一種可緩慢釋放抗腫瘤適體藥物的微囊及其製備工藝的製作方法
2023-07-02 04:42:21
專利名稱：一種可緩慢釋放抗腫瘤適體藥物的微囊及其製備工藝的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種可緩慢釋放抗腫瘤適體藥物的微囊及其製備工藝。
背景技術：
腫瘤的生長發展可分為血管前期和血管化期。在腫瘤形成的早期-瘤體內並無血管生長，此為血管前期。這時-腫瘤生長依靠氧營養物質的彌散來維持-一般僅能長到2-3 毫米。此期腫瘤細胞的增生和凋亡處於平衡狀態。此時腫瘤生長緩慢，可持續多年，相當於臨床上的原位癌，幾乎不發生轉移。腫瘤的進一步生長有賴於隨後的血管新生表型啟動，促使腫瘤形成新生血管-進入血管化期。此期腫瘤組織主要以血流灌注的方式獲取營養，腫瘤細胞呈指數生長，且凋亡減少，導致腫瘤生長加速。新生血管也為腫瘤細胞侵襲轉移提供了有利條件。血管內皮生成因子(VEGF)是血小板源生長因子超家族中的一員，目前主要包括 VEGF-A、胎盤生長因子、VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D和VEGF-E，VEGF-A是其中最重要的成員。 VEGF通過其受體VEGFR介導下遊信號的傳導，促進血管內皮細胞增殖，分化成熟，抑制血管內皮細胞凋亡，誘導血管平滑肌細胞遷移，並促進血管平滑肌細胞合成和分泌基質金屬蛋白酶，加速基質降解以及趨化炎症細胞等，最終促使新毛細血管生成和功能成熟。在組織缺氧的情況下，HIF_la(缺氧誘導因子-Ια)和MMP(基質金屬蛋白酶)等細胞因子會促進 VEGF的表達和分泌。VEGF不僅能誘導癌血管生成，促進癌生長，還可能參與癌細胞耐藥性的形成。因此VEGF是抗癌藥物最重要的靶點。適體是功能相當於抗體的DNA或RNA片段，能夠對靶分子進行特異性識別和結合， 並有效抑制靶分子的生物學活性。適體的應用前景更為廣泛。目前針對血液疾病、心血管疾病、神經系統疾病、血液系統疾病、腫瘤等疾病的診斷與治療方面的適體研究已經在進行中，一些適體製劑已經進入臨床試驗，專門用於治療黃斑變性的靶向作用於VEGF的適體藥物(Macugen)已經上市。適體是核酸分子，在體內極易被核酸酶降解而表現出極大的不穩定性，並且會通過腎臟迅速排出體外而來不及發揮其功能，嚴重限制了它在治療領域的實際應用。目前尚無理想的方法解決適體的體內穩定性問題。但研究表明這個問題可以通過對它進行適當修飾得以改善，修飾後的適體穩定性和抗降解能力增強，從而在血漿中穩定存在的時間也明顯延長。這種修飾技術可分為兩大類分子內修飾和分子外修飾。分子內修飾是通過一些化學方法，將影響體內穩定性的基團，用另一些相應的基團取代。修飾的對象有糖環、鹼基和磷酸，其中以糖環的修飾最為普遍。將氟、氨基和2』 -氧-甲基基團引入戊糖糖環上的2'位，可以顯著增加適體的抗核酸酶降解特性。此外，由於體液中的核酸酶只識別D型糖環而對L型糖環無作用，所以可通過將D型糖環修飾成L型糖環達到抗核酸酶降解的目的。除糖環修飾外，還可進行鹼基和磷酸的修飾。分子內修飾雖可以提高適體在體內的穩定性，但在臨床治療方面還不能保證足夠的藥代動力學特徵，因為適體在靜脈注射後幾分鐘內就可能通過腎臟排洩而被清除。要解決該問題可將它與某些具有生物相容性，但沒有生物活性的大分子連接，延長其在體內的作用時間，即分子外修飾。聚乙二醇(PEG)與適體共價結合，能防止其快速被血漿清除。Pegaptanib (Ng EWM，等。Nature Reviews Drug Discovery 2006, 5 123-132)即採用了該技術。但如此修飾的核苷酸可以循環進入宿主的 DNA，從而引發安全隱患。聚乙二醇偶聯後，Pegaptanib體內半衰期提高至10小時左右，但如用於腫瘤治療，仍然需要每天注射給藥。採用緩釋製劑技術也應當是長期維持適體藥物在體內有效濃度的方法之一，但對於適體藥物，何種製劑最適合仍無明確方法和技術。本發明即為適體藥物的緩慢釋藥提供了可行方法。微囊內包裹的活性成分，即可以靶向作用於VEGF的適體藥物。該適體藥物可以阻礙VEGF與受體的結合，從而抑制腫瘤的新生血管生成。經微囊包裹後，適體藥物可以緩慢釋放，在體內維持穩定的血藥濃度，克服了常規製劑使用劑量大，作用時間短，需反覆用藥的缺點。
發明內容
本發明的目的在於提供了一種可緩慢釋放抗腫瘤適體藥物的微囊及其製備工藝。 本發明解決了適體藥物的緩釋問題，可以明顯提高藥物的體內活性。為了達成上述目的，本發明的解決方案是一種可緩慢釋放抗腫瘤適體藥物的微囊，採用人血白蛋白包裹適體藥物形成微囊，該微囊的粒徑為150-350nm，在體內外緩慢釋放內含的適體藥物。所述的適體藥物為抗血管內皮生成因子165(VEGF165)的適體藥物，具有抑制腫瘤新生血管生成的活性。一種可緩慢釋放抗腫瘤適體藥物的微囊的製備工藝，包括如下步驟將適體藥物溶解於人血白蛋白水溶液中，以無水乙醇為凝聚劑使適體藥物包裹於白蛋白內形成微囊， 微囊表面經戊二醛交聯使微囊固化，得到可緩慢釋放抗腫瘤適體藥物的微囊。所述的製備步驟優選為將所述的人血白蛋白溶於生理鹽水，調節pH至7. 8-8. 2， 加入適體藥物使完全溶解；滴加無水乙醇至上述溶液，使微囊析出；微囊經戊二醛溶液固化，以生理鹽水反覆洗滌，超聲震蕩混勻，經0. 45微米濾膜過濾，得到可緩慢釋放抗腫瘤適體藥物的微囊。所述的人血白蛋白與適體藥物的加入的重量比為1000-100000 1，生理鹽水與人血白蛋白之間加入的重量比為5-20 1，無水乙醇與人血白蛋白之間加入的重量比為10-100 1，戊二醛溶液的濃度為6%，戊二醛溶液與人血白蛋白之間加入的重量比為 0. 5-10 1，pH 為 7. 5-8. 5。所述的人血白蛋白與適體藥物的加入的重量比優選為為10000 1，生理鹽水與人血白蛋白之間加入的重量比為20 1，無水乙醇與人血白蛋白之間加入的重量比為 20 1，戊二醛溶液的濃度為6%，戊二醛溶液與人血白蛋白之間加入的重量比為1 2，pH 為 7. 8-8. 2。所述的可緩慢釋放抗腫瘤適體藥物的微囊用注射用水將其溶解成適體含量為 10mg/ml的溶液，溶液中加入甘露醇至100mg/ml，無菌過濾，冷凍乾燥即得可緩慢釋放抗腫瘤適體藥物的微囊的凍乾粉針。本發明的有益效果為本發明篩選並優化了適體藥物微囊的製劑工藝。該工藝解決了適體藥物的緩釋問題，可以緩慢釋放適體藥物，明顯提高藥物的體內活性，克服了常規製劑需要反覆給藥，病人依從性低的缺陷，體內藥效也顯著提高。
圖1是本發明的抗VEGF165適體藥物結構及活性位點圖；圖2是本發明的微囊的電鏡照片；圖3是本發明實施例中微囊化適體藥物體外釋藥曲線；圖4是本發明實施例中肺癌模型小鼠腫瘤生長曲線；給藥組1為未微囊化適體藥物組(每日給藥)，給藥組2為微囊化適體藥物組(每3日給藥1次)，給藥組3為微囊化適體藥物組(每日給藥1次)。
具體實施例方式實施例1適體微囊的製備本實施例所使用的適體是具有抗VEGF165活性的適體，適體序列與Pegaptanib — 致，由寶生物(大連)公司製備。微囊的製備方法為取100克人白蛋白(購於上海萊士血液製品股份有限公司) 溶於2升生理鹽水中，室溫攪拌均勻。以NaOH調節pH至8. 0後，加入IOmg適體藥物，使完全溶解。滴加無水乙醇至上述溶液中，總加入無水乙醇體積為2升。邊滴加便攪拌，攪拌速度為lOOOrpm。無水乙醇添加完畢後繼續攪拌1小時。靜止，析出微囊。經離心收集微囊， 加入50ml 6%的戊二醛溶液固化微囊0. 5小時。離心收集微囊，以生理鹽水洗滌，反覆此過程3次。最後，以IOOml生理鹽水懸浮微囊，超聲震蕩半小時。經0. 45微米濾膜過濾後備用。本實施例篩選並優化了適體藥物微囊的製劑工藝。該工藝解決了適體藥物的緩釋問題， 可以緩慢釋放適體藥物，明顯提高藥物的體內活性，克服了常規製劑需要反覆給藥，病人依從性低的缺陷，體內藥效也顯著提高。實施例2適體微囊的製備本實施例所使用的適體是具有抗VEGF165活性的適體，適體序列與Pegaptanib — 致，由寶生物(大連)公司製備。取1克人白蛋白(購於上海萊士血液製品股份有限公司)溶於10毫升生理鹽水中，室溫攪拌均勻。以NaOH調節pH至8. O後，加入Img適體藥物，使完全溶解。滴加無水乙醇至上述溶液中，總加入無水乙醇體積為100毫升。邊滴加便攪拌，攪拌速度為lOOOrpm。 無水乙醇添加完畢後繼續攪拌1小時。靜止，析出微囊。經離心收集微囊，加入IOml 6%的戊二醛溶液固化微囊0.5小時。離心收集微囊，以生理鹽水洗滌，反覆此過程3次。最後， 以IOml生理鹽水懸浮微囊，超聲震蕩半小時。經0.45微米濾膜過濾後備用。本實施例工藝解決了適體藥物的緩釋問題，可以緩慢釋放適體藥物，明顯提高藥物的體內活性，克服了常規製劑需要反覆給藥，病人依從性低的缺陷，體內藥效也顯著提高。實施例3取1克人白蛋白(購於上海萊士血液製品股份有限公司)溶於5毫升生理鹽水中，室溫攪拌均勻。以NaOH調節pH至8.0後，加入0. Olmg適體藥物，使完全溶解。滴加無水乙醇至上述溶液中，總加入無水乙醇體積為10毫升。邊滴加便攪拌，攪拌速度為lOOOrpm。 無水乙醇添加完畢後繼續攪拌1小時。靜止，析出微囊。經離心收集微囊，加入5ml 6%的戊二醛溶液固化微囊0.5小時。離心收集微囊，以生理鹽水洗滌，反覆此過程3次。最後， 以IOml生理鹽水懸浮微囊，超聲震蕩半小時。經0.45微米濾膜過濾後備用。本實施例工藝解決了適體藥物的緩釋問題，可以緩慢釋放適體藥物，明顯提高藥物的體內活性，克服了常規製劑需要反覆給藥，病人依從性低的缺陷，體內藥效也顯著提高。實施例4適體微囊的檢測①取實施例1-3得到的微囊，電鏡下檢測，可見實施例1顆粒大小均勻(圖2)。實施例2-3得到的微囊顆粒與實施例1類似。②對實施例1得到的微囊的適體包裹率進行測定。按照公式(適體初始量-上清內適體殘餘量)/適體初始量，計算包裹率。結果3批製劑的包裹率在51-59%之間。實施例2得到的微囊適體包裹率為31%，實施例3得到的微囊適體包裹率為 63%。③對實施例1-3得到的微囊的粒徑進行測定，結果粒徑分布為150-350nm。實施例5取實施例1中製備的微囊，測定其體外釋藥曲線。釋藥介質採用生理鹽水，測定時間為48小時，釋藥曲線見圖3。可見在2小時內累積釋藥率為30%，然後每6小時釋藥10%左右。最大釋藥率為 90%左右。前2小時的30%表現為藥物的突釋現象，之後表現為零級釋放，可維持2天左
右ο實施例6取實施例1得到的微囊，以注射用水溶解成適體含量為10mg/ml的溶液，溶液中加入甘露醇至100mg/ml，無菌過濾。按照常規凍幹工藝冷凍乾燥，得到凍乾粉針。實施例5取6-7周齡裸鼠，體重(20±》g，雌性。取對數生長期的A549細胞製備單細胞懸液，磷酸鹽緩衝液調整細胞濃度為2. 5X 107mL。經臺盼藍染色測定細胞活性後，取200微升細胞懸液接種於裸鼠右背側近腋部皮下。接種7天後，將小鼠隨機分為4組。第一組為模型組，每日皮下注射生理鹽水0. 5ml/只。第2組為給藥組1，每日皮下注射未微囊化適體藥物，劑量為100微克/kg。第3組為給藥組2，每3日皮下注射微囊化適體藥物，劑量為 100微克/kg。第4組為給藥組3，每3日皮下注射微囊化適體藥物，劑量為300微克/kg。從抑瘤曲線(圖4)可知，適體藥物經微囊化後藥效明顯提高。微囊化適體藥物每 3日給藥一次，總劑量降低為原1/3，其藥效即相當於原型藥物(未微囊化)。微囊化適體藥物每3日給藥，總劑量相同，其抑瘤效果則顯著提高。實施例7微囊製備工藝參數的優化。1)ρΗ對粒徑的影響取1克人白蛋白溶於20毫升生理鹽水中，室溫攪拌均勻。以HCl或NaOH分別調節pH至6. 0，7. 0，8. 0，9. 0，加入0. Img適體藥物，使完全溶解。滴加無水乙醇至上述溶液中， 總加入體積為40毫升。邊滴加便攪拌，攪拌速度為lOOOrpm。無水乙醇添加完畢後繼續攪拌1小時。靜止，析出微囊。經離心收集微囊，加入0.5ml 5%的戊二醛溶液固化微囊0.5 小時。離心收集微囊，以生理鹽水洗滌，反覆此過程3次。最後，以Iml生理鹽水懸浮微囊， 超聲震蕩半小時。經0. 45微米濾膜過濾後，測定粒徑，如表1所示，表1為不同pH條件下微囊粒徑範圍表。由表1可見，在鹼性範圍微囊粒徑在納米級。在pH值7. 5和8. 5範圍內進行進一步優化，發現在7. 8-8. 2範圍內，可以將粒徑有效控制在400nm之內。2)戊二醛用量在對微囊進行固化處理時，分別選用戊二醛濃度為3%，6%，9%和12%。發現高濃度條件下固化迅速，但粒徑偏大。低濃度固化不徹底，釋藥速度偏快。以6%的濃度進行固化，得到的微囊在粒徑和釋藥速率方面均較理想。3)適體用量微囊製備方法除適體用量外，均與1)中方法相同。適體用量範圍為0. Olmg-Img0 結果發現，在0. Img之下藥物包裹率均在50%之上，但超過0. Img後，包裹率則迅速降低。 所以選用0. Img0表 權利要求
1.一種可緩慢釋放抗腫瘤適體藥物的微囊，其特徵在於採用人血白蛋白包裹適體藥物形成微囊，該微囊的粒徑為150-350nm，在體內外緩慢釋放內含的適體藥物。
2.如權利要求1所示的一種可緩慢釋放抗腫瘤適體藥物的微囊，其特徵在於所述的適體藥物為抗血管內皮生成因子165(VEGF16Q的適體藥物，具有抑制腫瘤新生血管生成的活性。
3.—種如權利要求1或2所述的可緩慢釋放抗腫瘤適體藥物的微囊的製備工藝，其特徵在於包括如下步驟將適體藥物溶解於人血白蛋白水溶液中，以無水乙醇為凝聚劑使適體藥物包裹於白蛋白內形成微囊，微囊表面經戊二醛交聯使微囊固化，得到可緩慢釋放抗腫瘤適體藥物的微囊。
4.如權利要求3所述的一種可緩慢釋放抗腫瘤適體藥物的微囊的製備工藝，其特徵在於所述的製備步驟為將所述的人血白蛋白溶於生理鹽水，調節PH至7. 8-8. 2，加入適體藥物使完全溶解；滴加無水乙醇至上述溶液，使微囊析出；微囊經戊二醛溶液固化，以生理鹽水反覆洗滌，超聲震蕩混勻，經0. 45微米濾膜過濾，得到可緩慢釋放抗腫瘤適體藥物的微^ ο
5.如權利要求3或4所述的一種可緩慢釋放抗腫瘤適體藥物的微囊的製備工藝，其特徵在於所述的人血白蛋白與適體藥物的加入的重量比為1000-100000 1，生理鹽水與人血白蛋白之間加入的重量比為5-20 1，無水乙醇與人血白蛋白之間加入的重量比為10-100 1，戊二醛溶液的濃度為6%，戊二醛溶液與人血白蛋白之間加入的重量比為 0. 5-10 1，pH 為 7. 5-8. 5。
6.如權利要求5所述的一種可緩慢釋放抗腫瘤適體藥物的微囊的製備工藝，其特徵在於所述的人血白蛋白與適體藥物的加入的重量比為10000 1，生理鹽水與人血白蛋白之間加入的重量比為20 1，無水乙醇與人血白蛋白之間加入的重量比為20 1，戊二醛溶液的濃度為6%，戊二醛溶液與人血白蛋白之間加入的重量比為1 2，pH為7. 8-8. 2。
7.如權利要求3或4所述的一種可緩慢釋放抗腫瘤適體藥物的微囊的製備工藝，其特徵在於所述的可緩慢釋放抗腫瘤適體藥物的微囊用注射用水將其溶解成適體含量為 10mg/ml的溶液，溶液中加入甘露醇至100mg/ml，無菌過濾，冷凍乾燥即得可緩慢釋放抗腫瘤適體藥物的微囊的凍乾粉針。
全文摘要
本發明公開了一種可緩慢釋放抗腫瘤適體藥物的微囊及其製備工藝，採用人血白蛋白包裹適體藥物形成微囊，該微囊的粒徑為150-350nm，在體內外緩慢釋放內含的適體藥物。本發明解決了適體藥物的緩釋問題，可以明顯提高藥物的體內活性。
文檔編號A61K47/42GK102416008SQ20111037530
公開日2012年4月18日 申請日期2011年11月22日 優先權日2011年11月22日
發明者刁勇, 林俊生, 王立強 申請人:華僑大學