靶向PD‑1的嵌合抗原受體分子及其應用的製作方法

2023-05-10 08:29:31

本發明涉及分子生物學領域，尤其涉及靶向pd-1的嵌合抗原受體分子及其應用。
背景技術：
：惡性腫瘤是一種嚴重威脅人類生命的疾病。惡性腫瘤或癌症的發病機理多種多樣，其共同的表現在於變異的腫瘤細胞不受機體免疫系統的清除，能夠無限制的繁殖和擴散，破壞周圍組織的正常細胞和功能。長期以來，醫藥學界在嘗試醫治和控制腫瘤疾病的病程方面做了大量的努力，但收效甚微。目前，在惡性腫瘤的治療上，除根除手術外，主流醫學界的臨床輔助治療手段仍然是放射線治療、化學藥物治療和抗體治療。1985年，美國科學家嘗試分離病人的單個核細胞，並在體外用各種細胞因子誘導、激活、產生殺傷性t細胞(cytokine-inducedkillercells，cik)，繼而發現這些細胞通過靜脈滴注回輸給病人後，對腫瘤的生長有殺傷作用。經過近三十年的臨床應用和技術發展，用免疫殺傷細胞治療腫瘤已經成為第四種公認的惡性腫瘤輔助治療手段。常見的用於臨床治療的免疫殺傷細胞：自然殺傷細胞(naturalkillercells，nk)、γδt細胞、細胞毒性t淋巴細胞(cytotoxictlymphocytes，ctl)、nk樣t淋巴細胞(naturalkiller-liketcells，nkt)、th1效應細胞(effectorcells)等。抗原提呈細胞之一樹突狀細胞(dentriticcells，dc)也常用於免疫細胞治療的應用，dc可以提高免疫殺傷細胞的特異性、加強免疫殺傷細胞的活力。免疫活性細胞對腫瘤細胞的識別和殺傷效果，取決於腫瘤細胞膜表面的受體分子表達，至少有兩方面的因素導致體內的t淋巴細胞不能很好地識別癌細胞：(1)癌細胞下調抗原呈遞分子的表達，(2)被呈遞的抗原與t細胞受體親和力很弱。雖然癌症患者體內存在癌細胞高度特異性的t淋巴細胞，但是數量太少起不到治療癌症的作用。為了克服免疫殺傷細胞特異性低下的缺點，美國科學家發明一種轉基因的方法：將識別腫瘤表面特異性抗原的單克隆抗體高變區序列在體外重組、亞克隆為單鏈抗體片段(singlechainantibodyfragmentofvariableregions，scfv)，再與其他基因的跨膜蛋白片段和胞內信號肽融合形成人造的嵌合抗原受體(chimericantigenreceptor，car)，轉染至t細胞內而形成嵌合抗原受體t細胞(chimericantigenreceptor，car-t)。嵌合抗原受體主要由兩部分構成，一端位於細胞外能夠特異性識別癌細胞表面的某一抗原，另一端位於胞內含有信號激活元件(如t細胞受體的zeta鏈)，起傳遞信號激活t細胞的作用。在正常情況下，人體的血液循環中存在少量的活性殺傷細胞，如nk，γδt細胞等，其作用在於清除衰老、變異的組織細胞或抵禦病毒入侵。免疫細胞的活性主要受到t調節細胞(regulatorytcells，treg)的控制，當t調節細胞的控制減弱時，會造成免疫功能亢進或產生自身免疫性疾病；當控制增強時，會使免疫功能低下，滋生腫瘤或其他病毒性皮膚病。目前確認的參與負調節的蛋白因子有細胞毒t淋巴細胞相關抗原4(cytotoxictlymphocyte-associatedantigen-4，ctla4)和程序性死亡蛋白1/程序性死亡蛋白1配基1(programmedcelldeathprotein1/programmedcelldeathprotein1ligand1，pd-1/pd-l1)等分子。抑制性t調節細胞表達ctla4，可以與免疫細胞dc和t細胞表面的b7族蛋白亞基相互作用，抑制免疫細胞功能。b7蛋白家族成員有b7-h1(pd-l1)，b7-h2(pd-1l2)等。b7-h1(pd-l1)也可以通過結合淋巴細胞pd-1分子，進一步抑制靶細胞的活性功能。pd-1和pd-l1相互作用對t細胞功能的抑制是免疫細胞治療腫瘤的一個主要障礙。在大多數實體瘤組織中，癌細胞表達pd-l1/pd-1的水平增高，對浸潤到癌組織的活化淋巴細胞產生直接的抑制，這也是腫瘤逃逸機體免疫監管的機制之一；活化t細胞表面pd-1的表達增加，更容易受到負調節的抑制。最新的抗體藥物keytruda和opdivo已被美國fda批准臨床治療惡性腫瘤，其作用原理是阻斷ctla4/b7以及pd-1/pd-l1的相互結合，從而解除體內t調節細胞或癌細胞對活性t殺傷細胞的抑制，讓體內免疫活性細胞對腫瘤細胞進行殺傷、清除。技術實現要素：為解決上述技術問題，本發明的目的是提供一種具有與腫瘤表面pd-1分子更高親和力的靶向pd-1的嵌合抗原受體分子及其應用。本發明第一方面提供一種靶向pd-1的嵌合抗原受體分子，包括依次串聯的胞外區肽段、跨膜區肽段和胞內結構域肽段，所述胞外區肽段包括依次相連的抗pd-1單鏈抗體肽段、連接肽段、以及pd-l1胞外區肽段，所述胞外區肽段的序列如seqidno：1所示。應當說明的是，所述跨膜區肽段為蛋白質序列中跨越細胞膜的區域，通常為α-螺旋結構，約20～25個胺基酸殘基，其胺基酸大部分是疏水性胺基酸；其中，所述跨膜區肽段包括但不限於cd28跨膜區肽段、cd8跨膜區肽段或pd-l1跨膜區肽段，當跨膜區肽段為cd8跨膜區肽段時，所述pd-l1胞外區肽段與cd8跨膜區肽段還通過cd8的hinge區肽段相連。cd8跨膜區肽段的序列如seqidno：2所示，cd8的hinge區肽段的序列如seqidno：3所示，pd-l1跨膜區肽段的序列如seqidno：4所示。進一步的，所述胞內結構域肽段為共刺激信號分子，選自4-1bb(又稱cd137)、cd28、cd3ζ的胞內結構域肽段中的一種或多種。優選的，所述胞內結構域肽段選自相互連接的4-1bb和cd3ζ胞內結構域肽段，其序列分別如seqidno：5和6所示。進一步的，所述嵌合抗原受體分子還包括信號肽。信號肽可以提高嵌合抗原受體分子這種融合蛋白分泌的效果，在信號肽與融合蛋白其它胺基酸序列一起被表達後，最終被蛋白酶切除。蛋白酶具有一定的識別序列，而信號肽與其後面的肽段融合後構成新的胺基酸序列，所以如果選擇的信號肽不當，可能會導致蛋白酶的誤切，蛋白失活。信號肽可選自免疫球蛋白輕鏈的信號肽、或是pd-1蛋白分泌的信號肽，其序列分別如seqidno：7和8所示。優選的，本發明的靶向pd-1的嵌合抗原受體分子，由免疫球蛋白輕鏈的信號肽、抗pd-1單鏈抗體肽段、連接肽段、pd-l1胞外區肽段、cd28的跨膜區和胞內區肽段和cd3ζ胞內結構域肽段依次連接而成，其胺基酸序列如seqidno：9所示。本發明第二方面提供一種核苷酸，其編碼本發明第一方面提供的嵌合抗原受體分子。本發明第三方面提供一種重組載體，其包含本發明第二方面提供的核苷酸。進一步的，所述載體為慢病毒載體，其可以將外源基因或外源的shrna有效地整合到宿主染色體上，從而達到持久性表達目的序列的效果。在感染能力方面可有效地感染神經元細胞、肝細胞、心肌細胞、腫瘤細胞、內皮細胞、幹細胞等多種類型的細胞，從而達到良好的的基因治療效果。對於一些較難轉染的細胞，如原代細胞、幹細胞、不分化的細胞等，使用慢病毒載體，能大大提高目的基因或目的shrna的轉導效率，且目的基因或目的shrna整合到宿主細胞基因組的機率大大增加，能夠比較方便快捷地實現目的基因或目的shrna的長期、穩定表達。應當說明的是，本發明中所用的慢病毒載體，應當包括但不限於prrslin慢病毒表達載體和plvx載體，優選為prrslin慢病毒表達載體。本發明第四方面提供一種重組細胞，其包含本發明第三方面提供的重組載體。所述重組細胞優選為t細胞或nk細胞。該嵌合抗原受體的編碼基因能夠通過前述載體被轉移至t細胞或nk細胞內，用於修飾t細胞或nk細胞，成為car-t或car-nk細胞；利用該嵌合抗原受體修飾的t細胞或nk細胞，能夠通過識別腫瘤細胞表面的組織因子，殺死腫瘤細胞，進行腫瘤治療。藉由上述方案，本發明至少具有以下優點：本發明的嵌合抗原受體分子，具有與腫瘤表面pd-1分子更高親和力，將其組裝在car-t細胞表面，用來識別腫瘤細胞，具有更高的親和力和殺傷活性。上述說明僅是本發明技術方案的概述，為了能夠更清楚了解本發明的技術手段，並可依照說明書的內容予以實施，以下以本發明的較佳實施例並配合附圖詳細說明如後。附圖說明圖1是慢病毒表達載體構建示意圖；圖2是靶向pd-1的嵌合抗原受體分子的設計原理圖。具體實施方式下面結合附圖和實施例，對本發明的具體實施方式作進一步詳細描述。以下實施例用於說明本發明，但不用來限制本發明的範圍。實施例1慢病毒表達載體製備本發明提供一種用於表達靶向pd-1的嵌合抗原受體分子的慢病毒表達載體的製備方法，包括以下步驟：s1、採用經典的免疫時間表，對balb/c小鼠免疫，免疫原為hpd-1(人源pd-1)蛋白，以使動物產生抗hpd-1的抗體，將小鼠脾細胞與sp2/0細胞融合製備雜交瘤細胞，elisa結合方法進行初篩，細胞結合以及細胞抑制實驗進行復篩，得到陽性克隆；提取陽性克隆總rna，逆轉錄製備cdna，分別用leaderprimer擴增抗體的重鏈及輕鏈可變區，測序分析後得到抗pd-1抗體的胺基酸序列，分析處理後得到抗pd-1單鏈抗體序列；s2、從genbank資料庫中搜尋已知的人pd-l1胞外區序列、人cd28的跨膜區和胞內區序列和cd3ζ胞內區基因序列；s3、將上述基因序列依次按免疫球蛋白輕鏈的信號肽、抗pd-1單鏈抗體肽段、連接肽段、pd-l1胞外區肽段、cd28的跨膜區和胞內區肽段和cd3ζ胞內結構域肽段進行連接，在各序列連接處引入不同的酶切位點，形成完整的pd-1-car基因序列信息，s4、將pd-1-car基因序列通過酶切轉化連接到prrslin載體中，基因上遊為ep-1α啟動子。將載體轉化到stbl3大腸桿菌菌株後，轉種到含有氨苄青黴素的固體培養基中進行繁殖，篩選，獲得陽性克隆，提取質粒，酶切鑑定克隆，通過測序確認載體構建成功，獲得prrslin-pd-1慢病毒表達載體，慢病毒表達載體構建示意圖如圖1所示，靶向pd-1的嵌合抗原受體分子的設計原理圖如圖2所示。實施例2慢病毒製備本發明提供實施例1中慢病毒表達載體表達製備慢病毒的方法，包括以下步驟：s1、轉染前24小時，以每皿約8×106將293t細胞接種至15cm培養皿中。確保轉染時細胞在80％左右的匯合度且均勻分布於培養皿中。s2、準備溶液a和溶液b溶液a：6.25ml2×hepesbuffer緩衝液溶液b：分別加入以下質粒的混合物：112.5μgprrlsin-pd-1(targetplasmid)；39.5μgpmd2.g(vsv-genvelop)；73μgpcmvr8.74(gag，pol，tat，rev)；625μl2m鈣離子溶液。s3、充分混勻溶液b，輕輕渦旋溶液a的同時，逐滴加入溶液b，靜置2-3分鐘。輕輕渦旋上述a和b的混合溶液，逐滴加入含293t細胞的培養皿中，輕輕前後晃動培養皿使dna與鈣離子的混合物均勻分布。放置於培養箱中培養16-18小時。更換新鮮培養基，繼續培養，在轉速500g，溫度25℃下離心10min，使用pes膜(0.45μm)過濾；以70％乙醇消毒離心管，並置於紫外燈下消毒30min；將已過濾的含慢病毒的上清液轉移至離心管中，在離心管底部小心鋪上一層20％蔗糖(每8ml上清液加1ml蔗糖)，以pbs平衡離心管，在轉速25000rpm、溫度4℃下離心2h；小心取出離心管，倒掉上清液，倒置離心管去掉殘餘液體；加入100μlpbs，密封離心管，在4℃放置2h，每20min輕輕渦旋一次，500g離心1min(25℃)，收集病毒上清；冰上冷卻後，置於-80℃保存。實施例3pd-1-car-t細胞製備本發明提供實施例2中慢病毒侵染細胞製備pd-1-car-t細胞的方法，包括以下步驟：s1、取0.5ml血進行快速的病原微生物檢測；無菌條件下，用肝素瓶採血50ml(肝素抗凝)。s2、室溫離心後收集上層血漿，留下沉澱層；收集的自體血漿經56℃，30min滅活，4℃放置15min後，900g，離心30min(4℃)，取上清備用。s3、將上述富集的血細胞用生理鹽水稀釋，用移液管把稀釋後的血細胞液緩緩加入到盛有人淋巴分離液的離心管中，注意勿打破人淋巴分離液的界面。將加好的血細胞液放入離心機，調至最小的升降速率，常溫2000rpm離心20min。收集兩管的中層白細胞層於離心管中，加入5ml生理鹽水洗兩次，得外周血單核細胞(pbmc)。s4、配置完全生長培養基，將分離得到的pbmc用培養基稀釋成2×106/ml，取50μl流式檢測pbmc中t細胞的純度。s5、day0，配置緩衝液，選用微珠作為細胞培養載體，將微珠振蕩30s或手動上下搖勻5min，按照微珠與t細胞的用量比為3∶1取cd3/cd28微珠置於1.5mlep管中，添加1ml緩衝液清洗微珠，之後使用磁鐵從ep管向外吸微珠1min，棄洗液，重複兩次，再使用培養基將微珠重懸到原體積，將細胞和微珠混合後按2×106pbmc/ml加到合適的培養瓶中。s6、day2將細胞密度調整至3-5×106/ml，按慢病毒與細胞的比例為1∶5添加實施例2製備得到的慢病毒，同時添加聚凝胺(polybrene)4μg/ml和40ng/mlil-2。4h之後，補加新鮮的完全培養基將細胞密度調整至1×106/ml繼續培養。將所有的細胞離心，加入新鮮的培養基，繼續培養。s7、每隔2-3天進行半量換液，維持細胞密度在0.5-1×106/ml。s8、day10-12，細胞數量達到109級別，在400g下離心5min得到免疫細胞，再用預冷的pbs洗滌兩遍。s9、用血球計數板計數，流式細胞儀檢測細胞類群，pd-1-car-t細胞比例。每天觀察培養基的顏色變化、細胞密度、細胞形態並作相應記錄。逐步擴大培養過程中，加入總體積所需的白細胞介素-2。實施例4pd-1-car-t細胞體外活性檢測採用ldh釋放法檢測pd-1-car-t細胞對高表達pd1的腫瘤細胞的殺傷效應，通過elisa方法檢測ldh釋放，包括以下步驟：s1、用含5％小牛血清的rpmi-1640培養液將靶細胞調整到5×104/ml。s2、在96孔細胞培養板中加入靶細胞，每孔加100μl。取3個孔作為效應細胞(pd-1-car-t細胞)自然釋放對照孔，不加靶細胞，僅加100μl培養液。s3、向各孔加100μl效應細胞，效應細胞與靶細胞的比例10∶1；5∶1；1∶1。自然釋放孔不加效應細胞只加100μl培養液，效應細胞與靶細胞共孵育6小時，每個實驗置三個復孔。s4、最大釋放孔中(陽性對照)加10μllysissolution(10×)，孵育45min-60min，每個實驗置三個復孔。s5、取上述3和4中待測樣品和對照樣品各50μl，加入新鮮的96孔酶標板中，再加入反應液和底物，避光30min。s6、加入50μl終止液。s7、在酶聯檢測儀上測定各孔的光密度(od值)，檢測波長490nm或492nm，在1小時內測完。s8、特異性殺傷效率計算殺傷率＝實驗組ldh(od)/最大ldh釋放組(od)。計算公式：殺傷效率＝(實驗組-效應自然釋放-靶自然釋放)/(靶最大釋放-靶自然釋放)×100％。s9、通過cba試劑盒測定細胞因子分泌情況，同時計算pd-1-car-t細胞各組中的增殖情況，並利用cd3和cd8抗體染色，確認增殖的t細胞中cd8陽性的t細胞的比例。殺傷效率如表1所示，可見pd-1-car-t細胞對smc7721腫瘤細胞的殺傷效率明顯高於其它腫瘤細胞，高表達pd-1的mcf7細胞株的殺傷效率明顯高於普通mcf7細胞株。表1pd-1-car-t細胞殺傷效率對比表效應細胞∶靶細胞helamcf7mcf7-pd-1smc772110∶130.6％50.3％70.1％85.2％5∶122.4％33.6％40.5％50.9％1∶17.1％11.3％15.5％32.8％實施例5pd-1-car-t細胞體內對腫瘤殺傷活性檢測收集對數生長期的u251腫瘤細胞，計數細胞數量後調整細胞濃度，每隻小鼠右側背部皮下接種1×107個細胞。待腫瘤體積達到300-400mm3時，計數pd-1-car-t細胞濃度調整至2×108個/ml，尾靜脈注射小鼠100μl/只，隔一天注射一次，共三次；對照組注射未轉染慢病毒的t淋巴細胞。接種腫瘤30天後，用遊標卡尺測量腫瘤的長與寬，計算腫瘤體積並統計生存率。結果如表2所示，可見pd-1-car-t細胞體內對腫瘤細胞的殺傷效果較高。表2pd-1-car-t細胞體內對腫瘤殺傷活性檢測結果對照組pd-1-car-t細胞組腫瘤體積(mm3)1301±98287±27生存率(％)081.3以上所述僅是本發明的優選實施方式，並不用於限制本發明，應當指出，對於本
技術領域：
的普通技術人員來說，在不脫離本發明技術原理的前提下，還可以做出若干改進和變型，這些改進和變型也應視為本發明的保護範圍。當前第1頁12