一種重組蛋白質發酵液的分離方法

2023-04-26 00:32:06

專利名稱：：一種重組蛋白質發酵液的分離方法
技術領域：
：本發明涉及一種生物發酵液分離方法，特別涉及一種對微生物發酵的重組蛋白質發酵液的分離方法。
背景技術：
：在生物發酵液分離領域，重組蛋白質發酵液的分離方法目前主要包括離心技術、板框過濾技術和膜分離技術。離心技術是根據顆粒在作勻速圓周運動時受到一個外向的離心力的行為而發展起來的一種分離技術。利用該技術進行固液分離在多個領域廣泛應用，諸如分離出化學反應後的沉澱物，天然的生物大分子、無機物、有機物，在生物化學以及其它的生物學領域常用來收集細胞、細胞器及生物大分子物質。隨著技術的進步，針對不同狀態的料液，發展了包括疊片式離心機和連續流離心機在內的多種離心手段，但這些離心技術存在著其固有的難以克服的缺點，包括運行動力成本高、難以處理大量的高含固量的料液等。板框過濾技術用於重組蛋白質藥物生產中的固液分離，其優點是設備投入少，成本低，其缺點是需要較大的人力投入，存在大量的人工操作，從而難以實現很好的批次重複性；完全的密封困難，產品收率低；染菌料液處理困難，難以保證不同料液澄清度一致(中國生物工程雜誌，2004，24(4):81-85)。膜分離技術中，根據所用膜的材料可分為高分子膜、無機膜和液體膜。常用的是高分子膜，其次是無機膜。高分子膜材料有纖維素類、聚醯胺類、芳香雜環類、聚碸類、聚烯烴類、矽橡膠類、含氟高分子類等。高分子膜優點是種類多，可選擇性大，價格低，膜組件結構較簡單等；缺點是化學穩定性和熱穩定性差，易受微生物降解，易壓密等。無機膜多以金屬、金屬氧化物、陶瓷等製成，可以耐高溫、高壓，化學性質穩定，壽命長，物料通量大，允許使用苛刻的清洗條件；缺點是膜脆，易碎，設備費高(膜分離技術，化學工業出版社，1998)。常用的高分子膜膜組件結構型式主要有平板式、管式、巻式和中空纖維式4種。平板式膜組件常用板框式結構，其優點是膜的清洗和更換容易，料液流通截面積大，不易堵塞；缺點是密封難度大，部件加工精度要求高，料液流程短，為達到一定濃縮度需多次循環，常用於小型選膜實驗中。管式膜組件結構原理類似於管式換熱器，它的優點是料液流速可調範圍大，可處理懸浮固體濃度較高的料液，清洗方便；缺點是單位體積膜面積較小，造價高。巻式膜組件結構與螺旋板換熱器類似，單位體積中膜面積大；但壓力降大，膜層間易堵塞，清洗困難。中空纖維膜的外徑為0.52mm，可在膜組件內自行支撐，膜組件單位體積內膜面積大，壓力降小；但是易堵塞，料液需要預處理(河北科技大學學報，2002，23(3):21_26)。陶瓷膜在生物化工領域的應用涉及細胞脫除、無菌水生產以及低分子有機物的澄清和生物膜反應器等。目前，陶瓷膜在製藥產業中的應用主要涉及微生物製藥中小分子生物發酵液的固液分離。蔡躍明等公開了利用陶瓷膜分離乳酸、酒精等小分子生物發酵液的方法(CN1245247C，2006.3.15)。Kim等(JClea證Prod，1997，5(4):263267)用截流相對分子質量為50000的無機陶瓷膜超濾釜餾物，截流的大分子和固體殘渣經離心機處理後壓成餅粕，滲透液的主要成分是水和小分子還原糖。微生物發酵的重組蛋白質發酵液，例如，重組人血白蛋白發酵液、重組人轉鐵蛋白發酵液等酵母發酵液以及重組腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體發酵菌體裂解液、重組L-山梨酮脫氫酶發酵菌體裂解液等大腸桿菌發酵菌體裂解液等，該類發酵液的待分離物質均為數萬道爾頓的大分子蛋白產物，而且還含有菌體細胞和懸浮固體等雜質。對於上述重組蛋白質發酵液的分離方法，本領域技術人員急需一種有效的解決方案。
發明內容發明人通過多年研究，利用陶瓷膜對多種重組蛋白質發酵液進行了大量的實驗，成功地實現了大分子蛋白質產物與菌體細胞、懸浮固體等雜質的有效分離。具體地，本發明涉及(1)—種利用陶瓷膜對重組蛋白質發酵液進行固液分離的方法，其特徵在於，將發酵液在030°C的溫度下加壓到0.10.6Mpa後進入陶瓷膜過濾系統，發酵液中的菌體細胞和懸浮固體被截留在膜的進料一側，流出的滲透液即為重組蛋白質產物溶液。(2)根據項(1)所述的分離方法，其中的陶瓷膜孔徑為0.012微米，優選為0.21.2微米，特別優選為0.50.8微米。(3)根據項(1)或(2)所述的分離方法，其中發酵液溫度為829t:，優選為1026°C。(4)根據項(1)或(2)所述的分離方法，其中重組蛋白質發酵液進入陶瓷膜過濾系統前的壓力為0.20.5Mpa，優選為0.3Mpa。(5)根據項(1)或(2)所述的分離方法，其中重組蛋白質發酵液的pH值為5.08.O，優選為6.0。(6)根據項(1)或(2)所述的分離方法，其中重組蛋白質發酵液在陶瓷膜過濾系統中的流通量為30100升/米2小時，優選為75升/米2小時。(7)根據項(1)或(2)所述的分離方法，其中重組蛋白質的分子量為l萬8萬道爾頓。(8)根據項(1)或(2)所述的分離方法，其中陶瓷膜過濾系統由一個或多個單元膜系統組成。(9)根據項(1)或(2)所述的分離方法，其中重組蛋白質的培養宿主為真核細胞或原核細胞。(10)根據項(1)或(2)所述的分離方法，其中重組蛋白質發酵液為微生物發酵的重組蛋白質發酵液。(11)根據項(1)或(2)所述的分離方法，其中重組蛋白質發酵液選自下列之一重組人血白蛋白發酵液、重組人轉鐵蛋白發酵液、重組腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體發酵菌體裂解液或重組L-山梨酮脫氫酶發酵菌體裂解液。本發明使用的陶瓷膜過濾系統可以由單個或多個陶瓷膜組成，其中的陶瓷膜(購自江蘇久吾高科股份有限公司)孔徑為0.012微米，優選為0.21.2微米，特別優選為0.50.8微米。所述陶瓷膜過濾系統也可以由一個或多個單元膜系統組成，其中的單元膜系統由多個陶瓷膜組成。上述陶瓷膜過濾系統或單元膜系統的組成方法為本領域的慣常手段，按照廠家說明書操作即可。本領域技術人員應當明白，為滿足對重組蛋白質產物溶液不同產量的要求，所述陶瓷膜過濾系統可以使用不同數量的陶瓷膜或單元膜系統。本發明中的重組蛋白質為利用分子生物學手段將目的基因導入原核或真核細胞中，利用發酵法生產目的基因所表達的蛋白質，培養宿主為酵母等真核細胞，也可以是原核細胞。作為舉例，本發明的重組蛋白質可以是微生物發酵的重組人血白蛋白、重組人轉鐵蛋白、重組腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體或重組L-山梨酮脫氫酶。進一步地，重組蛋白質發酵液進入陶瓷膜過濾系統前的壓力為0.10.6Mpa，優選為0.20.5Mpa，特別優選為0.3Mpa。發酵液溫度為030°C，優選為829°C，特別優選為1026t:，根據蛋白質的性質，溫度控制可以是恆溫，也可以是變溫。發酵液pH值為5.08.O，優選為6.0。發酵液在陶瓷膜過濾系統中的流通量為30100升/米2*小時，優選為75升/米2*小時。與採用連續流離心機或中空纖維膜等傳統分離工藝相比，本發明的重組蛋白質發酵液的分離方法，除了具有陶瓷膜的化學穩定性好(耐酸、耐鹼、耐氧化、耐有機溶劑)，耐高溫，機械強度大，耐磨性好，分離精度高(可達納米級過濾)以及易清洗等優點之外，還具有工藝穩定、成本低廉、分離精度極高，所需人力少，能夠與後續的層析處理達到更好的銜接，非常易於工業化等優點。具體地，本發明通過控制陶瓷膜過濾系統中重組蛋白質發酵液的溫度、壓力、流通量和陶瓷膜孔徑等參數，可以實現料液的高澄清度分離，降低層析的上柱壓力，提高層析柱處理流速，實現了與後續層析處理的更好銜接，提高了工作效率。另外，本發明提供的方法在大規模生產中可以採用小規模實驗中所確定的工藝參數，如陶瓷膜流道長度和管徑，只需數量上的線性增加，非常易於工業化放大，具有極高的產業化應用價值。圖1為陶瓷膜過濾系統流路示意圖。圖2為重組人血白蛋白發酵液SDS-PAGE電泳圖，其中泳道A為離心後上清，泳道B為經過陶瓷膜過濾後上清，泳道C為蛋白質分子量標準從大到小為(97400，66200，43000，31000)。圖3為重組腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體發酵液SDS-PAGE電泳圖，其中泳道A為離心後上清，泳道B為經過陶瓷膜過濾後上清，泳道C為蛋白質分子量標準從大到小為(97400，66200，43000，31000，20100，14400)。圖4為重組L-山梨酮脫氫酶發酵液SDS-PAGE電泳圖，其中泳道a為離心後上清PBAD/SND，泳道b為蛋白質分子量標準從大到小為(94000，67000，43000，30000)。圖5為重組人血白蛋白發酵液在陶瓷膜過濾系統中的通量衰減曲線。圖6為重組L-山梨酮脫氫酶發酵菌體裂解液在陶瓷膜過濾系統中的通量衰減曲線。具體實施例方式下述實施例具體闡述本發明重組蛋白質發酵液的分離方法，僅為本領域技術人員更好地理解本發明，不應解釋為對本發明的限制。實施例1利用陶瓷膜過濾重組人血白蛋白發酵液應用自有專利申請技術(CN1854301A和CN1854306A)構建的基因工程菌及生產方法獲得重組人血白蛋白發酵液，其菌體濃度為40%，蛋白質濃度16g/L，蛋白質分子量為66KD。在24-3(TC下，將上述發酵液(pH值為6.0)加壓到0.3Mpa後直接進入陶瓷膜過濾系統(陶瓷膜孔徑為0.5微米)。發酵液中的酵母細胞和懸浮固體等被截留在膜的進料一側，通過回流通路回到原料罐，而滲透液即為重組蛋白質產物溶液。當溼重達到60%(進料50L，滲透液為21L)時，開始通過清洗通路進行流加水操作，共流加水20L，當檢測到回流的濾渣液中溼重70%，濾渣液上清蛋白質濃度低於lg/L時停止收集，共獲得上清液45L。發酵液在陶瓷膜過濾系統中的通量衰減曲線見附圖5。發酵液電泳結果見圖2。具體實驗數據見下表。tableseeoriginaldocumentpage6實施例2利用陶瓷膜過濾重組人轉鐵蛋白發酵液應用自有技術構建的表達人轉鐵蛋白的釀酒酵母工程菌，經發酵所獲得發酵液的菌體濃度為20%，蛋白質濃度0.lg/L，蛋白質分子量為75KD。在24-26。C下，將上述發酵液(pH值為6.0)加壓到0.2Mpa後直接進入陶瓷膜過濾系統(陶瓷膜孔徑為1.2微米)，發酵液中的酵母細胞、懸浮固體等被截留在膜的進料一側，通過回流通路回到原料罐，而滲透液即為重組蛋白質產物溶液。當溼重達到60%(進料30L，滲透液為15L)時，開始通過清洗通路進行流加水操作，共流加水12L，當檢測到回流的濾渣液中溼重70%，濾渣液上清蛋白質濃度低於0.005g/L時停止收集，獲得上清液15L，累計獲得上清液30L。具體實驗數據見tableseeoriginaldocumentpage7平均通量98L/m2.h總收率104%，其中以離心收率為100%實施例3利用陶瓷膜過濾重組腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體發酵菌體裂解液應用自有技術構建的表達重組腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體的大腸桿菌工程菌，經發酵所獲得發酵液的菌體濃度為10%，目標蛋白質濃度為5g/L，蛋白質分子量為18KD。在4t:下超聲裂解菌體，將上述裂解液(pH值為7.0，固形物濃度為7%，離心稱重法測定)在10-15t:下加壓到0.5Mpa後直接進入陶瓷膜過濾系統(陶瓷膜孔徑為0.2微米)，裂解液中的微生物菌體碎片、懸浮固體等被截留在膜的進料一側，通過回流通路回到原料罐，而滲透液即為重組蛋白質產物溶液。當溼重達到50%(進料30L，滲透液為25L)時，開始通過清洗通路進行流加水操作，共流加水IOL，當檢測到回流的濾渣液中溼重70%，濾渣液上清蛋白質濃度低於O.lg/L時停止收集，獲得上清液llL，累計獲得上清液36L。發酵液電泳結果如圖3所示。具體實驗數據見下表。tableseeoriginaldocumentpage8tableseeoriginaldocumentpage8實施例4利用陶瓷膜過濾重組L-山梨酮脫氫酶發酵菌體裂解液利用自有專利技術(ZL200310116831.7)構建的基因工程菌進行發酵，所獲得大腸桿菌發酵液的菌體濃度為4%，蛋白質濃度2g/L，蛋白質分子量為45KD，將發酵液進行收集後，5000r/min下離心5min收集菌體，用pH8.0的化,04-化1^04緩衝液洗滌3次，按照1:10的比例將離心後的菌體溶解於超聲緩衝液(預冷的生理鹽水或pH8.0的Tris-HCl)中，500w，10s/10s破碎20分鐘。在4"下，將上述超聲裂解液(PH值為8.0)加壓到0.3Mpa後直接進入陶瓷膜過濾系統(陶瓷膜孔徑為0.5微米)，裂解液中的懸浮固體(包括細胞碎片和包涵體)被截留在膜的進料一側，通過回流通路回到原料罐，而滲透液即為重組蛋白質產物溶液。當溼重達到30%時，開始通過清洗通路進行流加水操作，共流加水25L，當檢測到回流的濾渣液上清蛋白質濃度低於0.05g/L時停止收集，共獲得上清液61L。發酵液電泳結果如圖4所示。裂解液在陶瓷膜過濾系統中的通量衰減曲線見附圖6。具體實驗數據見下表。tableseeoriginaldocumentpage9實施例5利用陶瓷膜過濾，實現更好的層析銜接將重組人血白蛋白發酵液分別進行離心(15t:，5000轉/分，30分鐘)和陶瓷膜過濾(實施例l)處理，離心後上清中有微量的固體懸浮，陶瓷膜透過液的澄清度明顯較高；將上述離心後上清和陶瓷膜透過液以同樣的純化工藝(申請人自有專利技術EP1504031B1，層析柱採用BPG140)處理，陶瓷膜透過液的層析上柱壓力較低(同樣線性流速下，離心後上清的上柱壓力為0.15MPa，陶瓷膜透過液的上柱壓力為0.09Mpa)。同樣的上柱壓力條件下，陶瓷膜透過液的上柱流速較高(離心後上清的上柱流速為80cm/h，陶瓷膜透過液的上柱流速120cm/h)，上樣時間較離心後上清縮短了50%，提高了層析工作效率，從而實現了更好的工藝銜接。實施例6陶瓷膜過濾的工業化放大試驗利用重組人血白蛋白發酵液進行三個階段的實驗。第一階段利用單個陶瓷膜完成，操作的具體參數為陶瓷膜孔徑為0.5微米，發酵液循環過濾系統溫度維持25t:，泵入壓力0.3MPa。當溼重達到60%時，開始通過清洗液通路進行流加水操作，流加水體積為初始發酵液體積的0.5倍，當檢測到回流的濾渣液中溼重70%，濾渣液上清蛋白質濃度低於lg/L時停止收集。第二階段和第三階段分別利用系統化集成16個和288個陶瓷膜(膜面積分別為3.5平方米和63平方米)進行中試和生產水平的實驗，實驗參數與第一階段相同。對比三個階段所收穫的分離後的發酵液質量，澄清度相當，層析上柱壓力維持在0.09MPa，上柱流速均達到120cm/h。權利要求一種利用陶瓷膜對重組蛋白質發酵液進行固液分離的方法，其特徵在於，將發酵液在0～30℃的溫度下加壓到0.1～0.6Mpa後進入陶瓷膜過濾系統，發酵液中的菌體細胞和懸浮固體被截留在膜的進料一側，流出的滲透液即為重組蛋白質產物溶液。2.根據權利要求1所述的分離方法，其中的陶瓷膜孔徑為0.012微米，優選為0.21.2微米，特別優選為0.50.8微米。3.根據權利要求1或2所述的分離方法，其中發酵液溫度為829t:，優選為1026°C。4.根據權利要求1或2所述的分離方法，其中重組蛋白質發酵液進入陶瓷膜過濾系統前的壓力為0.20.5Mpa，優選為0.3Mpa。5.根據權利要求1或2所述的分離方法，其中重組蛋白質發酵液的pH值為5.08.0，優選為6.0。6.根據權利要求1或2所述的分離方法，其中重組蛋白質發酵液在陶瓷膜過濾系統中的流通量為30100升/米2小時，優選為75升/米2小時。7.根據權利要求1或2所述的分離方法，其中重組蛋白質的分子量為1萬8萬道爾頓。8.根據權利要求1或2所述的分離方法，其中陶瓷膜過濾系統由一個或多個單元膜系統組成。9.根據權利要求1或2所述的分離方法，其中重組蛋白質的培養宿主為真核細胞或原核細胞。10.根據權利要求1或2所述的分離方法，其中重組蛋白質發酵液為微生物發酵的重組蛋白質發酵液。11.根據權利要求1或2所述的分離方法，其中重組蛋白質發酵液選自下列之一重組人血白蛋白發酵液、重組人轉鐵蛋白發酵液、重組腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體發酵菌體裂解液或重組L-山梨酮脫氫酶發酵菌體裂解液。全文摘要本發明提供了一種利用陶瓷膜對微生物發酵的重組蛋白質發酵液進行固液分離的方法，包括將發酵液在0～30℃的溫度下加壓到0.1～0.6MPa後進入陶瓷膜過濾系統，發酵液中的微生物和懸浮固體被截留在膜的進料一側，流出的透過液即為重組蛋白質產物溶液。本發明實現了重組蛋白質發酵液中大分子蛋白質產物與其他固體雜質的有效分離，具有工藝穩定、過濾後透過液澄清度好、便於後續層析處理、易於實現工業化等一系列優點。文檔編號C07K1/00GK101735303SQ20081007982公開日2010年6月16日申請日期2008年11月25日優先權日2008年11月25日發明者任力偉,任振軍,何慶生,張玉新,李梅彥,杜力,王冀民,王志明,賀建功,賈茜,鄭海洲,高健,黃順軍申請人:華北製藥集團新藥研究開發有限責任公司