一種抗原肽和NOD1抗體及應用、製備方法和試劑盒與流程

2023-04-28 09:25:22 3

本發明涉及生物
技術領域：
，具體而言，涉及一種抗原肽和nod1抗體及應用、製備方法和試劑盒。
背景技術：
：nod1(nucleotide-bindingoligomerizationdomain-containingproteins-1，核苷酸寡聚化結構域1，屬nlr受體家族，nlrs)是近年來發現的胞質型模式識別受體，它通過識別病原相關分子模式(pamps)迅速啟動先天性免疫，並能通過信號傳導啟動適應性免疫，在機體的免疫防禦中發揮重要作用。nlrs由nod亞家族、nalp亞家族和其他3個成員組成。nod1作為最具代表性的nod亞家族成員，在先天性免疫中參與炎症反應和細胞凋亡過程，也與一些炎症性疾病的發生有關。目前，哺乳動物nod1基因的功能和作用機制的研究日益深入，但禽類nod1的研究起步較晚，相關研究報導較少，這與目前缺乏相應的特異性抗體，使得在蛋白水平對禽類的nod1進行功能和機制研究受到限制有關。鑑於此，特提出本發明。技術實現要素：本發明的目的在於提供一種抗原肽，該抗原肽可用於免疫動物，製備可特異性識別結合禽類nod1蛋白的nod1抗體。本發明的另一目的在於提供上述抗原肽在製備抗體中的應用。本發明的另一目的在於提供一種nod1抗體的製備方法。通過該方法可製備出效價高、特異性好的可檢測nod1蛋白的nod1抗體。本發明的另一目的在於提供一種nod1抗體，其由上述製備方法製備得到，其具有特異性好、效價高的特點。本發明的另一目的在於提供上述nod1抗體在檢測nod1蛋白中的應用。本發明的另一目的在於提供一種用於檢測nod1蛋白的試劑盒。本發明是這樣實現的：一種抗原肽，其包括seqidno:1所示的多肽片段。上述抗原肽在製備用於特異性結合nod1蛋白的抗體中的應用。一種nod1抗體的製備方法，其包括：用上述的抗原肽免疫動物。一種nod1抗體，其由上述的nod1抗體的製備方法所製得。上述的nod1抗體在檢測nod1蛋白中的應用。一種用於檢測nod1蛋白的試劑盒，其包括上述的nod1抗體。本發明的有益效果是：本發明提供的抗原肽包括有seqidno:1所示的多肽片段，可用於免疫動物，製備可特異性識別結合nod1蛋白的nod1抗體；此外，本發明提供的nod1抗體具有效價高、特異性好的特點，可有效地檢測出組織和細胞中的nod1蛋白尤其是鴨nod1蛋白，具有很強的應用前景。附圖說明為了更清楚地說明本發明實施例的技術方案，下面將對實施例中所需要使用的附圖作簡單地介紹，應當理解，以下附圖僅示出了本發明的某些實施例，因此不應被看作是對範圍的限定，對於本領域普通技術人員來講，在不付出創造性勞動的前提下，還可以根據這些附圖獲得其他相關的附圖。圖1為本發明實施例4提供的採用實施例3的nod1抗體通過western法檢測組織和細胞中nod1蛋白結果圖；圖2為本發明實施例5提供的採用實施例3的nod1抗體通過免疫細胞化學方法檢測鴨巨噬細胞中nod1蛋白結果圖；圖3為本發明本實施例3提供的nod1抗體的westernblot檢測結果圖。具體實施方式為使本發明實施例的目的、技術方案和優點更加清楚，下面將對本發明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述。實施例中未註明具體條件者，按照常規條件或製造商建議的條件進行。所用試劑或儀器未註明生產廠商者，均為可以通過市售購買獲得的常規產品。下面對本發明實施例的一種抗原肽和nod1抗體及應用、製備方法和試劑盒進行具體說明。一方面，本發明提供了一種抗原肽，其包括seqidno:1所示的多肽片段。本發明的研究表明，seqidno:1所示的多肽片段與大分子載體蛋白偶聯後，將該多肽片段免疫動物例如兔後得到抗體可以特異性識別結合鴨nod1蛋白，能夠檢測出組織和細胞中的nod1蛋白。將本發明提供的抗原肽免疫動物例如兔後可以得到特異性識別結合鴨nod1蛋白的抗體，應用該抗體能夠檢測出組織和細胞中的nod1蛋白例如鴨nod1蛋白。因此，容易理解，含有或包括或具有seqidno:1所示的多肽片段的抗原肽也應當具有相同的或類似的免疫原性。進一步地，在本發明的一些實施方案中，上述抗原肽的胺基酸序列如seqidno:2所示。seqidno:2所示上述的抗原肽相對於seqidno:1所示的多肽片段在n端加c(半胱氨酸)，以便於更好的與載體偶聯。另一方面，本發明提供了上述抗原肽在製備用於特異性結合nod1蛋白的抗體中的應用。例如，將上述抗原肽免疫動物製備出可以特異性結合nod1蛋白的抗體。另一方面，本發明提供了一種nod1抗體的製備方法，其包括以下步驟：s1偶聯：將上述的抗原肽與載體蛋白偶聯。其中，載體蛋白可以是鑰孔血藍蛋白(klh)、牛血清白蛋白、或卵清白蛋白。通過與載體蛋白的偶聯，可以提高抗原肽的免疫原性。優選地，在本發明的一些實施方案中，通過異型雙功能連接劑(m‐maleimidobenzoyl‐n‐hydoxysuccinimideester，mbs)將抗原肽與klh偶聯。可選地，在本發明的一些實施方案中，按如下方法進行偶聯。a.將適量的klh放入濃度為10mg/ml的偶聯緩衝液(硼酸鹽緩衝液,ph8.5)中使之溶解。b.轉移完全溶解的klh溶液到透析袋中，室溫2小時或4℃透析過夜，去除多餘的偶聯緩衝液。c.在一個乾淨的小瓶中用10mg/ml二甲基甲醯胺(dmf)溶解mbs。d.將溶解的klh溶液和mbs溶液以體積比為10:1的比例混合。e.室溫下，將klh和mbs共同孵育30分鐘以激活klh。在孵育過程中應多次搖動瓶子。f.將偶聯緩衝液加到sephadexg-25樹脂柱中洗滌樹脂，並用核酸蛋白檢測器檢測280nm的吸光度值，直到a280值穩定。g.將配製好的活化的klh的溶液上柱以去除多餘的mbs和反應副產物。h.收集流出的活化的klh的液體到新的乾淨離心管中。i.按1:1(w/w)的比例將活化的klh添加到溶解的多肽瓶中。j.將瓶置於室溫下3小時以使多肽和klh偶聯。k.將抗原肽-klh偶聯物溶液移到透析袋中4℃過夜透析以去除多餘pbs緩衝液。l.將抗原肽-klh偶聯物溶液小等分分裝後儲存在‐20℃，備用。s2免疫：將得到的偶聯物免疫動物。其中，為了提高抗體的產量，免疫的次數為兩次或兩次以上。可選地，在本方明的一些實施方案中，按如下方法進行免疫。a.實驗前採集動物血液，並製備免疫前血清。b.初次免疫：每隻兔子皮下多點注射乳化的1ml上述偶聯物和弗氏完全佐劑的混合液(體積比1:1)，多肽抗原含量為0.5mg；c.第一次加強免疫：初次免疫後14天，每隻兔子皮下多點注射乳化的1ml偶聯物與弗氏不完全佐劑混合液，抗原肽含量為0.5mg；d.一周後，採集血液製備血清，檢測效價。第二次加強免疫，同第一次加強免疫。e.一周後，採集血液製備血清，檢測效價。第三次加強免疫，同第一次和第二次加強免疫。f.一周後，採集血液製備血清，檢測效價。s3純化：親和純化免疫血清獲取抗體可選地，在本發明的一些實施方案中，按如下方法進行純化。a.將製備的免疫血清用pbs緩衝液調ph值為8.0。b.將上述血清加入到proteina的親和微珠上，比例為10:1，即10ml的免疫血清加入1ml微珠，室溫孵育1h，輕輕搖動混勻。c.將抗體包被的微珠轉入合適的層析柱中，用pbs衝洗，收集流出的衝洗液直到a280吸光度穩定。d.添加50mmol/l甘氨酸(ph3.0)洗脫結合到微球柱的抗體，收集洗脫液，立即添加tris緩衝液到含有抗體的管中中和洗脫液至ph＝7.0值.e.轉移含抗體的洗脫液到透析袋，4℃過夜透析以去除pbs。f.用濃度為0.02％的疊氮化鈉緩衝液加入抗體中，4℃儲存。在本發明的一些實施方案中，按如下方法檢測效價。a.用1％牛血清白蛋白(bsa)溶液稀釋純化的抗體或免疫後獲得的免疫血清，每孔加入100μl抗原稀釋液，濃度為4μg/ml。b.用粘合塑料覆蓋膜蓋板，置於37℃孵育2小時或在4℃過夜。c.用200μl的pbst(含0.1％tween20)的pbs洗板三次。d.每孔中添加200μl5％bsa封閉液以阻斷包被板的非特異性結合位點。e.用粘合塑料覆蓋膜蓋板，置於37℃孵育1小時或在℃過夜。f.用200μl的pbst洗板三次。g.用1％bsa按1:1000的比例稀釋獲得的免疫血清(或者是nod1抗體作為一抗)，然後再2倍梯度稀釋，每板加入100μl稀釋的抗血清。h.用粘合塑料板蓋板，置於37℃孵育1小時或4℃過夜。i.用200μl的pbst洗板三次。j.用1％bsa按1:5000的比例稀釋二抗(anti-rabbitigg(h&l)(goat)antibodyperoxidaseconjugated)，每孔加入100μl。k.用粘合塑料板蓋板，置於37℃孵育30分鐘。l.用200μl的pbst洗板五次。m.每孔中加入100μl四甲基聯苯胺(tmb)顯色液。n.充分顯色15-20分鐘，每孔添加100μl的終止液。o.在450nm波長下讀出每個孔的吸光度值。根據結果判斷elisa的效價。另一方面，本發明提供了一種nod1抗體，其由上述的nod1抗體的製備方法所製得。該nod1抗體為多克隆抗體。另一方面，本發明提供了上述的nod1抗體在檢測nod1蛋白中的應用。進一步地，在本發明的一些實施方案中，上述檢測包括western檢測和免疫檢測中的一種。另一方面，本發明提供了一種用於檢測nod1蛋白的試劑盒，其包括權利上述的nod1抗體。需要說明的是，本發明中的所指的動物可以是兔、雞、牛、羊、小鼠以及馬中的一種。以下結合實施例對本發明的特徵和性能作進一步的詳細描述。實施例1本實施例提供了一種抗原肽，其胺基酸序列如eqidno:1所示，為：nlisqeeakafene。本實施例提供的抗原肽可用於免疫動物，能夠製備出可特異性識別結合nod1蛋白的nod1抗體。實施例2本實施例提供了一種抗原肽，其胺基酸序列如eqidno:2所示，為：cnlisqeeakafene。本實施例提供的抗原肽相對於實施例1提供的抗原肽在n端加c(半胱氨酸)以便於更好的與載體偶聯。本實施例提供的抗原肽可通過人工合成(南京金斯瑞生物科技有限公司)的方式得到，合成的抗原肽進行ms鑑定，鑑定正確後進行純化。採用hplc法進行抗原肽的分離純化並進行純度鑑定，經檢測抗原肽的純度為95.9％。本實施例提供的抗原肽具有免疫原性，可用於免疫動物，能夠製備出可特異性識別結合nod1蛋白的nod1抗體。實施例3本實施例提供了nod1抗體的製備方法，其包括如下步驟：1用mbs將實施例2提供的抗原肽與klh偶聯，具體如下：1.1將適量的klh放入濃度為10mg/ml的偶聯緩衝液(硼酸鹽緩衝液,ph8.5)中使之溶解。1.2轉移完全溶解的klh溶液到透析袋中，室溫2小時或4℃透析過夜，去除多餘的偶聯緩衝液。1.3在一個乾淨的小瓶中用10mg/ml二甲基甲醯胺(dmf)溶解mbs。1.4將溶解的klh溶液和mbs溶液以體積比為10:1的比例混合。1.5室溫下，將klh和mbs共同孵育30分鐘以激活klh。在孵育過程中應多次搖動瓶子。1.6將偶聯緩衝液加到sephadexg-25樹脂柱中洗滌樹脂，並用核酸蛋白檢測器檢測280nm的吸光度值，直到a280值穩定。1.7將配製好的活化的klh的溶液上柱以去除多餘的mbs和反應副產物。1.8收集流出的活化的klh的液體到新的乾淨離心管中。1.9按1:1(w/w)的比例將活化的klh添加到溶解的抗原肽瓶中。1.10將瓶置於室溫下3小時以使抗原肽和klh偶聯。1.11將抗原肽-klh偶聯物溶液移到透析袋中4℃過夜透析以去除多餘pbs緩衝液。1.12將抗原肽-klh偶聯物溶液小等分分裝後儲存在-20℃，備用，或直接用於後續步驟。2將上述獲得的偶聯物免疫紐西蘭兔2.1實驗前採集動物血液，並製備免疫前血清。2.2初次免疫：每隻兔子皮下多點注射乳化的1ml上述偶聯物和弗氏完全佐劑的混合液(體積比1:1)，其中，抗原肽含量為0.5mg。2.3第一次加強免疫：初次免疫後14天，每隻兔子皮下多點注射乳化的1ml抗原肽-klh偶聯物溶液與弗氏不完全佐劑混合液，其中，抗原肽含量為0.5mg。2.4一周後，採集血液製備血清，檢測效價。第二次加強免疫，同第一次加強免疫。2.5一周後，採集血液製備血清，檢測效價。第三次加強免疫，同第一次和第二次加強免疫。2.6一周後，採集血液製備血清，檢測效價。3.採用elisa法檢測抗原肽免疫紐西蘭兔後獲得的免疫血清的效價，操作如下：3.1用1％牛血清白蛋白(bsa)溶液稀釋純化的實施例2提供的抗原肽，每孔加入100μl抗原稀釋液，濃度為4μg/ml。3.2用粘合塑料覆蓋膜蓋板，置於37℃孵育2小時或在4℃過夜。3.3用200μl的pbst(含0.1％tween20)的pbs洗板三次。3.4每孔中添加200μl5％bsa封閉液以阻斷包被板的非特異性結合位點。3.5用粘合塑料覆蓋膜蓋板，置於37℃孵育1小時或在℃過夜。3.6用200μl的pbst洗板三次。3.7用1％bsa按1:1000的比例稀釋獲得的抗血清，然後再2倍梯度稀釋，每板加入100μl稀釋的抗血清。3.8用粘合塑料板蓋板，置於37℃孵育1小時或4℃過夜。3.9用200μl的pbst洗板三次。3.10用1％bsa按1:5000的比例稀釋二抗(anti-rabbitigg(h&l)(goat)antibodyperoxidaseconjugated)，每孔加入100μl。3.11用粘合塑料板蓋板，置於37℃孵育30分鐘。3.12用200μl的pbst洗板五次。3.13每孔中加入100μl四甲基聯苯胺(tmb)顯色液。3.14充分顯色15-20分鐘，每孔添加100μl的終止液。3.15在450nm波長下讀出每個孔的吸光度值。根據結果判斷elisa的效價。結果見表1。表1稀釋倍數od值nc1:10000.08711:10002.75421:20002.68231:40002.61741:80002.39251:160002.07161:320001.78571:640001.28481:1280000.82791:2560000.498101:5120000.30611空白0.04912空白0.049效價1:512000註：其中nc為免疫前血清，作為陰性對照，開始稀釋度為1:1000稀釋，效價的判定以最高的稀釋度的od值/空白的od值≥2為標準。表中1-10代表步驟2.6得到的血清按不同比例稀釋後的檢測結果。從表1可看出，獲得的免疫血清的效價達到1:512000，由此可見，本發明提供的nod1抗體的製備方法可製備出效價高的nod1抗體。4免疫血清的親和純化，按如下步驟進行：4.1將步驟2.6得到的免疫血清用pbs緩衝液調ph值為8.0。4.2將上述免疫血清加入到proteina的親和微珠上，比例為10:1，即10ml的免疫血清加入1ml微珠，室溫孵育1h，輕輕搖動混勻。4.3將抗體包被的微珠轉入合適的層析柱中，用pbs衝洗，收集流出的衝洗液直到a280吸光度穩定。4.4添加50mmol/l甘氨酸(ph3.0)洗脫結合到微球柱的nod1抗體，收集洗脫液，立即添加tris緩衝液到含有抗體的管中中和洗脫液至ph＝7.0值.4.5轉移含nod1抗體抗體的洗脫液到透析袋，4℃過夜透析以去除pbs。4.6用濃度為0.02％的疊氮化鈉緩衝液加入nod1抗體中，4℃儲存。即得到純化的nod1抗體，經westernblot檢測，抗體純度為92％(如圖3所示，圖中：m代表蛋白marker；1代表得到的nod1抗體)。本實施例還提供了由上述方法製備得到的nod1抗體。實施例4採用western法將實施例3提供的nod1抗體用於檢測組織和細胞中nod1蛋白，具體操作如下：①配膠：分離膠為10％，上層膠為4％。②加樣：將高郵鴨的脾臟、肝臟、小腸組織和細胞樣品提取蛋白，加入蛋白上樣緩衝液100℃變性處理後上樣，上樣量為10ul，100v恆壓電泳2h。③轉膜：溼轉，100v，2h。④封閉：將膜取出後放入入溶於tbst溶液的5％脫脂奶粉溶液中，室溫放置1h。⑤加一抗：使用的一抗為實施3製備的nod1抗體，稀釋濃度為1:500，稀釋液為5％脫脂奶粉，4℃孵育過夜。⑥洗膜：第二天取出，室溫搖床放置30分鐘平衡至室溫後，tbst洗膜5次，每次5分鐘。⑦加二抗：二抗為商品化的山羊抗兔抗體，稀釋度為1:10000，稀釋液為5％脫脂奶粉，室溫孵育半小時。⑧洗膜tbst洗膜5次，每次5分鐘。⑨顯影：加顯影底物ecl，x膠片曝光。結果如圖1所示。通過western法可檢測到高郵鴨肝臟、脾臟、小腸組織和鴨巨噬細胞中nod1的表達，其條帶在105kb左右，與目標條帶相符。表明實施例3提供的nod1抗體可以通過western法檢測出組織和細胞中的nod1蛋白。實施例5採用免疫細胞化學方法將實施例3提供的nod1抗體用於檢測鴨巨噬細胞中nod1蛋白，具體方法如下：①分離培養鴨巨噬細胞於6孔細胞板中，密度為5*105個/ml。②24h後，移去培養液，用pbs洗3次，每次5min。③4％多聚甲醛固定15min，pbs洗3次，每次5min。④0.5％tritonx-100孵育30min，pbs洗3次，每次5min。⑤3％h2o2孵育15min，pbs洗3次，每次5min。⑥按1:200的比例稀釋一抗(實施例3提供的nod1抗體)，加入200ul，溼盒中4℃過夜。⑦第二天取出，移除一抗，pbs洗3次，每次5min。⑧按1:1000的比例加入二抗(羊抗兔igg-fitc)，溼盒中孵育1h。⑨取出板後移除二抗，pbs洗3次，每次5min。⑩樹脂封片後，螢光顯微鏡下觀察螢光。結果如圖2所示(圖中：nod1多抗即為nod1抗體)，加入nod1抗體的實驗組可見明顯的螢光，未加入鴨nod1多克隆抗體的對照組未見明顯的螢光，說明採用免疫細胞的方法以實施例3提供的nod1抗體可作為一抗用於鴨巨噬細胞中nod1蛋白的檢測。綜上，本發明實施例提供的抗原肽包括有seqidno:1所示的多肽片段，將其與載體蛋白偶聯後，可用於免疫動物，製備可特異性識別結合nod1蛋白的nod1抗體；此外，本發明提供的nod1抗體具有效價高、特異性好的特點，可有效地檢測出組織和細胞中的nod1蛋白尤其是鴨nod1蛋白，具有很強的應用前景。以上所述僅為本發明的優選實施例而已，並不用於限制本發明，對於本領域的技術人員來說，本發明可以有各種更改和變化。凡在本發明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護範圍之內。sequencelisting江蘇省家禽科學研究所一種抗原肽和nod1抗體及應用、製備方法和試劑盒2patentinversion3.5114prt人工序列1asnleuileserglngluglualalysalaphegluasnglu1510215prt人工序列2cysasnleuileserglngluglualalysalaphegluasnglu151015當前第1頁12