人血白蛋白的生產方法
2023-04-25 12:08:26 2
專利名稱：人血白蛋白的生產方法
技術領域：
本發明涉及一種生物製品技術中蛋白質的分離、提純工藝方法，具體是一種人血白蛋白的生產方法。
背景技術：
人血白蛋白是人體血液中最主要的一種功能性蛋白質，其主要生理功能為調節人體滲透壓和新陳代謝中物質運輸，臨床上主要用於治療燒傷、燙傷及腦水腫和肝腹水等症。目前主要的分離方法是以乙醇為沉澱劑的低溫乙醇法和柱層析法，現行的低溫乙醇法主要存在著工藝複雜，步驟多(僅分離步驟就有5-6步)，分離周期長等缺點，工藝複雜、步驟多則生產不易控制，周期長則效率不高；另一方面，在分離中多數不加助濾劑，使過濾速度慢，過濾效果不好即固液分離不充分，還有少量的固體組分混在清液中，導致產品質量不易控制，而且該工藝生產的製品純度不高，一般在96% 98%左右，多聚體含量較高， 約為2% 3%。柱層析法工藝雖然克服了以上缺點，但生產一次性投資大，生產成本高，不能滅活病毒等缺點，因此在大規模生產中較少被使用。專利申請號為200710035210. 4曾介紹了一種白蛋白工藝，其採用五步沉澱，而後三步分離，即組分I、組分Π+ΙΙΙ分別沉澱，再一起分離，組分IV-I、組分IV-4分別沉澱，一起分離，然後再沉澱和分離組分V，相對每批生產周期長，而且在壓濾時未加助濾劑，這將使過濾慢，同時，過濾效果即固液分離不完全。我公司根據低溫乙醇法和柱層析法的特點，進行了研究，發明了低溫乙醇法結合柱層析法分離人血白蛋白的新生產工藝。該工藝使人血白蛋白的純度達到98 % 100 %，人血白蛋白的多聚體含量小於3%，人血白蛋白的收率達到2. 8g 3. 0g/100ml血漿。
發明內容
本發明涉及到一種人血白蛋白的生產方法，其特徵是以人血漿為原料，以三步分離法進行分離，即第一步直接分離組分Ι+Π+ΙΙΙ ；第二步直接分離組分IV ；第三步分離得到組分V，即白蛋白粗品，再經一步層析精製即得到人血白蛋白成品。本發明進一步的技術方案是以乙醇作為沉澱劑，其添加濃度為18% 42%。本發明更進一步的技術方案是組分V沉澱溶解後經過濾，調節離子強度、pH後， 用 DEAE Sepharose FF 柱層析。本發明更進一步的技術方案是以壓濾機為分離設備進行固液分離，工作壓力為 0. 5 2. 0 公斤 /cm2。本發明更進一步的技術方案是在進行固液分離時，加入硅藻土作為助濾劑，提高過濾效果，其添加的比例是全部過濾液的0. 5% 2% (g/ml)。本發明更具體的技術方案是第一步、分離組分I+II+III 將冰凍的人血漿在不高於37°C下融化，並調整溫度到0 4°C，或者把新鮮的血漿直接調整到0 4°C，用PH值為4. 0的醋酸緩衝液調節血漿的PH值為5. 8 6. 2，加入95 %的乙醇，調節乙醇濃度到18 % 22 %，並降溫到-4 -6°C，攪拌30 60分鐘，靜止1 2小時，加入硅藻土 2% (g/ml)，用壓濾機進行分離，分離的清液入到另一反應罐中，壓濾結束時打開壓濾機收取組分Ι+Π+ΙΙΙ沉澱。第二步、分離組份IV 將分離組分I+II+III的清液調整溫度在-3 -5°c，用PH 值為4. 0的醋酸緩衝液調節PH值為5. 8 6. 2，加入95%的乙醇，調節乙醇濃度到38% 42%，並降溫到-4 -6°C，靜止1 2小時，加入硅藻土 2% (g/ml)，用壓濾機進行分離，分離的清液入到另一反應罐中，壓濾結束時打開壓濾機收取組分IV沉澱。第三步、分離組分V 將分離組分IV後的清液溫度調整到-4 _6°C，用2M的醋酸調節PH值為4. 75 4. 85，攪拌1 2小時，同時調整溫度到-8 -12°C，靜止2 6小時，加入0.5% 1.0% (g/ml)的硅藻土到壓濾機中，用壓濾機進行分離，分離的清液進行回收乙醇，壓濾結束時打開壓濾機收取組分V沉澱，組分V即為人血白蛋白粗品。第四步、層析超濾用5 7倍量的溫度為0 10°C的注射用水將組分V溶解，調節蛋白含量為3 % 5 %，調節pH為5. 2 5. 5，離子強度為0. 01 0. 02，過濾，用DEAE Sepharose FF柱層析，洗脫液用IM碳酸氫鈉調節PH值為6. 20 6. 60，用超濾機進行超濾透析，並濃縮蛋白濃度到20. 2% 20. 5 %，加入辛酸鈉作為保護劑，以巴氏滅活法滅活病毒，除菌過濾後分裝即得成品。本發明的其主要優點是採用三步法進行分離，簡化現有的分離工藝，提高了產品收率和生產效率，在壓濾時加入合適比例的硅藻土作為助濾劑，提高過濾速度，改善過濾效果。加入層析步驟後，降低了人血白蛋白的多聚體含量，改進了人血白蛋白的穩定性，也控制了內毒素含量。產品的各項質量指標均超過國家標準。
下面結合附圖和實施方式對本發明作進一步詳細的說明。圖1是本發明工藝流程方框示意圖。
具體實施例方式實施例1 以IOOOkg血漿進行三步法分離白蛋白粗品為例第一步、分離組分I+II+III 將IOOOkg冰凍的人血漿在不高於37°C下融化，並調整溫度到0°C，用PH值為4. 0的醋酸緩衝液調節血漿的PH值到5. 8，加入95%的乙醇，調節乙醇濃度到20%，並降溫到_5°C，攪拌30分鐘，靜止1小時，加入硅藻土 1. 0% (g/ml)，用壓濾機進行分離，分離的清液入到另一反應罐中，壓濾結束時打開壓濾機收取組分I+II+III， 得組分I+II+III沉澱約90kg，此步用時為10小時。第二步、分離組份IV:將分離組分I+II+III的清液調整溫度在-3°c，用PH值為4. 0的醋酸緩衝液調節PH值到5. 8，加入95%的乙醇，調節乙醇濃度到40%，並降溫到-4°C，靜止1小時，加入硅藻土 (g/ml)，用壓濾機進行分離，分離的清液入到另一反應罐中共約1500kg，壓濾結束時打開壓濾機收取組分IV沉澱為80kg。此步用時約10小時。第三步、分離組分V 將分離組分IV後的清液約1500Kg溫度調整到_4°C，用2M的醋酸調節PH值到4. 75，攪拌1小時，同時調整溫度到_8°C，靜止2小時，加入0. 5% (g/ml) 的硅藻土到壓濾機中，用壓濾機進行分離，分離的清液進行回收乙醇，壓濾結束時打開壓濾機收取組分V沉澱約110kg，組分V即為人血白蛋白粗品。此步用時約15小時。
如果每次投產IOOOkg血漿，採用本發明的三步法分離，得到白蛋白粗品——組分 V只需要35小時，比傳統工藝的3-4天，生產周期大大縮短。第四步層析超濾用5倍量的溫度為2°C的注射用水550kg將組分V沉澱IlOkg溶解，得溶解液660kg，取樣測定蛋白濃度和白蛋白純度，調節溶解液的蛋白含量為5%，pH值為5. 2，離子強度為0.01，進行過濾，過濾液入到另一個反應罐，用DEAE Sepharose FF柱層析，洗脫液用IM的碳酸氫鈉調節pH值為6. 20，用超濾機進行超濾，去掉乙醇，並濃縮蛋白濃度到20. 5%，加入辛酸鈉作為保護劑，得白蛋白液143L以巴氏滅活法進行病毒滅活，得到白蛋白原液，並取樣測定白蛋白純度，除菌過濾後分裝既得成品。結果見表1.表1 層析超濾過程結果分析
權利要求
1.一種人血白蛋白的生產方法，其特徵在於以人血漿為原料，以三步壓濾分離法進行分離，即第一步直接分離組分I+II+III ；第二步直接分離組分IV ；第三步分離得到組分 V，即白蛋白粗品，再進行層析超濾配製即得到人血白蛋白成品。
2.根據權利要求1所述的一種人血白蛋白的生產方法，其特徵在於，其所述的壓濾分離法是以壓濾機為分離設備進行的固液分離，工作壓力為0. 5 2. 0公斤/cm2。
3.根據權利要求1所述的一種人血白蛋白的生產方法，其特徵在於在進行壓濾分離時，加入硅藻土作為助濾劑，其添加的比例是全部過濾液的0. 5% 2% (g/ml)。
4.根據權利要求1到3任一所述的一種人血白蛋白的生產方法，其特徵在於，在壓濾分離時，是以乙醇作為沉澱劑，其添加的濃度為18% 42%。
5.根據權利要求1到3任一所述的一種人血白蛋白的生產方法，其特徵在於，其所述的第一步直接分離組分I+II+III，其具體步驟是將冰凍的人血漿在不高於37°c下融化，並調整溫度到0 4°C，或者把新鮮的血漿直接調整到0 4°C，用PH值為4. 0的醋酸緩衝液調節血漿的PH值到5. 8 6. 2，加入95 %的乙醇，使乙醇濃度為18 % 22 %，並降溫到-4 _6°C，攪拌30 60分鐘，靜止1 2小時，加入硅藻土 2% (g/ml)，用壓濾機進行分離，分離的清液入到另一反應罐中，壓濾結束時打開壓濾機收取組分I+II+III。
6.根據權利要求1到3任一所述的一種人血白蛋白的生產方法，其特徵在於，其所述的第二步直接分離組分IV，其具體步驟是將分離組分I+II+III的清液調整溫度在-3 -5°c，用PH值為4. 0的醋酸緩衝液調節PH值到5. 8 6. 2，加入95 %的乙醇，使乙醇濃度為38 % 42 %，並降溫到-4 -6°C，靜止1 2小時，加入硅藻土 1 % 2 % (g/ ml)，用壓濾機進行分離，分離的清液入到另一反應罐中，壓濾結束時打開壓濾機收取組分 IV。
7.根據權利要求1到3任一所述的一種人血白蛋白的生產方法，其特徵在於，其所述的第三步分離得到組分V，其具體步驟是將分離組分IV後的清液溫度調整到-4 -6°c，用2M 的醋酸調節PH值到4. 75 4. 85，攪拌1 2小時，同時調整溫度到_8 -12°C，靜止2 6小時，加入0.5% 1.0% (g/ml)的硅藻土到壓濾機中，用壓濾機進行分離，分離的清液進行回收乙醇，壓濾結束時打開壓濾機收取組分V，組分V即為人血白蛋白粗品。
8.根據權利要求1到3任一所述的一種人血白蛋白的生產方法，其特徵在於，其所述的層析超濾，用的是DEAE Sepharose FF柱層析。
9.根據權利要求8所述的一種人血白蛋白的生產方法，其特徵在於，其所述的層析超濾，其具體步驟是用5 7倍量的溫度為2 10°C的注射用水將組分V溶解，調節蛋白含量為3% 5%，調節pH為5. 2 5. 5，離子強度為0. 01 0. 02，過濾，用DEAE Sepharose FF柱層析，洗脫液用IM碳酸氫鈉調節PH為6. 2 6. 6，用超濾機進行超濾透析，並濃縮蛋白濃度到20. 2% 20. 5%，加入辛酸鈉作為保護劑，以巴氏滅活法滅活病毒，除菌過濾後分裝即得成品。
全文摘要
本發明涉及一種生物製品技術中蛋白質的分離、提純工藝方法，具體是一種人血白蛋白的生產方法。其主要特點是用三步法進行分離，簡化現有的分離工藝，提高了產品收率和生產效率，在壓濾時加入合適比例的硅藻土作為助濾劑，提高過濾速度，改善過濾效果。加入層析步驟後，降低了人血白蛋白的多聚體含量，改進了人血白蛋白的穩定性，也控制了內毒素含量。產品的各項質量指標均超過國家標準。
文檔編號C07K1/30GK102161702SQ20111003077
公開日2011年8月24日 申請日期2011年1月28日 優先權日2011年1月28日
發明者于洋, 孫曉東, 李常祿, 楊金平, 郭晶, 陳鳳珠, 魏舒 申請人:哈爾濱派斯菲科生物製藥股份有限公司