨機抽查具有較大的局限性。


【發明內容】

[0006]本發明的目的就是針對上述現有技術中存在的缺陷提供一種一種發酵乳製品中乳酸菌的檢測方法。
[0007]本發明的技術方案如下:
一種發酵乳製品中乳酸菌的檢測方法，包括以下步驟:
(1)細菌培養:取5-10ml樣品加入10-20ml滅菌水中稀釋震蕩混勻，平板塗片於MRS培養基中，恆溫培養12-24h,取樣品菌落；
(2)取步驟(I)中取的菌落進行革蘭氏染色，並在顯微鏡下觀察細菌形態；
(3)將步驟(I)中的菌落加入10-20mlPBS緩衝液中，製成菌懸液，將菌懸液取1.5ml加入離心管中，加入等體積的氯仿，混勻2-5min，離心，取上清液，加無菌水或TE緩衝液500-700ul混勻重懸，離心，取上清液作為待測樣品溶液； (4)DNA提取:取步驟(3)中製得的待測樣品溶液至另一離心管中，採用酚氯仿抽提2次，加入0.1倍體積的醋酸鈉及I倍體積的異丙醇沉澱DNA，再採用體積濃度為70%-80%的乙醇溶液洗滌沉澱2次，自然乾燥，加雙蒸水溶解，得樣品DNA模板；
(5)PCR擴增:將步驟(4)中提取的DNA模板進行DNA擴增，PCR反應體系各組分為: 模板 DNA2.0ul;
引物對2.5ul;
10 X Taq Buffer (Mg2+ plus)2.5ul;
Dntp Mixture2.0ul;
TaKaRa Taq(5U/UL)0.125ul
無菌離子水加至25ul;
PCR擴增程序為:
94°C變性 5min，94°C 30s, 52°C 45s, 72°C 1.5min，循環 30 次，最後 72°C退火 1min ;
(6)對步驟(5)中PCR擴增產物進行瓊脂凝膠電泳檢測，觀察檢測結果。
[0008]步驟(I)中MRS培養基的組分為:葡萄糖20g，牛肉膏20g，瓊脂15g，蛋白腖10g，酵母提取物5g、乙酸鈉5g、檸檬酸二銨2g，磷酸氫二鉀2g，硫酸錳水合物0.8-lg，加蒸餾水至1L，加PH調節劑至PH為6.2-6.5，高壓滅菌備用。
[0009]優選的，所述的硫酸錳水合物為硫酸錳的硫酸錳四水合物與硫酸錳七水合物的混合物。
[0010]優選的，所述的硫酸錳四水合物與硫酸錳七水合物的質量比為(0.8-1.2 ):(0.6-1.0)。
[0011]優選的，所述的PH調節劑選自硫酸、鹽酸、氫氧化鈉或氫氧化鉀中的一種或多種。
[0012]優選的，步驟(I)中所述的恆溫培養溫度為35_40°C。
[0013]優選的,步驟(3)中所述的離心速度為8000-10000r/min,離心時間為5-lOmin。
[0014]優選的，步驟(4)中所述的DNA提取液PH為7.8-8.2，其組成為:80-100mol/L的Tris-HCl, 80-100mol/L 的 EDTA，80-1OOmmoI/L 的磷酸鈉，1.0-1.5mol/L 的氯化鈉，0.5-1%的 CTAB。
[0015]步驟(5 )中PCR擴增採用的的引物對為:上下遊引物:
F(WLABl):5』-TCCGGKTTTATTGGGCGTAAAGCGA-3』 ；
R(WLAB2):5』-TCGAATTAAACCACATGCTCCA-3』。
[0016]步驟(2)中乳酸菌鏡下形態為杆狀或球狀，革蘭氏陽性菌。
[0017]步驟(6)中的結果觀察具體為:電泳檢測出現唯一一條PCR擴增條帶，判斷為陽性，若出現了該條帶的同時也出現了其他條帶，判斷為陰性，此時對PCR擴增產物進行iIlumina genome analyzer測序,測得序列登陸NCBI主頁進行BLAST對比分析。
[0018]本發明與現有技術相比，具有以下有益效果:
1.本發明先將樣品進行稀釋後，平板塗片於MRS培養基中進行恆溫培養，對培養後的菌落進行革蘭氏染色及生物顯微鏡觀察，以對樣品中乳酸菌進行初步篩選與分離鑑定。
[0019]2.目前，國內外允許食品中添加的乳酸菌為雙歧桿菌、乳桿菌、乳球菌等，本發明先採用細菌培養及顯微鏡觀察對樣品乳酸菌進行初步篩選，再採用PCR擴增及凝膠電泳從分子水平上對乳酸菌鑑定其種屬，從而判斷樣品中乳酸菌種屬是否為正常添加。
[0020]3.本發明在傳統的菌落特徵等菌體自身特製備待測樣品溶液時，先製備菌懸液，經多次離心、重懸，可將樣品中乳酸菌更好的提取，從而保證了後續DNA提取及PCR擴增等操作的準確性。

【具體實施方式】
[0021]本發明通過以下具體實施例更詳細的說明本發明，可以使本專業技術人員更全面的了解本發明，但不以任何方式限制本發明。
[0022]實施例1
一種發酵乳製品中乳酸菌的檢測方法，包括以下步驟:
(1)細菌培養:取5ml樣品加入10-20ml滅菌水中稀釋震蕩混勻，平板塗片於MRS培養基中，35°C恆溫培養12h，取樣品菌落；
(2)取步驟(I)中取的菌落進行革蘭氏染色，並在顯微鏡下觀察細菌形態；
(3)將步驟(I)中的菌落加入1mlPBS緩衝液中，製成菌懸液，將菌懸液取1.5ml加入離心管中，加入等體積的氯仿，混勻2min,離心，以8000r/min離心5min,取上清液，加無菌水或TE緩衝液500ul混勻重懸，離心，以8000r/min離心5min，取上清液作為待測樣品溶液；
(4)DNA提取:取步驟(3)中製得的待測樣品溶液至另一離心管中，採用酚氯仿抽提2次，加入0.1倍體積的醋酸鈉及I倍體積的異丙醇沉澱DNA，再採用體積濃度為70%的乙醇溶液洗滌沉澱2次，自然乾燥，加雙蒸水溶解，得樣品DNA模板；
(5)PCR擴增:將步驟(4)中提取的DNA模板進行DNA擴增，採用的引物對為:上下遊引物:
F(WLABl):5』-TCCGGKTTTATTGGGCGTAAAGCGA-3』 ；
R(WLAB2):5』-TCGAATTAAACCACATGCTCCA-3』 ；
(6)對步驟(5)中PCR擴增產物進行瓊脂凝膠電泳檢測，觀察檢測結果。
[0023]步驟(I)中MRS培養基的組分為:葡萄糖20g，牛肉膏20g，瓊脂15g，蛋白腖10g，酵母提取物5g、乙酸鈉5g、檸檬酸二銨2g，磷酸氫二鉀2g，硫酸錳水合物0.8g，加蒸餾水至1L,加硫酸至PH為6.2，高壓滅菌備用。
[0024]所述的硫酸錳水合物為硫酸錳的硫酸錳四水合物與硫酸錳七水合物的混合物，所述的硫酸錳四水合物與硫酸錳七水合物的質量比為0.8: 0.6。
[0025]步驟(4)中所述的DNA提取液PH為7.8-8.2，其組成為:80mol/L的Tris-HCl, 80mol/L 的 EDTA，80mmol/L 的磷酸鈉，1.0moI/L 的氯化鈉，0.5% 的 CTAB。
[0026]觀察步驟(6)中的電泳檢測結果。
[0027]實施例2
一種發酵乳製品中乳酸菌的檢測方法，包括以下步驟:
(1)細菌培養:取1ml樣品加入20ml滅菌水中稀釋震蕩混勻，平板塗片於MRS培養基中，40°C下恆溫培養24h，取樣品菌落；
(2)取步驟(I)中取的菌落進行革蘭氏染色，並在顯微鏡下觀察細菌形態；
(3)將步驟(I)中的菌落加入20mlPBS緩衝液中，製成菌懸液，將菌懸液取1.5ml加入離心管中，加入等體積的氯仿，混勻5min，離心，離心速度為10000r/min，離心時間為lOmin，取上清液，加無菌水或TE緩衝液700ul混勻重懸，離心，離心速度為10000r/min，離心時間為lOmin，取上清液作為待測樣品溶液；
(4)DNA提取:取步驟(3)中製得的待測樣品溶液至另一離心管中，採用酚氯仿抽提2次，加入0.1倍體積的醋酸鈉及I倍體積的異丙醇沉澱DNA，再採用體積濃度為80%的乙醇溶液洗滌沉澱2次，自然乾燥，加雙蒸水溶解，得樣品DNA模板；
(5)PCR擴增:將步驟(4)中提取的DNA模板進行DNA擴增，PCR擴增採用的的引物對為:上下遊引物:
F(WLABl):5』-TCCGGKTTTATTGGGCGTAAAGCGA-3』 ；
R(WLAB2):5』-TCGAATTAAACCACATGCTCCA-3』 ；
(6)對步驟(5)中PCR擴增產物進行瓊脂凝膠電泳檢測，觀察檢測結果。
[0028]步驟(I)中MRS培養基的組分為:葡萄糖20g，牛肉膏20g，瓊脂15g，蛋白腖10g，酵母提取物5g、乙酸鈉5g、檸檬酸二銨2g，磷酸氫二鉀2g，硫酸錳水合物0.8-lg，加蒸餾水至1L，加鹽酸調至PH為6.2-6.5，高壓滅菌備用。
[0029]步驟(4)中所述的DNA提取液PH為8.2，其組成為:100mol/L的Tris-HCl，10moI/L 的 EDTA，10mmoI/L 的磷酸鈉，1.5mol/L 的氯化鈉，1% 的 CTAB。
[0030]觀察步驟(6 )中的電泳檢測結果。
[0031]實施例3
一種發酵乳製品中乳酸菌的檢測方法，包括以下步驟:
(1)細菌培養:取8ml樣品加入15ml滅菌水中稀釋震蕩混勻，平板塗片於MRS培養基中，38°C下恆溫培養18h,取樣品菌落；
(2)取步驟(I)中取的菌落進行革蘭氏染色，並在顯微鏡下觀察細菌形態；
(3)將步驟(I)中的菌落加入15mlPBS緩衝液中，製成菌懸液，將菌懸液取1.5ml加入離心管中，加入等體積的氯仿，混勻3min，離心，離心速度為9000r/min，離心時間為8min，取上清液，加無菌水或TE緩衝液600ul混勻重懸，離心，離心速度為9000r/min，離心時間為8min,取上清液作為待測樣品溶液；
(4)DNA提取:取步驟(3)中製得的待測樣品溶液至另一離心管中，採用酚氯仿抽提2次，加入0.1倍體積的醋酸鈉及I倍體積的異丙醇沉澱DNA，再採用體積濃度為75%的乙醇溶液洗滌沉澱2次，自然乾燥，加雙蒸水溶解，得樣品DNA模板；
(5 ) PCR擴增:將步驟(4 )中提取的DNA模板進行DNA擴增，PCR擴增採用的的引物對為:上下遊引物:
F(WLABl):5』-TCCGGKTTTATTGGGCGTAAAGCGA-3』 ；
R(WLAB2):5』-TCGAATTAAACCACATGCTCCA-3』 ;
(6)對步驟(5)中PCR擴增產物進行瓊脂凝膠電泳檢測，觀察檢測結果。
[0032]2.根據權利要求1所述的所述的一種發酵乳製品中乳酸菌的檢測方法，其特徵在於，步驟(I)中MRS培養基的組分為:葡萄糖20g，牛肉膏20g，瓊脂15g，蛋白腖10g，酵母提取物5g、乙酸鈉5g、檸檬酸二銨2g，磷酸氫二鉀2g，硫酸錳水合物0.8-lg，加蒸餾水至1L，加氫氧化鈉至PH為6.2-6.5，高壓滅菌備用。
[0033]所述的硫酸錳水合物為硫酸錳的硫酸錳四水合物與硫酸錳七水合物的混合物，所述的硫酸錳四水合物與硫酸錳七水合物的質量比為1.0:0.8。
[0034]步驟(4)中所述的DNA提取液PH為8.0，其組成為:90mol/L的Tris-HCl，90mol/L 的 EDTA,90mmol/L 的磷酸鈉，1.2mol/L 的氯化鈉，0.8% 的 CTAB0
[0035]觀察步驟(6)中的電泳檢測結果。
[0036]以上所述實施例只是本發明的較佳實例，並非來限制本發明實施範圍，故凡依本發明申請專利範圍所述的構造、特徵及原理所做的等效變化或修飾，均應包括本發明專利申請範圍內。
【權利要求】
1.一種發酵乳製品中乳酸菌的檢測方法，其特徵在於，包括以下步驟: (1)細菌培養:取5-10ml樣品加入10-20ml滅菌水中稀釋震蕩混勻，平板塗片於MRS培養基中，恆溫培養12-24h,取樣品菌落； (2)取步驟(I)中取的菌落進行革蘭氏染色，並在顯微鏡下觀察細菌形態； (3)將步驟(I)中的菌落加入10-20mlPBS緩衝液中，製成菌懸液，將菌懸液取1.5ml加入離心管中，加入等體積的氯仿，混勻2-5min，離心，取上清液，加無菌水或TE緩衝液500-700ul混勻重懸，離心，取上清液作為待測樣品溶液； (4)DNA提取:取步驟(3)中製得的待測樣品溶液至另一離心管中，採用酚氯仿抽提2次，加入0.1倍體積的醋酸鈉及I倍體積的異丙醇沉澱DNA，再採用體積濃度為70%-80%的乙醇溶液洗滌沉澱2次，自然乾燥，加雙蒸水溶解，得樣品DNA模板； (5)PCR擴增:將步驟(4)中提取的DNA模板進行DNA擴增； (6)對步驟(5)中PCR擴增產物進行瓊脂凝膠電泳檢測，觀察檢測結果。
2.根據權利要求1所述的所述的一種發酵乳製品中乳酸菌的檢測方法，其特徵在於，步驟(I)中MRS培養基的組分為:葡萄糖20g，牛肉膏20g，瓊脂15g，蛋白腖10g，酵母提取物5g、乙酸鈉5g、檸檬酸二銨2g，磷酸氫二鉀2g，硫酸錳水合物0.8-lg，加蒸餾水至1L，加PH調節劑至PH為6.2-6.5，高壓滅菌備用。
3.根據權利要求2所述的所述的一種發酵乳製品中乳酸菌的檢測方法，其特徵在於，所述的硫酸錳水合物為硫酸錳的硫酸錳四水合物與硫酸錳七水合物的混合物。
4.根據權利要求3所述的所述的一種發酵乳製品中乳酸菌的檢測方法，其特徵在於，所述的硫酸錳四水合物與硫酸錳七水合物的質量比為(0.8-1.2): (0.6-1.0)。
5.根據權利要求1所述的所述的一種發酵乳製品中乳酸菌的檢測方法，其特徵在於，所述的PH調節劑選自硫酸、鹽酸、氫氧化鈉或氫氧化鉀中的一種或多種。
6.據權利要求1所述的所述的一種發酵乳製品中乳酸菌的檢測方法，其特徵在於，步驟(I)中所述的恆溫培養溫度為35-40°C。
7.根據權利要求1所述的所述的一種發酵乳製品中乳酸菌的檢測方法，其特徵在於，步驟(3)中所述的離心速度為8000-10000r/min,離心時間為5_10min。
8.根據權利要求1所述的所述的一種發酵乳製品中乳酸菌的檢測方法，其特徵在於，步驟(4)中所述的DNA提取液PH為7.8-8.2，其組成為:80-100mol/L的Tris-HCl, 80-100mol/L 的 EDTA，80-1OOmmoI/L 的磷酸鈉，1.0-1.5mol/L 的氯化鈉，0.5-1%的 CTAB。
9.根據權利要求1所述的所述的一種發酵乳製品中乳酸菌的檢測方法，其特徵在於，步驟(5)中PCR擴增採用的的引物對為:上下遊引物:
F(WLABl):5』-TCCGGKTTTATTGGGCGTAAAGCGA-3』 ；
R(WLAB2):5』-TCGAATTAAACCACATGCTCCA-3』。
10.根據權利要求1所述的所述的一種發酵乳製品中乳酸菌的檢測方法，其特徵在於，步驟(6)中的結果觀察具體為:電泳檢測出現唯一一條PCR擴增條帶，判斷為陽性，若出現了該條帶的同時也出現了其他條帶，判斷為陰性，此時對PCR擴增產物進行illuminagenome analyzer
【文檔編號】C12R1/225GK104278086SQ201410481205
【公開日】2015年1月14日 申請日期:2014年9月20日 優先權日:2014年9月20日
【發明者】郭狄 申請人:中山鼎晟生物科技有限公司