一種提高反芻動物肉奶cla含量的天然產物製劑的製作方法
2023-04-28 13:21:01
一種提高反芻動物肉奶cla含量的天然產物製劑的製作方法
【專利摘要】本發明提供一種提高反芻動物肉奶CLA含量的天然產物製劑，該天然產物製劑既減少了瘤胃微生物甲烷生成量，又無需過瘤胃保護潛在提高反芻動物肉和奶中共軛亞油酸（CLA)含量。該天然產物製劑是由紫蘇子果實粉碎後，經質量百分含量60-80%的乙醇溶液提取，通過氮吹和冷凍乾燥得到的乾粉。本發明通過乙醇提取紫蘇子的脂肪酸等有效成分，通過氮吹和冷凍乾燥法製備乾粉。瘤胃體外發酵試驗顯示，該製劑在0.4g/L即每克乾物質添加40mg添加量時，可有效減少瘤胃微生物甲烷生成量達63.3%，同時對揮發性脂肪酸、氨態氮和總細菌數無顯著影響。本發明所述的天然產物即保證了乳和肉產量，又提高了乳肉中CLA濃度，所以是真正意義上的獲到高CLA功能性<產品的有效途徑。
【專利說明】一種提高反芻動物肉奶CLA含量的天然產物製劑
【技術領域】
[0001] 本發明涉及瘤胃調控領域，具體涉及一種減少瘤胃微生物甲烷生成量，並且無需 過瘤胃保護提高反芻動物肉和奶中共軛亞油酸（CLA)含量的天然產物製劑。
【背景技術】
[0002] 補充富含多不飽和脂肪酸的油，如亞油酸（C18:2,大豆和向日葵）和亞麻酸 (C18:3,亞麻籽），能減少瘤胃甲烷生產分別達4. 1 %和4. 8% (分別來自19個和20個觀測 值，Martin等，2009)。但不飽和脂肪酸的添加顯著抑制瘤胃消化，進而降低反芻動物生產 性能（Zhang 等，2008)。
[0003] 共軛亞油酸（CLA)是具有共軛雙鍵的十八碳二烯酸的位置和幾何異構體的混合 物。在CLA的不同異構體中，各自的生理功能和生物活性不同。c9，tllCLA單獨或與其他異 構體共同在抗癌方面具有生物活性（Pariza等，1999)。同樣，tlO, C12CLA是影響能量代謝 和降低機體脂肪沉積的活性形式。
[0004] CLA的抗癌作用是它受到眾多研究者重視的主要原因，已在多種試驗模型中得到 證實，這些模型包括：小鼠的胃癌、小鼠的皮膚癌和大鼠的乳腺癌及兔和倉鼠的動脈粥樣硬 化（Cook 等，1993 ;Ip 等，1990,1996 ;Miller 等，1994 ;Belury 等，1996)。許多離體實驗表 明，CLA還對許多人類的癌細胞的生長具有抑制作用（Shultz等，1992 ;Visonneau等，1996 ; Cunningham等，1997)。另外，在最近的流行病調查中得到證實，隨著乳品消費量的增長，婦 女患乳腺癌的機率減少；調查人員發現該成果可能歸功於牛乳脂中CLA的抗癌作用。
[0005] 研究人員試圖通過添加脂肪提高牛奶CLA含量，如脂肪酸鈣、全脂籽實和植物油。 由於富含亞油酸的植物油的凝固點過低，單獨一種植物油很難合成脂肪酸鈣，需要添加飽 和度高、凝固點高的棕櫚油或牛羊油，這樣脂肪酸鈣中的亞油酸含量降低。由於受狂牛症影 響，已限制在奶牛飼料中應用牛油來源的脂肪酸鈣，所以在歐共體國家已大規模減少脂肪 酸鈣用量。在德國、丹麥，受消費趨勢的影響，脂肪酸鈣在奶牛場已停用。另外在小腸中脂 肪酸與鈣重新結合，難以溶解，消化率低。全脂籽實在奶牛日糧配合方面靈活性太差，限制 了其在奶牛日糧中的配合比例，另從研究的角度來講，是否存在脂肪與蛋白甚至其他物質 的互作效應也未可知。由於植物油對瘤胃細菌尤其是纖維分解菌的生長與活力有抑制作用 (Jenkins，1997)，進而影響瘤胃纖維的正常發酵，降低乙酸濃度，降低乳脂率，傳統上反芻 動物日糧中一般不包含植物油。奶牛產奶高峰期日糧能量濃度低，而採食量是一定的，若過 度增加精料飼餵量容易出現酮病、蹄葉炎、酸中毒等營養代謝性疾病。目前市售過瘤胃保護 型CLA以期提高牛奶中CLA含量，不僅成本高而且工藝繁瑣。
[0006] 紫蘇子是一種常見的中草藥，為唇形科植物紫蘇的乾燥成熟果實，功效降氣消痰、 止咳平喘、潤腸。早在《神農本草》中關於紫蘇的記載，紫蘇籽油被認為是調味精品和食療 珍品，在古時是進貢皇帝的名貴營養食用油（張洪，2006)。
【發明內容】
[0007] 本發明提供一種提高反芻動物肉奶CLA含量的天然產物製劑，該天然產物製劑既 減少了瘤胃微生物甲烷生成量，又無需過瘤胃保護潛在提高反芻動物肉和奶中共軛亞油酸 (CLA)含量。
[0008] 本發明解決其技術問題所採用的技術方案是：
[0009] -種提高反芻動物肉奶CLA含量的天然產物製劑，該天然產物製劑是由紫蘇子果 實粉碎後，經質量百分含量60-80%的乙醇溶液提取，通過氮吹和冷凍乾燥得到的乾粉。紫 蘇子果實含有大量的不飽和脂肪酸，主要為α-亞麻酸、油酸、亞油酸、軟脂酸和硬脂酸。其 中a-亞麻酸對人體具有明顯的保健功能和生理功效（徐章華，2002)。不飽和脂肪酸中 含有大量的不飽和鍵，可以與氫發生加合反應，減少甲烷菌對氫的利用，從而減少甲烷的生 成。為了高效獲得紫蘇子果實中的不飽和脂肪酸且不影響其化學性質，選擇在常溫下乙醇 提取，便於提取液濃縮製成乾粉，醇溶液控制在60-80%，且以70%最好。介於紫蘇子果實 含有上述功能性成份，紫蘇子在減少瘤胃甲烷生成中具有一定的效果。紫蘇子具有廣源性 和協同性，其功能提取物製劑經科學配伍後有望進一步全面改善瘤胃功能。本發明人在實 驗過程中意外的發現，其在具有減少瘤胃甲烷生成功能的同時竟然不影響瘤胃揮發性脂肪 酸（VFA)生成量，不影響細菌的數量，這是與其他常規富含不飽和脂肪酸的天然產物具有 顯著區別之處。
[0010] 一種所述的天然產物製劑的製備工藝，該工藝包括如下步驟：用中藥粉碎機將紫 蘇子果實粉碎為粉末狀，加入適量質量百分含量60-80 %的乙醇溶液混合均勻，經漩渦振 蕩、旋轉混合器混合、離心後，吸取上清液至冷凍瓶，氮吹儀吹乾後，冷凍乾燥得到天然產物 製劑乾粉。
[0011] 作為優選，所述的製備工藝具體包括如下步驟：
[0012] (1)用中藥粉碎機將紫蘇子果實粉碎為粉末狀，放入離心管中，加入適量70%乙 醇溶液；
[0013] (2)漩渦振蕩一35rpm旋轉混合器混合30min-漩渦振蕩一旋轉混合器混合 30min - 3000rpm 離心 5min ;
[0014] (3)吸取上清液至冷凍瓶，氮吹儀吹乾；
[0015] (4)離心管中沉澱保留，繼續添加適量70%乙醇溶液一漩渦振蕩器一旋轉混合器 30min -漩潤振蕩器一旋轉混合器30min -漩潤振蕩器一旋轉混合器30min - 3000rpm離 心 5min ;
[0016] (5)吸取上清液至已吹乾的冷凍瓶，氮吹儀吹乾，冷凍乾燥機24_48h至乾粉，待升 至室溫稱重，封瓶，_20°C保存。
[0017] 所述的天然產物製劑在減少瘤胃微生物甲烷生成、提高反芻動物肉奶CLA含量中 的應用，其特徵在於：該天然產物製劑在每克飼料中的添加量為35-45mg。另一種表述是， 該天然產物製劑在瘤胃液中達到〇. 4g/L添加量時，可有效減少瘤胃微生物甲烷產量，不影 響瘤胃揮發性脂肪酸和氨態氮生成量，不影響瘤胃細菌總量。一些常規的用於降低瘤胃微 生物甲烷產量的天然產物製劑，如植物油，由於不飽和脂肪酸含量較高，會抑制反芻動物的 瘤胃消化，所以只能以損失增重和降低乳產量和乳脂率為代價來降低甲烷排放，而且這種 常規植物油的添加雖在一定程度上提高了乳中CLA濃度，但卻降低了總的乳脂產量，所以 在生產中為了提高乳中CLA含量，必須對植物油等物質進行包被，否則無法實現真正意義 上的CLA功能乳的生產。而這些植物油一旦包被在瘤胃中又無法發揮其降甲烷的功效。而 本發明所述的天然產物製劑在無過瘤胃保護情況下，該天然產物製劑在每克飼料中的添加 量為35-45mg並不影響瘤胃揮發性脂肪酸生成量、氨態氮濃度，且該劑量添加時並不影響 細菌的數量。CLA是細菌對亞油酸氫化作用的一類中間代謝物，本發明所述的天然產物含有 高濃度的亞油酸，所以在細菌含量不受到影響的同時，細菌可將此天然產物中的亞油酸氫 化為CLA，進入血液循環到達乳腺，提高乳中的CLA濃度，同時由於本發明所述的天然產物 對揮發性脂肪酸生成量和氨態氮濃度無影響，說明該天然產物的添加不影響瘤胃的消化和 營養物質向機體的供應，所以乳和肉產量也不會發生變化。因此本發明所述的天然產物即 保證了乳和肉產量，又提高了乳肉中CLA濃度，所以是真正意義上的獲到高CLA功能性產品 的有效途徑。而且本發明所述的天然產物對瘤胃甲烷排放有很好的減排作用。所以本發明 的天然產物製劑是一種即可降低甲烷排放，又可提高乳肉CLA含量有效天然產物。
[0018] 作為優選，該天然產物製劑在使用時用DMS0稀釋至35-45mg/mL。在小劑量使用 時，為保證添加量的準確，該天然產物製劑可用DMS0稀釋，實際生產上用可以直接加乾粉。
[0019] 本發明通過乙醇提取紫蘇子的脂肪酸等有效成分，通過氮吹和冷凍乾燥法製備幹 粉。瘤胃體外發酵試驗顯示，該製劑在〇. 4g/L即每克乾物質添加40mg添加量時，可有效減 少瘤胃微生物甲烷生成量達63. 3%，同時對揮發性脂肪酸、氨態氮和總細菌數無顯著影響。
【具體實施方式】
[0020] 下面通過具體實施例，對本發明的技術方案作進一步的具體說明。應當理解，本發 明的實施並不局限於下面的實施例，對本發明所做的任何形式上的變通和/或改變都將落 入本發明保護範圍。
[0021] 在本發明中，若非特指，所有的份、百分比均為重量單位，所有的設備和原料等均 可從市場購得或是本行業常用的。
[0022] 旋轉混合器，華利逹WH-962。
[0023] 實施例1 :
[0024] (1)用中藥粉碎機將紫蘇子果實粉碎為粉末狀，稱取0. 25g於15mL離心管中，加入 5mL70%乙醇溶液；
[0025] (2)漩渦振蕩一35rpm旋轉混合器混合30min -漩渦振蕩一旋轉混合器混合 30min (兩次共計 lh) - 3000rpm 離心 5min ;
[0026] (3)吸取上清液至冷凍瓶，氮吹儀吹乾；
[0027] (4)離心管中沉澱保留，繼續添加5mL70%乙醇一漩渦振蕩器一旋轉混合器 30min -漩渦振蕩器一旋轉混合器30min -漩渦振蕩器一旋轉混合器30min (三次共計 1. 5h) - 3000rpm 離心 5min ;
[0028] (5)吸取上清液至已吹乾的冷凍瓶，氮吹儀吹乾，冷凍乾燥機24_48h至乾粉，待升 至室溫稱重，封瓶，_20°C保存。
[0029] 實施例2 :
[0030] (1)用中藥粉碎機將紫蘇子果實粉碎為粉末狀，稱取0. 25g於15mL離心管中，加入 5mL60%乙醇溶液；
[0031] (2)漩渦振蕩一35rpm旋轉混合器混合30min-漩渦振蕩一旋轉混合器混合 30min (兩次共計 lh) - 3000rpm 離心 5min ;
[0032] (3)吸取上清液至冷凍瓶，氮吹儀吹乾；
[0033] (4)離心管中沉澱保留，繼續添加5mL60%乙醇一漩渦振蕩器一旋轉混合器 30min -漩渦振蕩器一旋轉混合器30min -漩渦振蕩器一旋轉混合器30min (三次共計 1. 5h) - 3000rpm 離心 5min ;
[0034] (5)吸取上清液至已吹乾的冷凍瓶，氮吹儀吹乾，冷凍乾燥機24_48h至乾粉，待升 至室溫稱重，封瓶，_20°C保存。
[0035] 實施例3 :
[0036] (1)用中藥粉碎機將紫蘇子果實粉碎為粉末狀，稱取0. 25g於15mL離心管中，加入 5mL80%乙醇溶液；
[0037] (2)漩渦振蕩一35rpm旋轉混合器混合30min -漩渦振蕩一旋轉混合器混合 30min (兩次共計 lh) - 3000rpm 離心 5min ;
[0038] (3)吸取上清液至冷凍瓶，氮吹儀吹乾；
[0039] (4)離心管中沉澱保留，繼續添加5mL80%乙醇一漩渦振蕩器一旋轉混合器 30min -漩渦振蕩器一旋轉混合器30min -漩渦振蕩器一旋轉混合器30min (三次共計 1. 5h) - 3000rpm 離心 5min ;
[0040] (5)吸取上清液至已吹乾的冷凍瓶，氮吹儀吹乾，冷凍乾燥機24-48h至乾粉，待升 至室溫稱重，封瓶，_20°C保存。
[0041] 下面結合瘤胃體外發酵試驗詳細說明該製劑減少甲烷生成的幅度：
[0042] (1)紫蘇子果實提取物的製備和稀釋
[0043] 採用實施例1製得的紫蘇子果實提取物乾粉，用DMS0稀釋乾粉至40mg/mL，得到紫 蘇子果實提取物DMS0溶液。
[0044] (2)提取物瘤胃體外發酵試驗
[0045] 採用壓力讀取式體外產氣法開展減少甲烷生成效果試驗。試驗分兩組進行，分別 為對照組、紫蘇子果實提取物組（簡稱：紫蘇子組），每組三個重複。試驗底物為乾物質重 量比為30 :70的玉米和羊草。稱取乾物質0. 5g的混合底物，置入120mL產氣瓶中，再將產 氣瓶置於厭氧培養箱中。晨飼前，從3頭瘻管奶牛瘤胃的3個不同位點共抽取大約2L左 右的瘤胃液，經4層紗布過濾後，與9倍體積的厭氧人工唾液混合後，得到人工瘤胃液。取 50mL人工瘤胃液於每個產氣瓶，紫蘇子組添加500 μ L、濃度為40mg/mL的紫蘇子果實提取 物DMS0溶液，終濃度為0. 4g/L，即每克乾物質添加40mg紫蘇子果實提取物。對照組添加 DMS0500 μ L，每個處理組3個重複，隨機置於39±0. 5°C的恆溫箱中培養。24h後，用氣相色 譜儀測量甲烷產量和揮發性脂肪酸。取lml發酵液，用酶標儀比色法測定銨態氮濃度。取 2ml發酵液，C-Tab法提取基因組DNA，進一步使用Real-time PCR絕對定量總細菌、原蟲、 真菌和甲烷菌。
[0046] 紫蘇子組相對對照組甲烷產量降低了 63. 3%，揮發性脂肪酸和氨態氮濃度兩個處 理組沒有差異，數據見表1。紫蘇子組原蟲、真菌和甲烷菌的拷貝數顯著低於對照組，而總細 菌數則沒有差異，數據見表2。
[0047] 表1紫蘇子果實提取物對瘤胃體外發酵甲烷生成量、揮發性脂肪酸和銨態氮的影 響
[0048]
【權利要求】
1. 一種提高反芻動物肉奶CLA含量的天然產物製劑，其特徵在於：該天然產物製劑是 由紫蘇子果實粉碎後，經質量百分含量60-80%的乙醇溶液提取，通過氮吹和冷凍乾燥得到 的乾粉。
2. -種權利要求1所述的天然產物製劑的製備工藝，其特徵在於該工藝包括如下步 驟：用中藥粉碎機將紫蘇子果實粉碎為粉末狀，加入適量質量百分含量60-80%的乙醇溶液 混合均勻，經漩渦振蕩、旋轉混合器混合、離心後，吸取上清液至冷凍瓶，氮吹儀吹乾後，冷 凍乾燥得到天然產物製劑乾粉。
3. 根據權利要求2所述的製備工藝，其特徵在於該工藝具體包括如下步驟： (1) 用中藥粉碎機將紫蘇子果實粉碎為粉末狀，放入離心管中，加入適量70%乙醇溶 液； (2) 漩潤振蕩一35rpm旋轉混合器混合30min -漩潤振蕩一35rpm旋轉混合器混合 30min - 3000rpm 離心 5min ; (3) 吸取上清液至冷凍瓶，氮吹儀吹乾； (4) 離心管中沉澱保留，繼續添加適量70%乙醇溶液一漩渦振蕩器一旋轉混合器 30min -漩潤振蕩器一旋轉混合器30min -漩潤振蕩器一旋轉混合器30min - 3000rpm離 心 5min ; (5) 吸取上清液至已吹乾的冷凍瓶，氮吹儀吹乾，冷凍乾燥機24 - 48h至乾粉，待升至 室溫稱重，封瓶，_20°C保存。
4. 一種權利要求1所述的天然產物製劑在減少瘤胃微生物甲烷生成、提高反芻動物 肉奶CLA含量中的應用，其特徵在於：該天然產物製劑在每克飼料中的添加量為35-45mg。
5. 根據權利要求4所述的應用，其特徵在於：該天然產物製劑在使用時用DMSO稀釋至 35_45mg/mL〇
【文檔編號】A23K1/16GK104206797SQ201410335180
【公開日】2014年12月17日 申請日期:2014年7月15日 優先權日:2014年7月15日
【發明者】王佳堃, 劉美, 劉建新 申請人:浙江大學