一種控制水稻花粉育性基因及應用的製作方法

2023-05-10 05:16:31

專利名稱：：一種控制水稻花粉育性基因及應用的製作方法
技術領域：
：本發明涉及植物基因工程領域。具體的說，本發明涉及利用水稻T-DNA隨機插入突變體庫，分離克隆一種控制水稻花粉育性的基因OsNMS。該基因的失活可影響水稻花粉的正常發育並造成水稻植株的完全不育，通過RNAi技術抑制該基因的表達可使正常水稻的育性明顯降低，通過互補試驗可使突變體的育性有大幅提高。同時還涉及利用該雄性不育基因在水稻雜交制種上的應用。
背景技術：
：眾所周知，水稻是禾穀類作物研究的模式植物。隨著水稻基因組全序列的完成，水稻基因組的研究已進入功能基因組時代，而高通量、高效率的研究基因功能的方法是構建飽和的突變體庫(SpringerPS.Genetrapstoolsforplantdevelopmentandgenomics.PlantCell，2000，121007-1020；RamachandranS，SundaresanV.Transposonsastoolsforfunctionalgenomics.PlantPhysiolBiochem，2001.39243-252)。通過先找目標基因的突變體再觀察其突變表型來研究基因的功能或先篩選突變表型再找突變的基因並驗證兩者之間的必然關係來研究基因的功能，也即是所謂的反向遺傳學及正向遺傳學兩種方法。目前構建飽和突變體庫的方法有以下三種利用射線輻射或化學誘變劑處理種子等物理或化學的方法；利用反轉座轉座子的細胞培養的方法及利用轉座子或T-DNA的遺傳轉化的方法。其中由於T-DNA的插入拷貝數低、插入位點的穩定遺傳及插入位點的隨機等特性，採用T-DNA的遺傳轉化創造突變體的方法是目前構建水稻飽和突變體庫的常用方法(Wuetal.Developmentofenhancertraplinesforfunctionalanalysisofthericegenome.PlantJ，2003，35418-427；JeonJSetal.T-DNAinsertionalmutagenesisforfunctionalgenomicsinrice.PlantJ，2000，22561-570；SallaudCetal.HighlyefficientproductionandcharacterizationofT-DNAplantsforrice(OryzasativaL.)functionalgenomics.TheroApplGenet，2003，1061396-1408)。對已有的突變體庫開展表型突變體的篩選，通過正向遺傳學的方法來鑑定重要的發育調控功能基因是開展基因功能研究的有效方法之一。基於水稻全基因組測序已完成，篩選突變體庫來闡釋基因的功能已顯端倪(LeeSYetal.FunctionalanalysisofthefloweringtimegeneOsMADS50，theputativeSUPPRESSOROFOVEREXPRESSIONOFCO1/AGAMOUS-LIKE20(SOC1/AGL20)orthologinrice.PlantJ，2004，38745-764；JungKHetal.RiceUndevelopedTapetumlIsaMajorRegulatorofEarlyTapetumDevelopment.PlantCell，2005，172705-2722)。植物花葯的發育是一個多層次多步驟的過程，它包括花粉囊壁的發育、花粉母細胞的發育、小孢子的產生、花粉粒的成熟等等過程，其中任何一個步驟發育不正常，都有可能造成整個植株雄性不育。花粉發育這一複雜過程涉及到許多基因，了解這些基因在其發育過程中所起的生理生化方面的功能，將對花粉發育有個更為清晰的認識，這將有很大的理論和實際應用價值。目前，通過對雄性不育突變體的研究，已在擬南芥、玉米、水稻等植物中克隆了一些影響雄蕊發育的基因(ChaubalRetal.Thetransformationofanthersinthemscalmutantofmaize.Planta，2003，216778-788；SchiefthalerUetal.MolecularanalysisofNOZZLE，ageneinvolvedinpatternformationandearlysporogenesisduringsexorgandevelopmentinArabidopsisthaliana.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1999，9611664-11669；YangSLetal.TAPETUMDETERMINANT1isrequiredforcellspecializationintheArabidopsisanther.PlantCell，2003，152792-2804；ZhaoDZetal.Theexcessmicrosporocyteslgeneencodesaputativeleucine-richrepeatreceptorproteinkinasethatcontrolssomaticandreproductivecellfatesintheArabidopsisanther.GenesDev，2002，162021-2031；YangXetal.TheArabidopsisMALEMEIOCYTEDEATH1geneencodesaPHD-fingerproteinthatisrequiredformalemeiosis.PlantCell，2003，151281-1295；NonomuraKetal.ThenovelgeneHOMOLOGOUSPAIRINGABERRATIONINRICEMEIOSIS1ofriceencodesaputativecoiled-coilproteinrequiredforhomologouschromosomepairinginmeiosis.PlantCell，2004，161008-1020；JungKHetal.RiceUndevelopedTapetumlIsaMajorRegulatorofEarlyTapetumDevelopment.PlantCell，2005，172705-2722)。這些基因往往都是某一重要代謝途徑的關鍵酶類或是調節下遊基因表達的轉錄因子等等，它們的突變失活造成雄蕊發育的某一步驟受阻，最終表現為完全的雄性不育。水稻是重要的糧食作物，是世界上約一半以上的人口的主食，中國人口眾多又是水稻生產的糧食大國，因此提高水稻產量是當前我國水稻研究的主要目的之一。雜交育種是提高水稻產量的重要途徑，而雄性不育在雜交育種中又有很重要的作用。利用雄性不育系進行雜交制種，能節約勞力、財力，保證雜交種的純度，在雄性不育的基礎上開展雜交優勢的利用是水稻作物育種的主要方向之一。目前，獲得雄性不育系材料主要有以下幾種途徑尋找和利用自然界產生的雄性不育變異株；通過種間或種內雜交和連續多代回交的方法創造不育系；用人工誘變的方法創造不育系；用細胞工程的方法創造不育系；用基因工程的方法創造不育系。其中用基因工程的方法創造不育資源具有所需時間短，只改變目標性狀，可同時得到新的有利性狀及可自由配組等優越性。本發明通過篩選T-DNA突變體庫，分離並克隆了控制水稻育性的基因，豐富了可供利用的基因資源，並通過基因工程的方法創造雄性不育系，對生產雄性不育水稻及其在水稻雜交育種上的應用都有重要意義。
發明內容本發明的目的是在於提供一種控制水稻花粉育性基因OsNMS，其具有如SEQIDNo.1所示的DNA序列，也包括與SEQIDNo.1所示的DNA序列至少有50％同源性的基因序列；也包括由於添加、取代、插入或缺失一個或多個核苷酸而產生的突變體等位基因或衍生物，還包括具有相同功能並能達到本發明目的的基因序列。本發明也包括與SEQIDNo.2所示的胺基酸序列具有50％以上(包括50％)同源性的功能類似物。該基因的失活可影響水稻花粉的正常發育並造成水稻植株的完全不育，因此該基因的克隆有利於了解花粉發育的過程及水稻雄性不育的機理。本發明的另一個目的是控制水稻花粉育性基因OsNMS的轉基因水稻在水稻雜交育種中的應用。具體的說就是利用基因敲除的方法敲除OsNMS基因或利用RNAi技術抑制該基因的表達從而得到完全不育的水稻植株，創造了水稻新的雄性不育系，開拓了水稻雄性不育的資源，並將該資源用以上方法用於其它性狀都比較優良的水稻品種中，得到該品種的不育系，待找到相應的恢復系、保持系，即可利用三系法制出優良的雜交種，使該品種的雜交優勢得到充分利用。為了達到上述目的，本發明採用以下技術措施。一、水稻完全不育突變體的篩選利用增強子捕獲系統的T-DNA載體插入粳稻品種中花11號(OryzasativaL.subsp.japonicacv.Zhonghua11)創建突變體庫，經篩選T1代植株得到完全不育突變體Osnms-1。該突變體在營養生長期與正常單株沒有任何差別，只是在抽穗期花粉不外露，成熟後表現為完全不育。二、突變表型與T-DNA插入的共分離檢測利用Tail-PCR技術(Liuetal.ThermalasymmetricinterlacedPCRAutomatableamplificationandsequencingofinsertendfragmentsfromP1andYACclonesforchromosomewalking.Genomics，1995，25674-681)分離完全不育突變體Osnms-1中T-DNA側翼水稻基因組序列，對該側翼序列進行數據搜索，得到水稻基因組中T-DNA插入位點的序列信息，分別在T-DNA兩端的水稻基因組上設計引物，加上T-DNA末端設計的引物，如圖1a示，引物a+b，b+c配對擴增突變體Osnms-1家系T1及T2代植株，驗證各單株的基因型。結果表明突變體Osnms-1完全不育的突變性狀與該位點T-DNA的純合插入事件共分離。三、插入位點的側翼序列的序列分析和基因預測BLAST分析顯示突變體Osnms-1的側翼序列定位於水稻第10號染色體的BAC克隆OSJNBa0060A14上。插入位點位於OsNMS基因的啟動子區域，離起始密碼子ATG有566bp。預測OsNMS基因的結構如圖1a所示，由11個外顯子和10個內含子組成。該基因編碼一個假定蛋白，BALST分析都沒找到同源基因或同源蛋白，表明OsNMS基因是一個新基因，在NCBI網站(http//www.ncbi.nlm.nih.gov)上也找不到任何EST，顯示該基因可能表達量低或瞬時表達。四、RT-PCR及啟動子轉化驗證基因的表達模式RT-PCR(Reverse-transcriptPCR)分析OsNMS基因在抽穗期的根、莖、葉、葉鞘、稻穗中的表達情況，結果抽穗期時OsNMS基因在根、莖、葉中不表達，而在葉鞘、稻穗中有表達。OsNMS基因在突變體的根、葉、葉鞘、稻穗中均不表達。同時構建啟動子分析載體並轉化，結果在轉基因植株的莖、葉鞘和葉中GFP均不表達，而在花器官中有表達並且僅在花絲、花柱、柱頭及漿片中表達。五、等位突變體的獲得及共分離分析通過BLAST分析在本室構建的突變體資料庫中找到突變體Osnms-1的等位突變體Osnms-2，該突變體的T-DNA插入位點位於OsNMS基因的第4個內含子中，與突變體Osnms-1的插入位點相距約2.8kb。種植突變體Osnms-2家系的T1代群體，觀察到有完全不育的突變單株分離出來，共分離檢測方法及過程同Osnms-1突變體的共分離分析，結果突變體Osnms-2的完全不育的突變表型與目標位點T-DNA的純合插入事件共分離。六、遺傳轉化驗證基因的功能根據預測的OsNMS基因的結構，設計RNAi(RNA幹涉)片段，構建RNAi載體並轉化，結果顯示RNAi的轉基因植株的育性大幅的下降。同時將包含完整的OsNMS基因的片段轉到突變體Osnms-1中進行功能互補試驗，結果陽性的轉基因植株的育性又大幅上升，完全不育的突變性狀得到恢復。由上可知，由於T-DNA的純合插入造成OsNMS基因的失活，而OsNMS基因的失活造成植株的完全不育，同時應用RNAi抑制技術抑制OsNMS基因的表達，可以得到完全不育的水稻植株。因此利用基因敲除的方法敲除OsNMS基因或利用RNAi技術抑制該基因的表達可創造水稻新的雄性不育系，豐富了水稻雄性不育的資源。本發明的優點通過對T-DNA突變體庫的篩選，克隆了一個控制水稻育性的基因OsNMS，該基因的克隆有利於了解花粉發育的過程及水稻雄性不育的機理；通過基因工程的方法造成OsNMS基因的失活可創造水稻新的雄性不育系，拓展了雄性不育的資源為水稻雜交育種提供一種雄性不育的資源。圖1a.顯示OsNMS基因的結構示意圖及T-DNA插入位點。黑色長方形顯示OsNMS基因的11個外顯子(Exons)，ATG、TAA分別代表該基因的起始及終止位點。倒置的三角形代表T-DNA的插入位點，RB、RL分別表示T-DNA的右邊界及左邊界。引物a、b、c是用來檢測轉化株後代的基因型，其中a+b產物大小約為1kb，b+c產物大小約為0.9kb。RT-PCR引物p1、p2是用來檢測OsNMS基因的表達模式。圖1b.顯示成熟期突變體Osnms-1的突變表型，完全不育。左邊是突變體osnms，右邊是野生型對照。圖1c.顯示成熟期突變體Osnms-1稻穗，花粉不外露。圖1d.顯示成熟期野生型對照的稻穗。圖1e.顯示抽穗期野生型對照花粉的I2-KI(1％)染色結果，所有花粉都著色，花粉粒呈圓形，形態正常。圖1f.顯示抽穗期突變體Osnms-1花粉的I2-KI(1％)染色結果，所有花粉都不著色，花粉粒皺褶，形態也不正常。圖2a.顯示獨立轉化子T1代分離群體的基因型情況。1-20代表各分離單株株號，Wwildtype，Hheterozygousplant，Mhomozygousplant。圖2b.顯示T1代中第1號單株(W)的後代(T2)的基因型情況。1-20表示T2代各單株株號。圖2c.顯示T1代中第12號單株(H)的後代(T2)的基因型情況。1-40表示T2代各單株株號。其中紅色的株號為3、12、15、16、28、36、39、40的表型為完全不育。圖2d.顯示T1代中第13號單株(H)的後代(T2)的基因型情況。1-40表示T2代各單株株號。其中紅色的株號為13、17、26、27、28、31、32的表型為完全不育。圖2e.顯示RT-PCR初步分析OsNMS基因的表達模式。所用引物為圖1a中的p1、p2。圖2f.顯示轉啟動子的植株開花期葉片GFP不表達。圖2g.顯示部分轉啟動子的植株開花期花器官GFP不表達。圖2h.顯示部分轉啟動子的植株開花期花器官GFP表達，且僅在花絲、花柱、柱頭及漿片中表達(綠色顯示GFP表達)。具體實施例方式本發明是利用本室構建的水稻T-DNA隨機插入的突變體庫，通過正向遺傳學的方法分離並克隆影響水稻花粉發育的新基因OsNMS。突變體庫的構建是按照Wuetal.(Wuetal.Developmentofenhancertraplinesforfunctionalanalysisofthericegenome.PlantJ，2003，35418-427)所描述的方法構建而成。為進一步理解本發明的內容與目的，下面就以實施事例詳細介紹本發明的具體技術實施步驟。實施例1突變體的篩選突變體庫轉化當代即T0代植株分別分單株收種後，在正常栽培條件下種植下一代即T1代，每份材料種2行，每行10株，共20株，按5×8寸的栽種密度進行種植。在水稻整個生育期田間記載突變體的表型，對於同一家系內突變植株的表型一致、符合典型的3∶1分離的家系及時抽提各單株的DNA進行PCR陽性檢測，對於一個家系內的所有突變體單株PCR均為陽性的家系作為後續研究的材料。PCR陽性檢測的引物位於T-DNA區段上，一對引物分別是GV-F5-GGCATCGGTAAACATCTGCT-3，GV-R5-GCCTCAAGAAGCTCAAGTGC-3，PCR產物大小為611bp，反應體系的總體積為20μl，DNA1模板1ul(約50ng)、1×Taq酶反應緩衝液、25mMMgCL21.2ul、2mMdNTP1.5ul、10uM引物0.2ul、0.3單位Taq酶。反應程序為94℃變性5min，94℃45s、55℃45s、72℃1min30cycles，72℃延伸5min。通過本例得到一個突變體Osnms-1，該突變體從外觀上看在營養生長期與野生型對照沒有任何區別。在生殖生長時期，突變體與對照在抽穗期、穗型等方面也沒有明顯差別，但在抽穗期，突變體表現為花粉不外露，如圖1c所示，而對照如圖1d所示。取抽穗期的花粉用1％的I2-KI染色後，顯微觀察如圖1e及1f所示，其中圖1e為對照株的花粉染色結果，所有花粉都著色，且花粉粒呈正常的圓形，圖1f為突變體Osnms-1的花粉染色結果，所有花粉都不著色，且花粉粒皺褶，形態不正常，顯示該突變體是雄性不育的突變體。至成熟時，突變體Osnms-1表現為完全不育，如圖1b所示。實施例2突變體T-DNA側翼水稻基因組序列的分離針對實施例1中得到的突變家系，通過Tai1-PCR的方法(Liuetal.ThermalasymmetricinterlacedPCRAutomatableamplificationandsequencingofinsertendfragmentsfromP1andYACclonesforchromosomewalking.Genomics，1995，25674-681)分離T-DNA插入位點的側翼序列，所用的位於T-DNA左邊界上的錨定引物從內向外依次為L115-GCAAAGAAATAGAGTAGATGCCGACCG-3，L215-GTTTCTCCATAATAATGTGTGAGTAGTTCCC-3，LBT35-CCAGTACTAAAATCCAGATCCCCCGAAT-3，隨機引物為AD2a5-(AGCT)GTCGA(GC)(AT)GA(AGCT)A(AT)GAA-3。反應體系為第一輪DNA模板1.0μl；10×buffer2.0μl、2mMdNTP2.0μl、25mMMgCl22.0μl、10μM特異性引物L110.2μl、100μM簡併引物AD2a0.2μl、Taq酶(Takara公司)1u，加ddH2O至20μl。第二輪DNA模板1.0μl、10×buffer2.0μl、2mMdNTP2.0μl、25mMMgCl22.0μl、50％甘油2.0μl、10μM特異性引物L210.2μl；100μM簡併引物AD2a0.2μl、Taq酶1u，加ddH2O至20μl。第三輪DNA模板1.0μl、10×buffer2.0μl、2mMdNTP1.5μl、25mMMgCl21.2μl、50％甘油2.0μl、10μM特異性引物LBT30.2μl、100μM簡併引物AD2a0.2μl、Taq酶1u，加ddH2O至20μl。三輪反應程序是按照Liuetal(Liuetal.ThermalasymmetricinterlacedPCRAutomatableamplificationandsequencingofinsertendfragmentsfromP1andYACclonesforchromosomewalking.Genomics，1995，25674-681)所述基礎上稍加改進。總體積20ul的Tail-PCR產物取7ul在0.8％的瓊脂糖膠中檢測是否有有效擴增，挑出有有效擴增的剩餘產物用去磷酸化酶(SAPTakara公司)及核酸外切酶1(EXOINEB公司)處理後送上海基因中心測序，測序引物為NTLB55-AATCCAGATCCCCCGAATTA-3。通過本例得到突變體Osnms-1家系T-DNA的插入位點的側翼序列，對側翼序列數據在NCBI網站(http//www.ncbi.nlm.nih.gov)上做BLAST分析顯示該位點位於水稻第10染色體的BAC克隆OSJNBa0060A14上。根據預測T-DNA位於一個開放讀碼框(ORF)的上遊區域，離ATG有566bp，如圖1a所示，該ORF由11個外顯子(Exon)組成，Exon1至Exon11的大小分別為30bp、1051bp、560bp、148bp、90bp、61bp、150bp、59bp、135bp、92bp、69bp。內含子Intron1至Intron10的大小分別為118bp、39bp、108bp、1030bp、123bp、92bp、120bp、518bp、745bp、90bp。該基因OsNMS編碼一個假定蛋白(Hypotheticalprotein)，同源性分析找不到任何同源基因或同源蛋白，顯示OsNMS是一個新基因。在NCBI網站(http//www.ncbi.nlm.nih.gov)上也找不到任何EST，顯示該基因可能表達量低或瞬時表達。Tail-PCR分離得到osnms-1突變體的側翼序列如下ATCGTCGATTAGTACATTAAAAACGTCCGCAATGTGTTATTTAAGTTGTCTAAGCGTCAATTTGTTTACACCACAATATATCAAAAGCAAGTTGTGTAGCAATCAAATCATCCAGCTTAGAAATTTAGGTGTGGTACTGTGGTTATGTAATGCAGCTCCACCACCACTGTAGTAATTTAAAGTTGACAGTTGTAGTACAACGATGCAGTTATTTGTTACTACTTTTCAATGCTAGTTTCTTTTCTCTCGACGATCTTTGGAACGGCCATTTTTGTTTTTAGGAATTAAAAATTGTATGGTTAAAAGACTTGGCCATATCCAATTGCATTCTTAGGGTGTTATAGATGCTCAACACATGCGCCGACCCCTTTGAGGTTGTGGCTGCTCTTGAAGGGGGCTTTTATGCCCATCATTTGTTGAGACGAGGGCAGTGATTCGGGGGATTTGGATTTTAGTCCTGCGGGGCCAAGGCCCATGCTTAAATAAACCCTGCTTTGTTCCATCTCTGTTTGTATTTGCTACTCTTAAGGGTTTTGGTGAGGGATTGTTTCTCATCTAGGTATTTTGTGTTATCCACCTCCCTGGGTATTCACTATCACC實施例3T-DNA與突變性狀的共分離驗證根據實施例2得到的突變體Osnms-1家系T-DNA定位結果，設計基因組引物a5-GAGTGGAGCCTGGATTGTGT-3，引物b5-TTGTGACGCCAACTGATACC-3與T-DNA左邊界上引物c5-AATCCAGATCCCCCGAATTA-3配對擴增驗證T1代及T2代各單株的基因型，如圖1a所示。並將基因型與表型對應，看是否符合共分離。引物a+b的產物大小約為1kb，引物b+c的產物大小約為0.9kb，由於T-DNA轉入基因組的片段約有10kb，所以當T-DNA插入a與b之間，則由於片段過大而不能擴增。因此，當一個單株分別用引物a+b及引物b+c擴增後出現三種情況，情況1a+b有目標帶擴增，而b+c則沒有；情況2a+b及b+c都有目標帶擴增；情況3a+b沒有目標帶擴增，而b+c則有目標帶擴增。該三種情況分別對應三種基因型，即情況1為野生型(W)，該位點沒有T-DNA的插入；情況2為雜合型(H)；情況3為突變型(M)。基於以上所述，突變Osnms-1家系T1代20株單株的基因型如圖2a所示。其中屬於野生型單株有1、2、6、11、14、18；屬於雜合型單株有3、5、9、12、13、16、17、19；屬於突變型單株有4、7、8、10、15、20。突變體Osnms-1家系T1代突變性狀記錄為4、7、8、10、15、20完全不育。T-DNA插入水稻基因組，造成內源基因的失活，往往在轉化當代T0代看不到突變表型，而在T1中出現1∶2∶1的分離，其中約1/4的單株由於突變位點的純合而可能表現出突變表型。由此可見，突變體Osnms-1家系T1分離群體的完全不育的突變表型與基因型完全對應。且該突變屬於單基因控制的隱性突變。由於T1代家系單株較少，為進一步驗證Osnms-1家系的突變表型與基因型的對應關係，將T1代單株進行T2代共分離檢測。在T2代中種植T1代的第1、2、6、11、14號野生基因型單株後代及第3、5、9、12、13、16號雜合基因型單株的後代，其中前者每株系種20株，後者每株系種40株，其他種植方式及表型觀察同T1代。結果T2代的突變表型與T1代觀測到的突變表型完全一致且與基於PCR檢測的基因型完全對應，如圖2b、2c、2d所示，也即是所有野生型單株後代都是野生型基因型，正常表型；所有雜合型單株的後代都有突變分離，且分離後的突變表型與基因型也完全對應。由此可見，突變體Osnms-1家系的完全不育的突變性狀與T-DNA的插入純合基因型共分離，證明OsNMS基因的突變，影響花粉粒的發育，造成植株的完全不育。實施例4等位突變體的獲得及共分離驗證為進一步證明OsNMS基因與不育表型的關係，在本室的T-DNA突變體資料庫中(http//rmd.ncpgr.cn/)，通過BLAST分析，找到突變體Osnms-1的等位突變體Osnms-2，突變體Osnms-2的T-DNA插入位點位於OsNMS基因的第4個內含子中，與突變體Osnms-1的插入位點相距約2.8kb。同突變體Osnms-1類似，種植突變體Osnms-2家系的T1代分離群體100株，結果有22株表現為完全不育，其抽穗期花粉粒皺褶，碘染也都全不著色，PCR檢測也僅有這22株的基因型為突變基因型。由此可見，突變體Osnms-2的不育表型與突變基因型也完全對應。實施例5RT-PCR驗證OsNMS基因的表達模式。由於OsNMS基因在公共資料庫中沒有同源基因及EST，因此用半定量RT-PCR(Reverse-transcriptPCR)的方法分析該基因的表達模式，RT-PCR所用引物p1位於Exon7上，引物p2位於Exon9上，如圖1a所示。引物p1為5-GTTAGTAGTGGTGCTAGGAAGG-3；引物p2為5-GCTTGTCAGCAACTCCCTTA-3。其中p1+p2擴反轉錄產物的產物大小為329bp，p1+p2擴基因組的產物大小為967bp。又由於突變體Osnms-1的突變株與對照單株在株高，分櫱數，葉色，葉形等方面沒有差別，而在生殖生長時影響花粉的發育，因此樣品取於抽穗期的根、莖、葉、葉鞘、稻穗。RT-PCR的程序如下94℃變性5min，94℃45s、55℃45s、72℃1min38cycles，72℃延伸5min，RT-PCR的檢測結果如圖2e所示。由此可見，抽穗期時OsNMS基因在根、莖、葉中不表達，而在葉鞘、稻穗中有表達。OsNMS基因在突變體的根、葉、葉鞘、稻穗中均不表達，顯示T-DNA的插入雖位於該基因的上遊，但亦可造成該基因的失活，進而表現出完全不育的表型。實施例6OsNMS基因啟動子的表達分析。為進一步了解OsNMS基因的表達模式，將OsNMS基因啟動子區域通過PCR擴增出來，PCR引物分別為F78PR15-TTGGTCGACAAATGAATCGGGGAGACTGACA-3，F78PL15-CTGAAGCTTAGGTGCAGCTTTTGGGATAAT-3，左右引物兩端分別帶有HindIII及SalII的酶切位點及保護鹼基。PCR反應體系的總體積為20μl，水稻基因組DNA模板1ul(約50ng)、1×Taq酶反應緩衝液、25mMMgCL21.2ul、2mMdNTP1.5ul、10uM引物0.2ul、50％甘油2ul、0.3單位rTaq酶(Takara公司)。反應程序為94℃變性3min，94℃45s、55℃60s、72℃90s30cycles，72℃延伸5min，共擴10管，收集PCR產物於1.5ml離心管，加等體積24∶1氯仿異戊醇，輕搖5分鐘，12000rpm離心10分鐘，吸上清，加2倍體積95％乙醇，1/10體積醋酸鈉，-20℃放置30分鐘，12000rpm離心15分鐘，棄上清，加500ul75％乙醇放置5min，12000rpm離心5分鐘，棄上清，涼幹，加10ulddH2O溶解。再將純化的PCR產物用HindIII及SalI酶切，再純化，回收，再與已用HindIII及SalI酶切過的p1381進行連接。16℃反應約10小時，反應結束加0.5ulproteinaseK，37℃，10分鐘。取1ul電轉入大腸桿菌(E.Coli)DH10B(購自美國Invitrogen公司)，挑單克隆，擴大培養提取質粒，PCR驗證是否含有目標片段，把構建好的載體電轉入農桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)EHA105，轉化水稻粳稻品種中花11號(Hiei等，Efficienttransformationofrice(OryzasativaL.)mediatedbyAgrobacteriumandsequenceanalysisoftheboundariesoftheT-DNA.PlantJ，1994，6271-282)。農桿菌介導的遺傳轉化步驟如下1.愈傷誘導(1)將成熟的水稻種子去殼，然後依次用70％的乙醇處理1分鐘，0.15％氯化汞(HgCl2)15分鐘；(2)滅菌水洗種子4-5次；(3)將種子放在誘導培養基上；(4)置於黑暗處培養4周，溫度24-26℃。2.愈傷繼代挑選亮黃色、緊實且相對乾燥的胚性愈傷，放於繼代培養基上黑暗下培養2周，溫度24-16℃。3.預培養挑選緊實且相對乾燥的胚性愈傷，放於預培養基上黑暗下培養5天，溫度24-26℃。4.農桿菌培養(1)在帶有對應抗性選擇的LA培養基上預培養農桿菌EHA105兩天，溫度28℃；(2)將農桿菌轉移至懸浮培養基裡，28℃搖床上培養2-3小時。5.農桿菌侵染(1)將預培養的愈傷轉移至滅菌好的瓶子內；(2)調節農桿菌的懸浮液至OD6000.8-1.0；(3)將愈傷在農桿菌懸浮液中浸泡20分鐘；(4)轉移愈傷至滅菌好的濾紙上吸乾；然後放置在共培養基上培養3天，溫度19-20℃。6.愈傷洗滌和選擇培養(1)滅菌水洗滌愈傷至看不見農桿菌；(2)浸泡在含500ppm頭孢黴素的滅菌水中30分鐘；(3)轉移愈傷至滅菌好的濾紙上吸乾；(4)轉移愈傷至選擇培養基上選擇2-3次，每次2周。(第一次頭孢黴素篩選濃度為500ppm，第二次以後為300ppm，潮黴素每次均為250ppm)7.分化(1)將抗性愈傷轉移至預分化培養基上黑暗處培養5-7周；(2)轉移預分化培養的愈傷至分化培養基上，光照下培養，溫度26℃。8.生根(1)剪掉分化時產生的根；(2)然後將其轉移至生根培養基中光照下培養2-3周，溫度26℃。9.移栽洗掉根上的殘留培養基，將具有良好根系的幼苗轉入溫室，同時在最初的幾天保持水分溼潤。本發明共獲得獨立轉基因水稻植株30株，在苗期檢測轉基因植株GFP的表達情況，結果根和葉中GFP均不表達。在抽穗開花期檢測轉基因植株GFP的表達情況，結果莖、葉鞘和葉中GFP均不表達，而在花器官中有表達並且僅在花絲、花柱、柱頭及漿片中表達，如圖2f、2g、2h所示GFP的表達情況(綠色顯示GFP表達)，表達比例為14/30。Osnms-1突變體在營養生長期與對照沒有任何差別，而只在生殖生長期影響花粉的發育，故可推測OsNMS基因應該會在水稻花器官中表達。OsNMS基因啟動子的表達分析，證實了OsNMS基因確實是在花器官中表達，同時OsNMS基因在花器官中某些部位的表達與突變表型又吻合很好。首先，突變體的花粉碘染後不著色，顯微觀察花粉粒皺褶，顯示花粉粒中缺乏澱粉之類的營養物質的儲備，而水稻花絲的主要作用之一是給花粉粒運輸營養物質；其次，突變體在開花期花粉不外露，而水稻漿片的主要作用之一是在開花期吸水膨脹，撐開水稻的內外稃，使花粉外露，便於傳粉受精。實施例7RNAi(RNA幹涉)載體轉化驗證OsNMS基因功能根據預測的基因結構，在OsNMS基因的第3個外顯子上設計一對RNAi引物F78iR5-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggctCTAATGTTGGGGCTCGAAAG-3；F78iL5-ggggaccactttgtacaagaaagctgggtCAAAATCATCTGGCATGTCG-3。以轉化受體中花11號基因組為模板擴出RNAi片段構建RNAi載體進行轉化。PCR反應體系的總體積為20μl，水稻基因組DNA模板1ul(約50ng)、1×Taq酶反應緩衝液、25mMMgCL21.2ul、2mMdNTP1.5ul、10uM引物0.2ul、50％甘油2ul、0.3單位rTaq酶(Takara公司)。反應程序為94℃變性3min，94℃45s、55℃45s、72℃60s30cycles，72℃延伸5min，共擴10管，收集PCR產物於1.5ml離心管，加等體積24∶1氯仿異戊醇，輕搖5分鐘，12000rpm離心10分鐘，吸上清，加2倍體積95％乙醇，1/10體積醋酸鈉，-20℃放置30分鐘，12000rpm離心15分鐘，棄上清，加500ul75％乙醇放置5min，12000rpm離心5分鐘，棄上清，涼幹，加10ulddH2O溶解。再將純化的PCR產物連接到RNAi載體pHellsgate4上，連接體系為gatwayBPclonase1ul，pHellsgate4vector0.5ul，BPreactionbuffer1ul，PCR純化產物2.5ul，16℃反應約10小時，反應結束加0.5ulproteinaseK，37℃，10分鐘。取1ul電轉入大腸桿菌(E.Coli)DH10B(購自美國Invitrogen公司)，挑單克隆，擴大培養提取質粒，PCR驗證是否含有目標片段，把構建好的載體電轉入農桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)EHA105，轉化水稻粳稻品種中花11號(Hiei等，Efficienttransformationofrice(OryzasativaL.)mediatedbyAgrobacteriumandsequenceanalysisoftheboundariesoftheT-DNA.PlantJ，1994，6271-282)。農桿菌介導的遺傳轉化步驟基本同實施例6中轉化步驟，只是選擇培養時用新黴素而非潮黴素篩選。本發明共獲得獨立轉基因水稻植株46株，PCR檢測陽性植株為43株，陽性植株與陰性植株在營養生長期無明顯差別，但在成熟期部分陽性植株完全不育或高度不育，具體各轉化單株的結實率統計情況見下表。RNAi轉基因植株T0代結實率統計情況3株陰性株的結實率分別為76.9％、84.4％、83.9％，屬於正常育範疇。由此可見，通過RNAi技術抑制了OsNMS基因的表達，造成了水稻植株的育性的明顯降低，進一步證明了OsNMS基因為控制水稻花粉育性的基因，並由此方法可以創建水稻的雄性不育系，用於水稻配製雜交種。實施例8互補實驗驗證OsNMS基因功能根據OsNMS基因的序列，在網站(http//www.genome.arizona.edu)上找到包含該基因的日本晴BAC克隆OSJNBa0076L08並提取日本晴BAC克隆OSJNBa0076L08質粒5μg，使用限制性內切酶SalI及NheI(Takara公司)完全消化質粒，將酶切產物使用0.8％瓊脂糖凝膠電泳(40v，10小時)，挖取11.6kb的DNA片斷回收。取回收產物100ng，與經過限制性內切酶SalI及XbaI(Takara公司)消化過的雙元載體pCABIA2301載體50ng使用T4DNA連接酶(NEB公司)於16℃進行連接反應，pCAMBIA2301載體由澳大利亞CAMBIA實驗室(CenterfortheApplicationofMolecularBiologytoInternationalAgriculture)惠贈。反應進行16小時後，取連接產物2μl電轉化大腸桿菌感受態細胞DH10B(購自美國Invitrogen公司)，轉化產物進行蘭白斑篩選。挑取白色轉化子，使用OsNMS基因特異的引物a和b組合進行PCR陽性克隆的篩選，PCR反應條件如下94℃變性5min，94℃45s、55℃45s、72℃1min30cycles，72℃延伸5min。獲得了用於轉化的質粒pCNMS，這個核酸片段包含完整的OsNMS基因ORF區，將這個質粒20ng通過電擊的方法轉入農桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)株系EHA105中，使用農桿菌介導的遺傳轉化方法轉化osnms突變體(Hiei等，Efficienttransformationofrice(OryzasativaL.)mediatedbyAgrobacteriumandsequenceanalysisoftheboundariesoftheT-DNA.PlantJ，1994，6271-282)，同時將不含OsNMS基因的空載體轉化osnms突變體，得到的轉基因植株作為對照。農桿菌介導的遺傳轉化步驟同實施例6中轉化步驟。本發明共獲得獨立轉OsNMS基因水稻植株66株，PCR檢測陽性植株為61株，轉空載體的轉基因植株32株。結果轉空載體的轉基因植株全部表現為完全不育，而陽性的轉OsNMS基因水稻植株有48株育性得到恢復，結實率為2-78.6％，而陰性的轉OsNMS基因水稻植株也都完全不育。互補實驗T0代轉基因植株結實率統計具體情況見下表。互補實驗轉基因植株T0代結實率統計情況由此可見，通過互補實驗，使Osnms-1突變體的不育性狀得到恢復，更進一步證明了OsNMS基因為控制水稻花粉育性的基因。本發明所涉及到的農桿菌介導的遺傳轉化試劑及配方如下(1)試劑和溶液縮寫6-BA(6-BenzylaminoPurine，6-苄基腺嘌呤)；KT(Kinetin，激動素)；NAA(Napthaleneaceticacid，萘乙酸)；IAA(Indole-3-aceticacid，吲哚乙酸)；2，4-D(2，4-Dichlorophenoxyaceticacid，2，4-二氯苯氧乙酸)；AS(Acetosringone，乙醯丁香酮)；CH(CaseinEnzymaticHydrolysate，水解酪蛋白)；G-418(新黴素)；HN(HygromycinB，潮黴素)；DMSO(DimethylSulfoxide，二甲基亞碸)；N6max(N6大量成分溶液)；N6min(N6小量成分溶液)；MSmax(MS大量成分溶液)；MSmin(MS小量成分溶液)(2)組織培養的溶液配方1)N6max母液[10倍濃縮液(10X)]硝酸鉀(KNO3)28.3g磷酸二氫鉀(KH2PO4)4.0g硫酸銨((NH4)2SO4)4.63g硫酸鎂(MgSO4·7H2O)1.85g氯化鈣(CaCl2·2H2O)1.66g逐一溶解，然後在20-25℃下定容至1000ml。2)N6min母液[100倍濃縮液(100X)]碘化鉀(KI)0.08g硼酸(H3BO3)0.16g硫酸錳(MnSO4·4H2O)0.44g硫酸鋅(ZnSO4·7H2O)0.15g在20-25℃下溶解並定容至1000ml。3)Fe2EDTA貯存液(100X)在一個大三角瓶中加入300ml蒸餾水和硫酸鐵(FeSO4·7H2O)2.78g在另一個大三角瓶中加入300ml蒸餾水並加熱至70℃，然後加入乙二銨四乙酸二鈉(Na2EDTA·2H2O)3.73g在它們都溶解後混合在一起，70℃水浴中保持2小時，定容至1000ml，4℃保存備用。4)維生素貯存液(100X)煙酸(Nicotinicacid)0.1g維生素B1(ThiamineHCl)0.1g維生素B6(PyridoxineHCl)0.1g甘氨酸(Glycine)0.2g肌醇(Inositol)10g加水定容至1000ml，4℃保存備用。5)MSmax母液(10X)硝酸銨(NH4NO3)16.5g硝酸鉀19.0g磷酸二氫鉀1.7g硫酸鎂3.7g氯化鈣4.4g在20-25℃下溶解並定容至1000ml。6)MSmin母液(100X)碘化鉀0.083g硼酸0.62g硫酸錳0.86g鉬酸鈉(Na2MoO4·2H2O)0.025g硫酸銅(CuSO4·5H2O)0.0025g在20-25℃下溶解並定容至1000ml。7)2，4-D貯存液(1mg/ml)2，4-D100mg.1ml1N氫氧化鉀溶解5分鐘，然後加10ml蒸餾水溶解完全後定容至100ml，在20-25℃保存。8)6-BA貯存液(1mg/ml)6-BA100mg.1ml1N氫氧化鉀溶解5分鐘，然後加10ml蒸餾水溶解完全後定容至100ml，在20-25℃保存。9)NAA貯存液(1mg/ml)NAA100mg.1ml1N氫氧化鉀溶解5分鐘，然後加10ml蒸餾水溶解完全後定容至100ml，4℃保存備用。10)IAA貯存液(1mg/ml)IAA100mg.1ml1N氫氧化鉀溶解5分鐘，然後加10ml蒸餾水溶解完全後定容至100ml，4℃保存備用。11)葡萄糖貯存液(0.5g/ml)葡萄糖125g蒸餾水溶解定容至250ml，滅菌後4℃保存備用。12)AS貯存液AS0.392gDMSO10ml分裝至1.5ml離心管內，4℃保存備用。13)1N氫氧化鉀貯存液氫氧化鉀5.6g蒸餾水溶解定容至100ml，在20-25℃保存備用。(3)培養基配方1)誘導培養基N6max母液(10X)100mlN6min母液(100X)10mlFe2+EDTA貯存液(100X)10ml維生素貯存液(100X)10ml2，4-D貯存液2.5ml脯氨酸(Proline)0.3gCH0.6g蔗糖(Sucrose)30gPhytagel3g加蒸餾水至900ml，1N氫氧化鉀調節pH值到5.9，煮沸並定容至1000ml，分裝到50ml三角瓶(25ml/瓶)，封口滅菌。2)繼代培養基N6max母液(10X)100mlN6min母液(100X)10mlFe2+EDTA貯存液(100X)10ml維生素貯存液(100X)10ml2，4-D貯存液2.0ml脯氨酸0.5gCH0.6g蔗糖30gPhytagel3g加蒸餾水至900ml，1N氫氧化鉀調節pH值到5.9，煮沸並定容至1000ml，分裝到50ml三角瓶(25ml/瓶)，封口滅菌。3)預培養基N6max母液(10X)12.5mlN6min母液(100X)1.25mlFe2+EDTA貯存液(100X)2.5ml維生素貯存液(100X)2.5ml2，4-D貯存液0.75mlCH0.15g蔗糖5g瓊脂粉(Agarose)1.75g加蒸餾水至250ml，1N氫氧化鉀調節pH值到5.6，封口滅菌。使用前加熱溶解培養基並加入5ml葡萄糖貯存液和250μlAS貯存液，分裝倒入培養皿中(25ml/皿)。4)共培養基N6max母液(10X)12.5mlN6min母液(100X)1.25mlFe2+EDTA貯存液(100X)2.5ml維生素貯存液(100X)2.5ml2，4-D貯存液0.75mlCH0.2g蔗糖5g瓊脂粉1.75g加蒸餾水至250ml，1N氫氧化鉀調節pH值到5.6，封口滅菌。使用前加熱溶解培養基並加入5ml葡萄糖貯存液和250μlAS貯存液，分裝倒入培養皿中(25ml/皿)。5)懸浮培養基N6max母液(10X)5mlN6min母液(100X)0.5mlFe2+EDTA貯存液(100X)0.5ml維生素貯存液(100X)1ml2，4-D貯存液0.2mlCH0.08g蔗糖2g加蒸餾水至100ml，調節pH值到5.4，分裝到兩個100ml的三角瓶中，封口滅菌。使用前加入1ml葡萄糖貯存液和100μlAS貯存液。6)選擇培養基N6max母液(10X)25mlN6min母液(100X)2.5mlFe2+EDTA貯存液(100X)2.5ml維生素貯存液(100X)2.5ml2，4-D貯存液0.625mlCH0.15g蔗糖7.5g瓊脂粉1.75g加蒸餾水至250ml，調節pH值到6.0，封口滅菌。使用前溶解培養基，加入250μl50mg/ml的新黴素(G-418)或潮黴素(Hgromycin)和500ppm頭孢黴素，分裝倒入培養皿中(25ml/皿)。7)預分化培養基N6max母液(10X)25mlN6min母液(100X)2.5mlFe2+EDTA貯存液(100X)2.5ml維生素貯存液(100X)2.5ml6-BA貯存液0.5mlKT貯存液0.5mlNAA貯存液50μlIAA貯存液50μlCH0.15g蔗糖7.5g瓊脂粉1.75g加蒸餾水至250ml，1N氫氧化鉀調節pH值到5.9，封口滅菌。使用前溶解培養基，加入250μl50mg/ml的新黴素(G-418)或潮黴素(Hgromycin)和300ppm頭孢黴素，分裝倒入培養皿中(25ml/皿)。8)分化培養基N6max母液(10X)100mlN6min母液(100X)10mlFe2+EDTA貯存液(100X)10ml維生素貯存液(100X)10ml6-BA貯存液2mlKT貯存液2mlNAA貯存液0.2mlIAA貯存液0.2mlCH1g蔗糖30gPhytagel3g加蒸餾水至900ml，1N氫氧化鉀調節pH值到6.0。煮沸並定容至1000ml，分裝到50ml三角瓶(50ml/瓶)，封口滅菌。9)生根培養基MSmax母液(10X)50mlMSmin母液(100X)5mlFe2+EDTA貯存液(100X)5ml維生素貯存液(100X)5ml蔗糖30gPhytagel3g加蒸餾水至900ml，1N氫氧化鉀調節pH值到5.8。煮沸並定容至1000ml，分裝到生根管中(25ml/管)，封口滅菌。SEQIDNo.1110華中農業大學120一種控制水稻花粉育性基因及應用130一種控制水稻花粉育性基因及應用170PatentInversion3.121012115500212DNA213Oryzasativa4001taatttggtatactattatcccaaaagctgcacctatggaagttgagctgacgaacattc60agaaagtgagtagctatttcctctgctaagctgctggatgctttcctttttcatgttatc120ctttcaccttcagatgttttttcattatagtattaaaaaagttagcatgttatacttttg180taggctacatcaagtgactattggagtttggccagcaatcaatatccatgtggtaaattc240cctaaggtatcagttggcgtcacaattccaaggacgagttctgtatcaagaggcagagat300gctgctagtaccgctgcatttgagaagaacttgtctcagggaactgatggaagatctaga360cctcccaaaatggataatgcttcacttcaggtctctccagaagcagcaaaccacggcgga420tctgctaaagaggttcctaaacctgtccctgctaaggtttctgtatcacaacctgatgat480aatgcaattgagcaaacaggaaccttttcctttggaacaagaagagaacaggacagtcat540cttgatcaattagataggccaccacttgtgagttcccaaggaaagcgtcaagtggaatca600gctgataaaaacaagcccaacagtgaaatgctcaggatgaaactgtgggagatccttggt660ggtacttcacaaaacaaggaggctgttgcctcaccaaatcctgaagatattgagacgcca720tgccaacctaaaagtcaaattgccaatggaccatcttcaggaagacagaaggttttcact780tcacctgttccatataatattaagacaccagctcagtttaatagtcaaacagcgaacaaa840ccatcctctgatccaattgagtcagactccgacagtcctcaagtagttgaagtaagacct900attactcgttcgctggggcgcaagaaagaaccaacaggctccacacatcaggataagagc960gggagtgcaaagaaaccattgtctactcatcgttctacacccaagcagaaaatattggac1020aatgtgtttgccttcaacgataaatgcacacctaaaacagtaggaaaatctgcaaatggt1080gaatctggcagcttgaggaatcttagaagcttgagtaggagggctaaagttgagccaaag1140aaggcacattgttcggacaggatttctcataagactacacaggatgatatggaaagaaag1200gtaccttctaaatatataccatcagagaaaaaaggtgagaaaacaaactccttttcttct1260ttatcccgaacaggaaaaactgctgagagttgttctagaagccctaaaagggagagaagg1320gtgaacacgatggctaatgttggggctcgaaagatgcagttatctgaaaatttactggtc1380aagactctaaatgatggtgaacacaagctctcttctcctcagcttacttcctttaagagc1440aagggaaaatgttcttctatatcgcctcaacagaaggagaatgataatacccacatccct1500gaagcttcagacagaacagcagcaagaaatagttttaactccacaccttctcctgctgct1560aatccatctcctgtactgaggaagtactcatgggaacatgatgagaatcctgcgataaat1620ggtaaatctggacagaaggatgccagtccgttggcagacagattcagcgacatgccagat1680gattttgcaagtcctacttttgcagcaaacataaaaatatccccccacagaagtaaaatg1740ctagacgatgacctatttagctccaaatatccaaaaggtgtgaacaggtcaagatcaact1800tcctttacctcggatccagaatcggagccattggtatgcttcaatctctaaagcagattg1860caactttagtaaatggttctgtttatactctacgtagcagagcaattttatccgtttgac1920actaattgttctactgtccaggacaaaatggagaaaaccaacgagttacctggcagtgaa1980tctcctaactctcaggaggaaagacagaacagaaaacaaccacatctttcacccctttct2040cctattgagagtgaaggggctcaaatttctattccaagctttagaaaaggtcagaacgcc2100atcaatgccaattttctaggctctttattaaaaaggggtagacatgctcctgtcatgttt2160aatgcttccattctagactcaaaggtagccatgctaacttacagtgcactacccccttat2220tctgcatgtggaccatacttattggacagaaatcttatgtatatgtaattatgtatttca2280agcacctcttgaatttatcatttaggtcataggatcaacactggccataatccttataac2340atttgcataatctgtcagatcaatcctgttagtattggtgttcatgatatgtacacttat2400tttattggtgcaaattttgacatcgttacttttggcctcataaacgctcgaagtttgact2460atttgaacattgaattctaactatactggcaagcatatttgcagggttgttagtggtgag2520attgcaaaaaagaaaaaaaatttctgtgtcacccacttcatttacttgacctttttatga2580caattacacattttatgtgacatgataaatgagtatttgtgtttgcttttgctgtcattt2640tcgattagtgctgccttactaagccgttagatgtcttccaggtaacctgctattgtaact2700tgtgttcactggcctgaccgcagaaaatttcctaaattcctttttgtggctgtatagtta2760ggctcttcagattttcagctatgtcttgctgctaggtcacaacatttttttgcaactgaa2820ggatcttgaaacttgaaagtgccaattcatgagagcatgccgtttgtgtgatagctgaca2880agtggcatagcagcaacaagtggcatattctgccatgtgcaagcatatccttagtttaca2940tatatttcatcagaactgtttaccatgttaaattcgctattagtttagttattcgactgt3000attattttcagcctttcagaacattaattacttgagctaaagttctcattggagatgcac3060acatctatctatcttaaagttgcttattcatgccttgtcgctttgtttttcacatgcagg3120atataaatctcataaatggctttcagatgttgacagccctgataaatcttctattgagca3180tctgggccgaaaatcacatctaaaagagggtagaaagggcaaaaggcaattaacttcgcc3240aacccattttgccacctctggtaacactgattactttactgttgtgcttgtgcattcatg3300gttttcggtctgaccaatattttttttctcagggacgcaagaaacaatgtcagacaaaga3360accagaaaaagtcccagaaaactacctaaccaggtttgacttaggtcattgtggcttaaa3420tagtaggtacaaacatgattgctagtttgctacttggattaatttcatttcttgacttcc3480accagggcttttgatcagttagtagtggtgctaggaaggttccaaaccaaaatcaagtct3540gaaacaaggaataaaagttctaagatacttgcagctactggagagataatacgccagcac3600cttgaaggggttgaggggcagatgcaggctgatgtgtaagatcgagtgccagtgccactt3660agaaactgcctcttttcttctttatgcacatgcgattgtatataggccagatatgta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rSer660665670LysIleLeuAlaAlaThrGlyGluIleIleArgGlnHisLeuGluGly675680685ValGluGlyGlnMetGlnAlaAspValAspLysLeuValAsnAlaGly690695700LysSerLysArgLysArgLeuGluSerThrPheGluGluGlnGlnGlu705710715720LysLeuArgIleLeuHisGluLysPheLysGluGluValAsnGlnGln725730735LeuLeuGlyCysLysAsnSerValGluAspPheGluAlaTyrHisAla740745750GluLeuLysGlyValAlaAspLysGlnLysAlaSerHisLysLysLeu755760765LeuGlnAsnAlaGluLysThrValGlyAlaGlnLeuSerAspAlaGlu770775780ThrLysIleAlaGluValGlnLysArgAlaArgLysArgMetLysGly785790795800LeuLysPheValLeuLysGluLeuIleAlaGluThrAlaGlu805810權利要求1.一種分離的基因，其具有與SEQIDNo.1所示核苷酸序列至少50％同源性的序列。2.一種分離的蛋白質，其具有與SEQIDNo.2所示胺基酸序列至少50％同源性的序列。3.一種控制水稻花粉育性基因OsNMS的轉基因水稻在水稻雜交制種中的應用。全文摘要本發明涉及植物基因工程領域。本發明通過篩選T－DNA隨機插入突變體庫，得到完全不育的突變體，克隆並鑑定了控制水稻花粉育性的基因，命名為OsNMS。共分離檢測表明OsNMS基因的T－DNA插入純合與完全不育突變表型是共分離的，RT－PCR及啟動子分析了OsNMS基因的表達模式，RNAi轉基因植株育性的大幅下降，轉基因功能互補實驗使突變體的育性又大幅上升，進一步證明了OsNMS基因具有控制水稻花粉育性的功能。本發明所述的基因或蛋白質在水稻育種及了解植物雄性不育的機理等方面具有重要意義。文檔編號C07K14/415GK101037695SQ20061001857公開日2007年9月19日申請日期2006年3月16日優先權日2006年3月16日發明者吳昌銀,袁文雅,張啟發申請人:華中農業大學