一種水稻細胞質雄性不育基因及其應用的製作方法
2023-05-10 05:24:11 3
專利名稱：：一種水稻細胞質雄性不育基因及其應用的製作方法
技術領域：
：本發明涉及基因工程
技術領域：
，具體涉及分離克隆一種水稻細胞質雄性不育基因及其在植物育種中的應用。
背景技術：
：眾所周知，通過不同品種間的異花受粉，植物可能產生在生長勢、適應性、產量等方面具有優勢的雜種，利用這些優勢可以提高農作物的產量、質量和抗性。但水稻是一種雌雄同株的自花授粉植物，要生產雜交水稻種子，必須選育一個雄性不育的品種，讓雌蕊接受來自異株的花粉。1970年，袁隆平的研究小組找到一株普通野生稻(Oo^an^;ogow)的天然雄性不育株，稱為"野敗"。然後把野敗不育株作為不育細胞質的供體，通過與栽培秈稻(0.sa"va^p./"Ac")雜交和回交，將此不育細胞質轉入栽培稻，進而育出雜交稻生產上所需的不育系、保持系和恢復系。利用不育系和恢復系做親本雜交可省去除雄的操作，便於生產高純度的雜交種子，因此有重要的生產應用價值(袁隆平.1977.中國農業科學.1:27-31，Lin,andYuan1980.In:IRRI(eds)Innovativeapproachestoricebreeding.IRRI,Manila,p35-51)。在中國，已用野敗不育細胞質培育了大量的"三系"雜交稻品種。三系"雜交稻在1976年開始推廣種植，到1990年前後達到高峰的1.5-1.7千萬公頃，約佔中國水稻種植總面積的50~55%(Cheng等，2007，j朋.萬W.，100:959-966)。至今中國的"三系"雜交水稻仍維持大致相等的種植面積，大部分仍然是野敗型"三系"雜交稻。由於雜交稻的增產效果一般比常規稻高約20%以上，因此野敗型雜交稻的大面積種植為中國的糧食生產作出了巨大的貢獻，產生了巨大的經濟和社會效益。多種農作物如水稻、小麥、玉米、油菜等關於雄性不育性及其育性恢復性的研究已有許多報導，在生產上已大規模用於雜交種生產。不育系可分為細胞質不育基因控制的細胞質雄性不育(cytoplasmicmalesterility,簡稱為CMS)和核不育基因控制的核不育(geniemalesterility,簡稱為GMS)。從近年發展的基因學來說細胞質雄性不育系的細胞質通常為攜帶不育基因的線粒體基因組，其不育基因的表達導致花粉不育；恢復系的核基因組中攜帶細胞質雄性不育恢復基因(restoreroffertility),簡稱為恢復基因或Z廟因，其花粉正常可育，可自交結實；保持系具有正常的可育細胞質，但其核基因組不攜帶有恢復功能的基因，花粉正常可育，可自交結實。生產上配套應用的"三系"中，保持系和不育系具有相同的核基因組，其差別是細胞質基因組不同。由於不同類型的植物細胞質雄性不育是由不育細胞質的線粒體基因組中的特異不育基因產生，其育性的恢復需要特異的恢復基因的作用(SchnaWeandWise,1998,TrendsPlantSci.3:175-180)。水稻細胞質雄性不育有多種類型，主要是(l)野敗型(wildabortive,簡稱WA型)，屬於孢子體不育；(2)包臺(BT)型，屬於配子體不育；(3)紅蓮(HL)型，屬於配子體不育(朱英國，2000,水稻雄性不育的生物學，武漢大學出版社)。其中野敗型不育系在"三系"雜交稻的應用最廣泛。多個不同類型的細胞質雄性不育基因，包括水稻BT型細胞質雄性不育基因已被克隆(Hanson,andBentolila，2004,PlantCell16,S154-S169;Wangetal.,2006,PlantCell18:676-687)。水稻野敗型不育的育性恢復主要由2對主效恢復基因i/3和i/^控制，被分別定位在第1和第10染色體(Zhang等，1997,Theor.Appl.Genet.94:27-33;張群宇等，2002，遺傳學報，29:1001-1004)。但至今，野敗型細胞質雄性不育基因尚未被分子克隆。克隆野敗型細胞質不育雄性基因有利於認識雄性不育及其育性恢復的分子機理，創建新型不育系，培育新型雜交品種，進一步利用雜種優勢達到增產的目的。
發明內容本發明的第一個目的是分離克隆水稻野敗型不育細胞質雄性不育基因。本發明的第二個目的是提供上述不育基因所編碼的蛋白質。本發明的第三個目的是提供上述不育基因在培育植物不育系中的應用。本發明的第四個目的是提供上述不育基因產生的分子標記或其緊密連鎖標記及其在水稻育種中的應用。本發明釆用PCR擴增水稻野敗型不育系和保持系的DNA，將所有PCR產物作為探針，對水稻野敗型不育系，保持系和恢復系進行RNA-blot雜交，結果發現一個含有核糖體蛋白基因^/5的探針檢出一種野敗型不育系特異的mRNA，並且發現此mRNA受l個恢復基因的負調控。發明人構建了一個野敗型不育系線粒體基因組DNA文庫，用^/5探針篩選出2個陽性克隆。將這2個克隆測序分析，發現在^/5下遊存在一個15742bp的重組區，替代了保持系線粒體基因組相應的一個16462bp的區域。該重組區由7個不同來源的DNA片段組成，其中在與w/5相鄰的位置存在一個野敗型不育系特有的讀碼框。該讀碼框由3個線粒體基因組DNA片段和1個來源不明的片段組成，編碼一個352胺基酸的假定蛋白，本發明將其並命名為釆用PCR技術從野敗型不育系擴增『J352基因，構建植物轉化表達載體，並轉化正常可育的水稻品種，發現獲得的T。代轉化體表現為花粉不育。將不育轉化體與正常可育水稻雜交，獲得的雜種中含有轉基因的植株表現為花粉不育，不含轉基因的植株表現為花粉育性正常。將該『A552表達載體轉化雙子葉植物擬南芥(」ra&Wo/w"Aa//a"a)，其轉化體也同樣產生雄性不育。因此，^4"2對不同植物產生雄性不育的效果，具有植物細胞質雄性不育活性。『J352基因的核苷酸序列如序列表SEQIDNO.1所示，其CDS為(454)...(1512)，編碼352個胺基酸的蛋白質，其序列如序列表SEQIDN0.2所示。以『A552基因序列為探針，對多種水稻不育系進行RNA-blot雜交，發現它們表達出與野敗型不育系相同的轉錄帶型。進一步用『A552特異引物從各個不育系中，利用PCR擴增出產物並將所有產物測序，發現它們具有相同的『J352序列。應當理解，在不影響fE4352蛋白活性的前提下，本領域技術人員可對SEQIDNO:2所示的胺基酸序列進行各種取代、添加和/或缺失一個或幾個胺基酸獲得具有同等功能的胺基酸序列。此外，考慮到密碼子的簡併性，例如可在其編碼區，在不改變胺基酸序列的條件下，或在其非編碼區在不影響^^52表達的條件下，對編碼上述蛋白的基因序列進行修改。因此，本發明還包含對編碼上述蛋白的基因序列進行的替換、添加和/或缺失一個或多個核苷酸，具有與上述編碼基因具有相同功能的核苷酸序列。本發明還包括基於所述基因的正義序列或反義序列，包括含有所述核苷酸序列或其片段的克隆載體或表達載體、含有所述載體的宿主細胞、含有所述核苷酸序列或其活性片段的轉化的植物細胞以及轉基因植物。本發明提供的雜種育性基因具有重要的應用價值，可通過基因工程技術，如使用各種可控型啟動子，構建『J352表達載體，轉化各種植物培育雄性不育性系，用於雜交種子生產，培育植物不育系。本發明提供的不育基因的另一個應用是可以根據所述基因序列信息產生特異性分子標記，還可以用這些標記鑑定含有不育基因的栽培稻或野生稻，培育水稻不育系。圖1、顯示正常可育水稻品種93-11的線粒體基因組區域(上部)和野敗型不育系珍汕97A的線粒體基因組對應的重組區域(下部)。圖中各個點或片段的數字表示在93-11的線粒體基因組的鹼基位置(上部)，或對應於93-11的線粒體基因組或染色體的鹼基位置(下部)。股352下部的3條橫線箭頭表示mRNA。圖2、顯示『j"2蛋白序列。下劃線表示預測的跨膜區。圖3、顯示用rp/5(A)和『v4352(B)為探針對各種水稻材料進行RNA-blot雜交，檢測^4352的表達和恢復基因對它的調控。23A和97A為野敗型不育系金23A和珍汕97A;97B和Nip為保持系珍汕97B和粳稻品種日本晴(Nipponbare);iy3，i/4,和//3〃i^分別為核基因組含有i/3，和//3〃^/4以及線粒體基因組含有fK4352的復育系ZSR1，SZR3，SZRll。所述的復育系是用不育系珍汕97A為母本，恢復系IR24為父本進行雜交，再用珍汕97A為輪迴親本回交多代選育的含有//3、i//、或//3〃^//的復育材料(Zhang等，1997,Theor.Appl.Genet.94:27-33)。圖4、顯示在大腸桿菌表達『J352產生致死。IPTG(isopropyl卩-D-1-thiogalactopyranoside)為誘導目的基因表達的誘導劑。圖5、顯示用於植物轉化表達『J352的農桿菌雙元載體的部分結構。圖6、顯示用圖4所示的載體轉化水稻和擬南芥產生雄性不育。(A)為非轉化水稻對照的花葯和可育花粉；(B)為To水稻轉化體的花葯和不育花粉;(C)為非轉化擬南芥對照的花和體外培養萌發花粉；(D)為擬南芥T,轉化體的花和體外培養不萌發花粉。圖7、顯示用^^52探針進行RNA-blot雜交，檢測水稻T。不育轉化體與野生型可育花粉雜交產生的雜種中，轉基因的表達與雄性不育的共分離。S為不育株，F為可育株。圖8、顯示用『A552為探針對各種不同來源細胞質育成的水稻不育系進行RNA-blot雜交，檢測是否有與野敗不育系相同的)^4"2表達。數字1-7分別表示不育系G46A(岡型)，星A,D62A(D型)，D702A(D型)，K18A(K型)，華A(Y型)和優-IA(印水型)。具體實施例方式以下實施例用於說明本發明，但不用來限制本發明的範圍。若未特別指明，所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段；使用的水稻材料為生產上廣泛應用的，可從育種單位(如中國水稻研究所)獲得的常見水稻品種。實施例l野敗型細胞質雄性不育基因的發現及獲得可育水稻細胞質的線粒體全基因組序列已被測定(Notsu等，2002,Mol.Genet.Genomics268，434-445;Tian等2006，PlantPhysiol.140，401-410)。本發明根據此序列設計43對引物對水稻野敗型不育系珍汕97A和保持系珍汕97B以及粳稻品種日本晴(Nipponbare)的DNA進行PCR擴增；將所有的PCR產物作為探針，對珍汕97A，珍汕97B以及核基因組含有恢復基因i/3，和//3〃/^且線粒體基因組含有的復育系ZSR1，SZR3和SZR11進行RNA-blot雜交。所述的復育系是用珍汕97A為母本，恢復系IR24為父本進行雜交，再用珍汕97A為輪迴親本回交多代選育的含有i/3、、或//3〃///的復育材料(Zhang等，1997，Theor.Appl.Genet.94:27-33);並發現一個含有核糖體蛋白基因^/5的探針檢出一種野敗型不育系特異的mRNA,並且發現此mRNA受恢復基因7/Z的負調控。因此將r;/5及其附近區域作為進一步分析的目標。構建了一個野敗型不育系線粒體基因組DNA文庫，用rp/5探針以DNA印跡(DNA-blot)雜交篩選出2個陽性克隆。序列是以引物5'-atgtttccactccattttca-3，和5，-cttagtttccccctcatct-3，從水稻用PCR方法(94。C30s,6(TC60s,72。C60s,30循環)擴增獲得。將這2個克隆測序分析，發現在叩/5下遊存在一個15742bp的重組區，替代了保持系線粒體基因組相應的一個16462bp的區域。該重組區由7個不同來源的DNA片段組成，其中在與相鄰的位置存在一個新的讀碼框(圖1)。該讀碼框由3個線粒體基因組DNA片段和1個來源不明的片段組成，編碼一個352胺基酸的假定蛋白，並命名為f^J52(圖2)。^4W2有3個預測的跨膜區。實施例2f^4J52的表達調控用r屍/5和『^52為探針對珍汕97A，珍汕97B,復育系ZSR1，SZR3和SZR11進行RNA-blot雜交，檢測『A352的表達及恢復基因對它的調控。序列是以引物5，-tcatgaattcatgacgagagatagaatg-3，和5，-ttttgtcgacccttctctcagccatg-3，，用PCR技術(94。C30s，60。C60s,72。C60s,30循環)從珍汕97A擴增獲得。結果顯示，rp/5探針檢測到1條mRNA，該mRNA水平在含有W/4的復育系下調(圖3)。以『A352為探針檢測到3條mRNA雜交帶，其中最長的一條與rp/5檢測到的mRNA相同，這3種mRNA的水平在含有//的復育系同樣下調。用『A52為探針在保持系未檢測到mRNA雜交帶。實施例3『A552基因的功能驗證用5'-tcatgaattcatgacgagagatagaatg-3'和5'-ttttgtcgacccttctctcagccatg-3'{乍為引物，利用PCR技術從野敗型不育系擴增『A552基因，克隆到大腸桿菌表達載體pThio-hisA(Invitrogen公司)。該載體在大腸桿菌表達產生致死(圖4),表明『JJ52是1個具有植物細胞質雄性不育活性的毒蛋白。用5'-ggtttcactgcaggatgacgagaga-3'和5'-gtatagatggttacctacagcgctc-3'i"乍為引物，採用PCR技術從珍汕97A擴增出『A352基因片段，構建植物轉化表達載體(圖5)。用農桿菌介導法(Hiei等，1994,戶/a"/J.6，271-282)轉化正常可育水稻品種中花ll,獲得的28個T。代轉化體中，18個表現為花粉全不育，9個為部分不育(表l,圖6)。將不育轉化體與中花11雜交，獲得的雜種中含有轉基因的植株表現為花粉不育，不含轉基因的植株表現為花粉育性正常(圖7)。表1.WA352水稻轉化體的育性分析To植株T-DNA插入數花粉育性結實率％1-101CS02-11cs02-21cs03-22PS15.23-61cs04-32PS20.24-71cs05-32PS3.15-52PS10.36-11cs06-21cs06-42PS6.9tableseeoriginaldocumentpage10注CS，PS,和FF分別指完全不育，部分不育，和可育。將該『A552表達載體轉化擬南芥，其轉化體同樣產生雄性不育(圖6)。因此，『」152對不同植物都產生雄性不育的效果，具有植物細胞質雄性不育活性。實施例4從其它類型的水稻細胞質雄性不育系檢測『A352基因除了典型的野敗型不育系，育種家們以不同的野生稻和秈稻材料為細胞質供體與栽培稻雜交和回交，育成多個孢子體不育類型的不育系，並命名為各種類型的不育系(朱英國，2000,水稻雄性不育的生物學，武漢大學出版社)，如岡型(Gambiaca)，印水型(ID),D型(Dissi)，K型，Y型等。本發明以弓l物5,-tcatgaattcatgacgagagatagaatg-3，禾口5'-ttttgtcgacccttctctcagccatg-3，用PCR技術擴增獲得的fE4352基因序列為探針，對水稻不育系G46A(岡型)，星A,D62A(D型)，D702A(D型)，K18A(K型)，華A(Y型)，和優-IA(印水型)進行RNA-blot雜交，發現它們表達出與野敗型不育系相同的轉錄帶型(圖7)。進一步用所述引物從各個不育系中，利用PCR擴增出產物並將所有產物測序，發現它們具有SEQIDNO:l或SEQIDN0:2所示相同的序列。因此，這些不育系與典型的野敗型不育系實際上含有相同起源的不育基因『A352。實施例5:從野生稻和栽培稻檢測『A552基因使用5'-tcatgaattcatgacgagagatagaatg隱3'和5，-ttttgtcgaccttctctcagccatg-3'作為引物，釆用PCR技術從野生稻和栽培稻擴增『A552基因片段。實驗結果發現132份普通野生稻材料中有3份含有fE4352基因；174份秈稻材料中有3份含有『A552基因。序列表華南農業大學<120〉一種水稻細胞質雄性不育基因及其應用<150〉2008〗0112858.1〈15i〉2008-05-26〈160〉2〈170〉Patentlnversion3.5〈210〉1<211〉1800<212〉腿<213〉稻屬水稻品系珍汕97A〈220〉<221〉CDS〈222〉(454),(1512)<400〉1gcttagaacttgatagtcttctaatggctaaattggatgaagataatcaagccaagctca60tttactttgaattgaggaaggaaggggtaggggaatactaaatttcttaagatggttttg120taggtttctcatagcaaatagagacaccgaggccctctccacaacctagtagttgatggg180tatggatagaggcgagagagattgagtggagggttcgaatcgcaagattcctattggtgc240ggaaatgggtagaggtaaagcgaagcacagagaccagaccaccggatccccccttttcaa300ttgacatagtttgaccagtgaactccctgctgcgtgcaatagttgttccgaggacaatca360atgggtatata犯agaccaacgaaacgacgagtg卿鄉ataagggggagtagtaggag420gagctttcattgaagtagaggtttcatcgagtgatgacgagagatagaatgaga474MetThrArgAspArgMetArg15cgagcatttagtagtcgtteg522ArgAlaPheSerSerArgSer20cttaaateaetacaggagcga570LeuLysSerLeuGinGluArg35tegactatttatttttatatg618SerThrlieTyrPheTyrMet5055ttgaagatttecattttagtt666LeuLyslieSerlieLeuVal6570cccatagtacagatgttttec714ProlieValGinMetPheSer85cttattcttctttUtgcctt762LeulieLeuLeuPheCysLeu100caaageaagGinSerlieLys10getgggggggttAlaGlyGlyVal25aaa冊aaggataLysLysArglie40ttatgtattccaLeuCyslieProtttetagtctttPheLeuValPhe75cttetaacttgtLeuLeuThrCys90ggg卿gcgctttgcGlyArgAlaLeuCys15atetttaaagtagtgliePheLysValVal30agtagegaaatttegSerSerGlulieSer45tatttgatettctttTyrLeuliePhePhe60tateggatagtcetcTyrArglieValLeu80tgctectttcttattCysSerPheLeulie95attttgacctgtttgattcttttccgtttaaagaagaaggaggatttt810lieLeuThrCysLeulieLeuPheArgLeuLysLysLysGluAspPhe105110115gccteccctcctgaaagtataatetecatttttteaagtattttcget858AlaSerProProGluSerlielieSerliePheSerSerliePheAla120125130135attttgatggcagtattagcategggccctteagttgettacgetatg906lieLeuMetAlaValLeuAlaSerGlyProSerValAlaTyrAlaMet140145150gagaaccctgggcctagtgaagcgggtcctgaaggatecgetgcaccg954GluAsnProGlyProSerGluAlaGlyProGluGlySerAlaAlaPro155160165ccctegtectectttcaagaaageacgggggaaatggacgcgctgatg1002ProSerSerSerPheGinGluSerThrGlyGluMetAspAlaLeuMet170175180gcateaacgactccttecgcgccgeggacaccctecgggggggaacct1050AlaSerThrThrProSerAlaProArgThrProSerGlyGlyGluPro185190195teggtcaatcaaccgcttccaggggagcaagetatgcctcccgetctt1098SerValAsnGinProLeuProGlyGluGinAlaMetProProAlaLeu200205210215cccgttatgcaggaagetgetaateggtctccgccctacgcgccctac1146ProValMetGinGluAlaAlaAsnArgSerProProTyrAlaProTyr220225230ccgtatccagttgacgagataataggaggggatagegtgcaatecatt1194ProTyrProValAspGlulielieGlyGlyAspSerValGinSerlie235240245caaagaagacttttggggactaattggaatccttecgcccatgacatg1242GinArgArgLeuLeuGlyThrAsnTrpAsnProSerAlaHisAspMet250255260caaatgteceggattcaagcggaggatetatttgaactg肌agtggaa1290GinMetSerArglieGinAlaGluAspLeuPheGluLeuLysValGlu265270275ateataagaaagatggcgggcctgcatccaagtggcgattggatggga1338lielieArgLysMetAlaGlyLeuHisProSerGlyAspTrpMetGly280285290295tggggcgcgegggccttggacaacccccgtacggccactggcgaggaa1386TrpGlyAlaArgAlaLeuAspAsnProArgThrAlaThrGlyGluGlu300305310gacttggetaggttgcaccaaatgetcgacgacetacagageeggaat1434AspLeuAlaArgLeuHisGinMetLeuAspAspLeuGinSerArgAsn315320325gagcaateagetaccttctggcgcttggtcgaaagagtccgctt3egg1482GluGinSerAlaThrPheTrpArgLeuValGluArgValArgLeuArg330335340gcggatgaggatcsa朋cteagcctectagacatggctgag3gaagggtga肪AlaAspGluAspGinAsnSerAlaSer345350aaaaataattggaactattgagegctgtaggtatccatctatactaatagatataccgaggccctgcgtgcgccgtacgtaccgcctacgaa/taataggtagccccaccccaggcagagtttgtgagccgtgtaataggcgaccatttcgcgcggttcggggggcacttgaataagcegecggcccccggctgcgtctttacccctatccaatttttgggccaattccccettegtactaccaaaaaatgagattcttgccgaat<210〉2<211〉352<212〉PRT<213〉稻屬水稻品系珍汕97A2AspArgMetArgMetThrArgAlaLeuL.ysSerThr50LeuLys65ProlieLeulieLeuLysliePhe130ProSer145ProGluGlyGluThrProGinAla210SerProArgPheSer35lielieValLeuLys115SerValGlyMetSer195MetProSer20teuTyrSerGinLeu100LysSerAlaSerAsp180GlyProTyr5SerGinPhelieMet85PheGlulieTyrAla165AlaGlyProAlaArgGluTyrLeu70PheCysAspPheAla150AlaLeuGluAlaProSerArgMet55ValSerLeuPheAla135MetProMetProLeu215TyrGinSerAlaGly25Lys40LeuPheLeulieAla120lieGluProAlaSer200ProProLysCysLeuLeuLeu105Ser二euAsnSerSer185ValValTyrlie10GlyArglieValThr90ThrProMetProSer170ThrAsnMetProLysVallieProPhe75CysCysProAlaGly155SerThrGinGinValGlylieSerTyr60TyrCysLeuGluVal140ProPheProProGlu220AspArgPheSer45LeuArgSerlieSer125LeuSerGinSerLeu205AlaGluAlaLeuCys15ValLys30GlulieliePheCeu110lieAlaGluGluAla190ProAlaIJeliePheValLeu95PhelieSerAlaSer175ProGlyAsnlieValSerPheLeu80lieArgSerGlyGly160ThrArgGluArgGly153515951655171517751800formulaseeoriginaldocumentpage15權利要求1、一種植物細胞質雄性不育基因，其編碼一種具有植物細胞質雄性不育活性的蛋白，該蛋白序列為SEQIDNO2；或編碼具有同等功能的由序列SEQIDNO2經過取代、缺失或添加一個或幾個胺基酸衍生的蛋白質蛋白序列。2、如權利要求l所述的基因，其具有SEQIDNO:l所示的核苷酸序列。3、一種含有權利要求1或2所述基因的表達載體。4、一種由權利要求3所述載體轉化的宿主細胞。5、權利要求l或2所述基因或權利要求3所述載體在植物育種中的應用。6、如權利要求5所述的應用，其特徵在於所述植物為水稻。7、如權利要求5或6所述的應用，其特徵在於1)將權利要求1或2所述基因或權利要求3所述載體轉化植物獲得轉基因植物不育系；或利用l)獲得的轉基因不育系作為親本雜交。8、根據權利要求1或2所述基因產生的分子標記。9、權利要求8所述分子標記在水稻育種中的應用。全文摘要本發明涉及植物基因工程
技術領域：
，具體涉及一種水稻細胞質雄性不育基因及其應用。本發明提供一種從水稻的線粒體基因組克隆的野敗型雜交稻的細胞質雄性不育基因、其編碼的蛋白質、含有所述基因DNA序列的載體及所述載體轉化的宿主細胞。本發明的不育基因可通過基因工程技術，轉化各種植物培育雄性不育性系，用於雜交種子生產，培育植物不育系；也可以根據所述基因序列信息產生特異性分子標記；還可以用這些標記鑑定含有不育基因的栽培稻或野生稻，培育水稻不育系。文檔編號A01H5/00GK101514342SQ20081016702公開日2009年8月26日申請日期2008年10月9日優先權日2008年5月26日發明者劉振蘭,劉耀光,珊葉,豪吳,張群宇,虹徐,郭晶心,陳遠玲申請人:華南農業大學