一種TIL細胞培養基及其製備方法與流程

2023-04-26 01:15:36 1

本發明涉及培養基技術領域，尤其涉及一種TIL細胞培養基及其製備方法。

背景技術：

目前TIL細胞(即腫瘤浸潤淋巴細胞)培養多用RPMI-1640或者DMEM培養基，但由於TIL細胞自身增殖能力不強，單純的RPMI-1640或者DMEM培養基無法提高TIL細胞生長必須的營養成分，因此目前培養TIL細胞多用含有10～20wt％胎牛血清的RPMI-1640或者DMEM培養基。但是使用胎牛血清培養TIL細胞存在多種問題，不僅增加了培養基的成本，而且不同品牌的胎牛血清之間差異較大，另外由於胎牛血清中成分複雜，這些成分會嚴重影響後續實驗的準確性和可靠性，培養基可重複性差，培養效率僅為15～20％。而且由於臨床所使用的細胞製品嚴禁殘留動物血清蛋白，而常規培養基中存在胎牛血清，工藝上需要增加細胞製成品中牛血清蛋白殘餘檢測，增加了生產難度和成本，促使人們開始進行無血清培養基的開發。

因此目前TIL細胞培養基存在培養效率不高、細胞活性低下、後續實驗幹擾、動物血清蛋白殘留等較大的問題。

技術實現要素：

基於背景技術存在的技術問題，本發明提出了一種TIL細胞培養基及其製備方法，提高了TIL細胞培養效率，增加細胞活性，保證後續實驗的可重複性，降低了TIL細胞培養基的使用成本，而且避免動物血清蛋白的摻入，節省了TIL細胞培養基的配置工序和成本。

本發明提出的一種TIL細胞培養基，其組分包括：RPMI-1640培養基、白 介素-2、內皮細胞生長因子、煙酸、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子、腫瘤壞死因子α。

優選地，白介素-2的終濃度為5～20μg/L，內皮細胞生長因子的終濃度為0.1～0.5μg/L，煙酸的終濃度為30～100μg/L，粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子的終濃度為20～100μg/L，腫瘤壞死因子α的終濃度為10～50μg/L。

優選地，白介素-2的終濃度為10μg/L，內皮細胞生長因子的終濃度為0.2μg/L，煙酸的終濃度為50μg/L，粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子的終濃度為50μg/L，腫瘤壞死因子α的終濃度為20μg/L。

優選地，所述TIL細胞培養基的pH值為7.35～7.40。

本發明還提出的上述TIL細胞培養基的製備方法，向RPMI-1640培養基中加入白介素-2完全溶解後，靜置，再加入內皮細胞生長因子完全溶解後，靜置，接著加入煙酸完全溶解後，靜置，繼續加入粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子完全溶解後，靜置，然後加入腫瘤壞死因子α完全溶解後，靜置，接著調節pH值，然後濾膜過濾得到TIL細胞培養基。

優選地，濾膜的孔徑為0.1μm，用於去除培養基中的雜質及可能含有的微生物。

優選地，採用丙酮酸鈉調節pH值。

優選地，靜置時間均為4～6min。

為了提高TIL細胞培養效率，增加TIL細胞活性，保證後續實驗的可重複性，本發明在RPMI-1640培養基的基礎之上，完全不加入胎牛血清，針對RPMI-1640培養基本身營養較差的特點，創新性地加入多種營養物質，包括白介素-2、內皮細胞生長因子、煙酸、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子和腫瘤壞死因子α，各種成分濃度固定，培養基配置可重複性好，同時降低了TIL細胞培養 基的使用成本，而且避免動物血清蛋白的摻入，節省了TIL細胞培養基的配置工序和成本。

具體實施方式

下面，通過具體實施例對本發明的技術方案進行詳細說明。

實施例1

本發明提出的一種TIL細胞培養基，其組分包括：RPMI-1640培養基、白介素-2、內皮細胞生長因子、煙酸、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子、腫瘤壞死因子α；其中，白介素-2的終濃度為5μg/L，內皮細胞生長因子的終濃度為0.5μg/L，煙酸的終濃度為30μg/L，粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子的終濃度為100μg/L，腫瘤壞死因子α的終濃度為10μg/L。

本發明還提出的上述TIL細胞培養基的製備方法，向RPMI-1640培養基中加入白介素-2完全溶解後，靜置6min，再加入內皮細胞生長因子完全溶解後，靜置4min，接著加入煙酸完全溶解後，靜置6min，繼續加入粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子完全溶解後，靜置4min，然後加入腫瘤壞死因子α完全溶解後，靜置6min，接著採用丙酮酸鈉調節pH值至7.35，然後孔徑為0.1μm的濾膜過濾得到TIL細胞培養基。

實施例2

本發明提出的一種TIL細胞培養基，其組分包括：RPMI-1640培養基、白介素-2、內皮細胞生長因子、煙酸、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子、腫瘤壞死因子α；其中，白介素-2的終濃度為20μg/L，內皮細胞生長因子的終濃度為0.1μg/L，煙酸的終濃度為100μg/L，粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子的終濃度為20μg/L，腫瘤壞死因子α的終濃度為50μg/L。

本發明還提出的上述TIL細胞培養基的製備方法，向RPMI-1640培養基中 加入白介素-2完全溶解後，靜置4min，再加入內皮細胞生長因子完全溶解後，靜置6min，接著加入煙酸完全溶解後，靜置4min，繼續加入粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子完全溶解後，靜置6min，然後加入腫瘤壞死因子α完全溶解後，靜置4min，接著採用丙酮酸鈉調節pH值至7.38，然後孔徑為0.1μm的濾膜過濾得到TIL細胞培養基。

實施例3

本發明提出的一種TIL細胞培養基，其組分包括：RPMI-1640培養基、白介素-2、內皮細胞生長因子、煙酸、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子、腫瘤壞死因子α；其中，白介素-2的終濃度為10μg/L，內皮細胞生長因子的終濃度為0.2μg/L，煙酸的終濃度為50μg/L，粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子的終濃度為50μg/L，腫瘤壞死因子α的終濃度為20μg/L。

本發明還提出的上述TIL細胞培養基的製備方法，在室溫為20～25℃、溼度為40～60％、處於常壓狀態的二級生物安全櫃中，向500mL RPMI-1640培養基中加入5μg白介素-2完全溶解後，靜置5min，再加入0.1μg內皮細胞生長因子完全溶解後，靜置5min，接著加入25μg煙酸完全溶解後，靜置5min，繼續加入25μg粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子完全溶解後，靜置5min，然後加入10μg腫瘤壞死因子α完全溶解後，靜置5min，接著採用丙酮酸鈉調節pH值至7.40，然後孔徑為0.1μm的濾膜過濾去除所有微生物得到TIL細胞培養基。

實施例3所得TIL細胞培養基為酚紅色液體，澄清無渾濁。

取實施例3所得TIL細胞培養基在37℃、5％CO2條件下空培96h，外觀無明顯變化，顯微鏡下未見渾濁物。

取實施例3所得TIL細胞培養基在37℃、5％CO2條件下培養TIL細胞，48h採用細胞計數及MTS法檢測細胞活性，細胞培養效率達50％以上，具有增殖活 性的TIL細胞>90％。

以上所述，僅為本發明較佳的具體實施方式，但本發明的保護範圍並不局限於此，任何熟悉本技術領域的技術人員在本發明揭露的技術範圍內，根據本發明的技術方案及其發明構思加以等同替換或改變，都應涵蓋在本發明的保護範圍之內。