一種弱背景螢光的樹脂包埋方法
2023-04-28 08:16:16 1
一種弱背景螢光的樹脂包埋方法
【專利摘要】本發明公開了一種弱背景螢光的樹脂包埋方法，屬於生物工程【技術領域】。該方法採用溶解了蘇丹黑B的樹脂溶液作為染色包埋液來滲透包埋螢光生物樣品。該方法所得生物樣品在保持螢光信號強度的前提下，背景螢光大大降低。本方法能適用於釐米尺寸的大樣本，所得生物樣品能用於連續超薄切片。本發明方法成本低廉，操作步驟簡單，適合在一般實驗室推廣使用。
【專利說明】一種弱背景螢光的樹脂包埋方法
【技術領域】
[0001]本發明屬於生物工程【技術領域】，特別涉及一種弱背景螢光的樹脂包埋方法。
【背景技術】
[0002]現代生物學面臨的巨大挑戰是理解跨度範圍從細胞到組織到器官甚至到完整生物體的結構和功能。傳統的落射式螢光顯微成像由於景深和背景螢光的影響，只能對幾十微米的薄切片進行成像。將這種塊面成像方法與連續機械薄切片結合起來，能成功地對釐米級大尺寸生物樣品進行快速三維成像。通常，為了保證生物樣品能進行連續薄切片，需要採用樹脂對其進行包埋。然而，該技術雖然解決了成像景深的問題，但仍然存在背景螢光幹擾的問題。大尺寸生物樣品存在組織自發螢光和焦面外的信號螢光導致的背景螢光幹擾，而在樣品包埋的過程中會進一步提高背景螢光。這種強烈的背景螢光幹擾往往使得焦面上的細節信息被湮沒。因此，發明一種弱背景螢光的樹脂包埋方法具有非常重要的意義。
[0003]目前，有研究者通過在樹脂中摻入不透明劑的方法減少樹脂包埋樣本的背景螢光，如文獻「Surface Imaging Microscopy, an Automated Method for Visualizing WholeEmbryo Samples in Three Dimensions at High Resolution.(Ewald, A.J., H.McBride, M.Reddington, S.E.Fraser, and R.Kerschmann.Developmental Dynamics225, n0.3(Nov2002):369-75.) 」。但是該方法目前仍未能應用到螢光蛋白(GFP及其衍生物，XFPs)標記的生物樣品中。螢光蛋白自被發現以來，由於其穩定的螢光發射、不具有物種專一性、易於在細胞內表達等優點，已作為標記物廣泛地應用於生命科學領域。利用XFPs標記技術，能特異性標記各種細胞，對研究生物體的結構和功能具有重大意義。但是一些極端的理化條件，如高溫、強氧化還原劑、強酸強鹼等，均會導致XFPs的螢光強度降低甚至淬滅。因此該文獻也指出，如何將其方法應用到表達螢光蛋白的樣本上是未來的技術挑戰之一。
[0004]鑑於此，發明一種弱背景螢光的樹脂包埋方法，將其應用到釐米尺寸的螢光生物樣品上，特別地，可應用到螢光蛋白標記的生物樣品上，具有重大意義和巨大的挑戰。
【發明內容】
[0005]本發明的目的是為解決上述問題而提供了一種生物樣品在保持螢光信號強度的前提下，背景螢光大大降低的方法。
[0006]本發明所採用的技術方案是:
[0007]一種弱背景螢光的樹脂包埋方法，包括以下步驟:
[0008](I)將生物樣品用冰水預冷卻的質量百分比為4%的多聚甲醛溶液固定6?24h ;
[0009](2)將步驟(I)得到的生物樣品用冰水預冷卻的濃度為0.01mol/L的PBS漂洗液清洗3?24h，其間更換新鮮漂洗液3?5次；
[0010](3)將步驟(2)得到的生物樣品依次放入冰水預冷卻的質量百分比為50%、70%和95%的乙醇溶液中進行梯度脫水，每次15min?2h ；
[0011](4)將步驟(3)得到的生物樣品依次放入質量百分比為70%、85%和100%的乙二醇甲基丙烯酸酯水溶性包埋液(GMA)中進行梯度滲透，每個梯度I?3h，隨後再次放入新鮮的質量百分比為100%的GMA水溶性包埋液中滲透6?12h ;
[0012](5)將步驟(4)得到的生物樣品放入蘇丹黑B染色包埋液中滲透I?4天；
[0013](6)將步驟(5)得到的生物樣品放入包埋模具中，包埋模具中充滿蘇丹黑B染色包埋液，然後在45?50 °C下隔氧聚合12?60h。
[0014]進一步地，所述步驟(4)中質量百分比為100%的GMA水溶性包埋液由質量百分比為67%的GMA單體，3%的水，29.4%的甲基丙烯酸丁酯和0.6%的偶氮二異丁腈配製而成。
[0015]進一步地，所述步驟(5)和(6)中的蘇丹黑B染色液包埋液是由預聚GMA水溶性包埋液溶解的濃度為0.5?5w/w%。(g/kg)的蘇丹黑B溶液配製而成。
[0016]進一步地，所述預聚GMA水溶性包埋液是取質量百分比為100%的GMA水溶性包埋液攪拌加熱至90?95°C時迅速放入冰水浴中，直至溶液溫度降至冰水浴的溫度。
[0017]更進一步地，為加強染色效果，可以向所述步驟(3)中的質量百分比為95%的乙醇溶液以及步驟(4)中的梯度GMA水溶性包埋液中加入蘇丹黑B，配製成0.5?5w/w%。的染色液。
[0018]優選地，所述步驟(6)中的隔氧聚合是採用的包埋模具具有隔氧功能或採用具有抽真空功能的烘箱。
[0019]進一步地，所述步驟(I)中生物樣品的尺寸不超過2釐米見方。
[0020]優選地，所述生物樣品可以為任何發射螢光的動物組織。
[0021]本發明具有以下優點:
[0022]本發明是採用一種溶解了光吸收劑的樹脂作為染色包埋液滲透、包埋生物樣品，所得樣品為背景螢光被抑制的能應用於超薄切片的生物樣品。該方法所得生物樣品在保持螢光信號強度的前提下，背景螢光大大降低。本方法能適用於釐米尺寸的大樣本，所得生物樣品能用於連續超薄切片。本發明方法成本低廉，操作步驟簡單，適合在一般實驗室推廣使用。同時所得包埋的生物樣品能應用於塊面成像結合連續薄切片的技術上，可用於快速獲取螢光蛋白標記組織的高分辨三維螢光分布，繼而進行相關結構和功能研究。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0023]圖1為本發明實施例1採用傳統樹脂包埋方法製備的成年Thyl-GFP-M小鼠全腦樣本的塊面螢光成像結果圖；
[0024]圖2為本發明實施例1採用弱背景螢光的樹脂包埋方法製備的成年Thyl-GFP-M小鼠全腦樣本的塊面螢光成像結果圖。
【具體實施方式】
[0025]下面結合附圖和實施方式對本發明做進一步詳細的說明。
[0026]實施例1
[0027]本實施例提供了一種弱背景螢光的樹脂包埋方法，包括以下步驟:
[0028](I)成年的Thyl-GFP-M line轉基因小鼠用1%戊巴比妥鈉麻醉後，通過心臟左心室灌注37°C的0.01mol/L PBS溶液3分鐘，待血液衝洗乾淨後，立即灌注冰水預冷卻的4%多聚甲醛固定液，並持續I小時。然後，取出小鼠全腦，再次放入冰水預冷卻的4%多聚甲醛固定液中後固定24小時。所述固定液中加入2.5%蔗糖，溶劑為0.0lmol/L PBS。
[0029](2)固定結束後，將全腦樣本放入冰水預冷卻的0.0lmol/L PBS中漂洗24小時，其間更換新液5次，以徹底清洗掉殘餘的多聚甲醛固定液。
[0030](3)接著，將全腦樣本依次放入冰水預冷卻的50%、70%和95%乙醇溶液中進行梯度脫水，每次2小時。
[0031](4)脫水結束後，將全腦樣本依次放入質量百分比為70%、85%和100%的GMA水溶性包埋液中進行梯度滲透，每個梯度3小時，其中70%和85%GMA水溶性包埋液的溶劑為95%乙醇。隨後再次放入新鮮的100%GMA水溶性包埋液中滲透12小時，最後放入預聚GMA水溶性包埋液配製的3%。蘇丹黑B染色包埋液中滲透4天。所有滲透液都先用冰水浴預冷卻。100%GMA水溶性包埋液由質量百分比為67%的GMA單體、3%的水、29.4%的甲基丙烯酸丁酯和0.6%的偶氮二異丁腈配製而成。預聚GMA水溶性包埋液的配製方法為:取100%GMA水溶性包埋液攪拌加熱至90°C時迅速放入冰水浴中，並大力搖動，直至溶液溫度降至冰水浴的溫度。
[0032](5)將小鼠全腦放入凝膠將囊中，加入預聚GMA水溶性包埋液配製的3%。蘇丹黑B染色包埋液至頂部，靜置約10分鐘直至膠囊中的氣泡完全消失，然後蓋上膠囊蓋子。將膠囊包埋的小鼠全腦垂直放置在膠囊支架上，然後一起放入50°C烘箱中聚合60小時，得到所需的背景螢光顯著降低的全腦包埋樣本。
[0033]對所得全腦樣本進行GFP螢光塊面成像，所得螢光圖像參照圖2，通過圖1與圖2的比較可以明顯的看出通過本發明製備得到的全腦包埋樣本在保持螢光信號強度的前提下，背景螢光大大降低。
[0034]實施例2
[0035]本實施例提供了一種弱背景螢光的樹脂包埋方法，包括以下步驟:
[0036](I)成年的Thyl-GFP-M line轉基因小鼠用1%戊巴比妥鈉麻醉後，通過心臟左心室灌注37°C的0.0lmol/L PBS溶液3分鐘，待血液衝洗乾淨後，立即灌注冰水預冷卻的4%多聚甲醛固定液，並持續I小時。然後，取出小鼠全腦，切成I毫米厚的腦塊，再次放入冰水預冷卻的4%多聚甲醛固定液中後固定6小時。所述固定液中加入2.5%蔗糖，溶劑為
0.01mol/L PBS0
[0037](2)固定結束後，將腦塊樣本放入冰水預冷卻的0.01mol/L PBS中漂洗3小時，其間更換新液3次，以徹底清洗掉殘餘的多聚甲醛固定液。
[0038](3)接著，將腦塊樣本依次放入冰水預冷卻的50%、70%和95%乙醇溶液中進行梯度脫水，每次15min。
[0039](4)脫水結束後，將全腦樣本依次放入質量百分比為70%、85%和100%的GMA水溶性包埋液中進行梯度滲透，每個梯度I小時，其中70%和85%GMA水溶性包埋液的溶劑為95%乙醇。隨後再次放入新鮮的100%GMA水溶性包埋液中滲透6小時，最後放入預聚GMA水溶性包埋液配製的0.5%。蘇丹黑B染色包埋液中滲透I天。所有滲透液都先用冰水浴預冷卻。100%GMA由質量百分比為67%的GMA單體、3%的水、29.4%的甲基丙烯酸丁酯和0.6%的偶氮二異丁腈配製而成。預聚GMA水溶性包埋液的配製方法為:取100%GMA水溶性包埋液攪拌加熱至95°C時迅速放入冰水浴中，並大力搖動，直至溶液溫度降至冰水浴的溫度。
[0040](5)將小鼠全腦放入凝膠將囊中，加入預聚GMA水溶性包埋液配製的0.5%。蘇丹黑B染色包埋液至頂部，靜置約10分鐘直至膠囊中的氣泡完全消失，然後蓋上膠囊蓋子。將膠囊包埋的小鼠全腦垂直放置在膠囊支架上，然後一起放入45°C烘箱中聚合12小時，得到所需的背景螢光顯著降低的I毫米腦塊包埋樣本。
[0041]實施例3
[0042]本實施例提供了一種弱背景螢光的樹脂包埋方法，包括以下步驟:
[0043](I)成年的Thyl-YFP-H line轉基因小鼠用1%戊巴比妥鈉麻醉後，通過心臟左心室灌注37°C的0.0lmol/L PBS溶液3分鐘，待血液衝洗乾淨後，立即灌注冰水預冷卻的4%多聚甲醛固定液，並持續I小時。然後，取出小鼠全腦，切成5毫米腦塊，再次放入冰水預冷卻的4%多聚甲醛固定液中後固定12小時。所述固定液中加入2.5%蔗糖，溶劑為0.0lmol/LPBS。
[0044](2)固定結束後，將腦塊樣本放入冰水預冷卻的0.0lmol/L PBS中漂洗12小時，其間更換新液4次，以徹底清洗掉殘餘的多聚甲醛固定液。
[0045](3)接著，將全腦樣本依次放入冰水預冷卻的50%和70%乙醇溶液中梯度脫水，每次I小時，然後放入95%乙醇溶液配製的5%。蘇丹黑B染色液中脫水I小時。
[0046](4)脫水結束後，將全腦樣本依次放入質量百分比為70%、85%和100%的GMA水溶性包埋液配製的5%。蘇丹黑B染色液中進行梯度滲透，每個梯度2小時，其中70%和85%GMA包埋液的溶劑為95%乙醇。隨後再次放入新鮮的GMA水溶性包埋液配製的5%。蘇丹黑B染色液中滲透8小時，最後放入GMA水溶性包埋液配製的5%。蘇丹黑B染色包埋液中滲透2天。所有滲透液都先用冰水浴預冷卻。100%GMA水溶性包埋液由質量百分比為67%的GMA單體、3%的水、29.4%的甲基丙烯酸丁酯和0.6%的偶氮二異丁腈配製而成。預聚GMA水溶性包埋液的配製方法為:取100%GMA水溶性包埋液攪拌加熱至90°C時迅速放入冰水浴中，並大力搖動，直至溶液溫度降至冰水浴的溫度。
[0047](5)將小鼠腦塊放入凝膠將囊中，加入預聚GMA水溶性包埋液配製的5%。蘇丹黑B染色包埋液至頂部，靜置約10分鐘直至膠囊中的氣泡完全消失，然後蓋上膠囊蓋子。將膠囊包埋的小鼠全腦垂直放置在膠囊支架上，然後一起放入50°C烘箱中聚合48小時，得到所需的背景螢光顯著降低的腦塊包埋樣本。
[0048]本發明是採用一種溶解了光吸收劑的樹脂作為染色包埋液滲透、包埋生物樣品，所得樣品為背景螢光被抑制的能應用於超薄切片的生物樣品。該方法所得生物樣品在保持螢光信號強度的前提下，背景螢光大大降低。本方法能適用於釐米尺寸的大樣本，所得生物樣品能用於連續超薄切片。本發明方法成本低廉，操作步驟簡單，適合在一般實驗室推廣使用。同時所得包埋的生物樣品能應用於塊面成像結合連續薄切片的技術上，可用於快速獲取螢光蛋白標記組織的高分辨三維螢光分布，繼而進行相關結構和功能研究。
[0049]最後所應說明的是，以上實施例僅用以說明本發明的技術方案而非限制，儘管參照較佳實施例對本發明進行了詳細說明，本領域的普通技術人員應當理解，可以對本發明的技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發明技術方案的精神和範圍，其均應涵蓋在本發明的權利要求範圍當中。
【權利要求】
1.一種弱背景螢光的樹脂包埋方法，其特徵在於，包括以下步驟: (1)將生物樣品用冰水預冷卻的質量百分比為4%的多聚甲醛溶液固定6?24h; (2)將步驟(I)得到的生物樣品用冰水預冷卻的濃度為0.0lmol/L的PBS漂洗液清洗3?24h，其間更換新鮮漂洗液3?5次； (3)將步驟(2)得到的生物樣品依次放入冰水預冷卻的質量百分比為50%、70%和95%的乙醇溶液中進行梯度脫水,每次15min?2h ； (4)將步驟(3)得到的生物樣品依次放入質量百分比為70%、85%和100%的乙二醇甲基丙烯酸酯水溶性包埋液(GMA)中進行梯度滲透，每個梯度I?3h，隨後再次放入新鮮的質量百分比為100%的GMA水溶性包埋液中滲透6?12h ; (5)將步驟(4)得到的生物樣品放入蘇丹黑B染色包埋液中滲透I?4天； (6)將步驟(5)得到的生物樣品放入包埋模具中，包埋模具中充滿蘇丹黑B染色包埋液，然後在45?5(TC下隔氧聚合12?60h。
2.根據權利要求1所述的弱背景螢光的樹脂包埋方法，其特徵在於，所述步驟(4)中質量百分比為100%的GMA水溶性包埋液由質量百分比為67%的GMA單體，3%的水，29.4%的甲基丙烯酸丁酯和0.6%的偶氮二異丁腈配製而成。
3.根據權利要求1所述的弱背景螢光的樹脂包埋方法，其特徵在於，所述步驟(5)和(6)中的蘇丹黑B染色液包埋液是由預聚GMA水溶性包埋液溶解的濃度為0.5?5w/w%。(g/kg)的蘇丹黑B溶液配製而成。
4.根據權利要求3所述的弱背景螢光的樹脂包埋方法，其特徵在於，所述預聚GMA水溶性包埋液是取質量百分比為100%的GMA水溶性包埋液攪拌加熱至90?95°C時迅速放入冰水浴中，直至溶液溫度降至冰水浴的溫度。
5.根據權利要求1所述的弱背景螢光的樹脂包埋方法，其特徵在於，為加強染色效果，可以向所述步驟(3)中的質量百分比為95%的乙醇溶液以及步驟(4)中的梯度GMA水溶性包埋液中加入蘇丹黑B，配製成0.5?5w/w%。的染色液。
6.根據權利要求1所述的弱背景螢光的樹脂包埋方法，其特徵在於，所述步驟(6)中的隔氧聚合是採用的包埋模具具有隔氧功能或採用具有抽真空功能的烘箱。
7.根據權利要求1所述的弱背景螢光的樹脂包埋方法，其特徵在於，所述步驟(I)中生物樣品的尺寸不超過2釐米見方。
8.根據權利要求1所述的弱背景螢光的樹脂包埋方法，其特徵在於，所述生物樣品可以為任何發射螢光的動物組織。
【文檔編號】G01N1/30GK103808553SQ201410039740
【公開日】2014年5月21日 申請日期:2014年1月27日 優先權日:2014年1月27日
【發明者】龔輝, 駱清銘, 胡碧荷 申請人:華中科技大學