一種肝硬化競爭性酶聯免疫檢測試劑盒及其檢測方法
2023-06-29 08:56:26 1
專利名稱：一種肝硬化競爭性酶聯免疫檢測試劑盒及其檢測方法
技術領域：
本發明屬於生物技術領域，具體涉及肝硬化競爭性酶聯免疫檢測試劑盒及其檢測方法。
背景技術：
隨著肝癌外科的成熟和發展，肝癌的治療方法和手段日漸豐富，而不再局限於單一的手術治療。肝切除術和肝移植仍然是肝癌患者治療的主要方法，但微創治療、經皮肝動脈化療栓塞等技術方法，作為手術治療的重要補充，也得到了較廣泛的應用，它們在為患者創造手術治療機會、降低或減少腫瘤的復發和轉移等方面都起到了一定的作用，延長了患者的生存時間。雖然如此，肝癌患者發病隱匿、無明顯症狀、多數患者就診時已失去手術根治的機會。因此，「早期發現、早期診斷、早期治療」是降低癌症死亡率的重要措施。篩選和建立用於癌症早期診斷的、高敏感、高特異的血清學診斷技術，提供癌症早期預警普查，具有重大意義和巨大市場前景。目前國內外廣泛採用檢測血清中甲胎蛋白(AFP)來確診肝癌(HCC)，儘管這種方法提高了 HCC的檢測水平，但仍有顯著數量患者的甲胎蛋白並未升高，尤其對腫瘤直徑小於3CM的小肝癌患者，其敏感性及特異性更低。近年來，標誌物聯檢在腫瘤診斷中的應用的研究得到很大的重視。如通過聯檢甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、血清鐵蛋白(SF)、 α-L-巖藻糖苷酶(AFU)可顯著提高肝癌診斷的陽性率。AFP、CEA、SF、CA等四標誌物聯檢原發肝癌的實驗也獲得不錯的結果。但由於診斷特異性或成本效益方面的原因，很難在肝癌普查中廣泛應用。血清中豐富的多肽資源在目前重大疾病診斷中扮演重要的角色。採用目前常規的臨床手段進行多肽檢測逐漸引起學術界和醫藥界的高度重視，基於多肽的腫瘤診斷技術正開始向臨床應用高速發展，腫瘤的早期預警技術也在開發之中，一些多肽的聯合應用有可能為腫瘤等重大疾病的預警提供革新性的突破。血清中多肽同血清中蛋白不同，其分子量低於lOOOODa，結構簡單，變化多樣。是否能夠採用目前常規的臨床手段進行檢測仍在探索。目前，檢測血清中多肽進行臨床診斷還沒有先例。血清多肽能否用於診斷或早期診斷肝癌可以從三個方面來判斷。1、血清多肽是血清蛋白的降解產物或基因直接編碼產物。當生理狀態發生變化時尤其向腫瘤轉化時，蛋白的代謝發生變化，導致多肽相應變化， 從而建立了多肽----疾病的相關關係，因此，多肽可以像蛋白一樣進行疾病診斷。2、實踐上已經有一些疾病的診斷採用多肽標誌物，1985年以來，利用合成多肽檢測愛滋病病毒 (PM)、風疹病毒、人巨細胞病毒及類風溼等已應用到臨床。3、文獻表明，多肽可以用於臨床診斷，如，Clinical Chemistry 51 10,1933-1945(2005)和 Clinical Chemitry 53:61， 067-1074(2007)認為血清多肽標誌物能更精確的區分蛋白標誌物不能區分的腫瘤。Nat Methods. 2008 Jan ；5(1) :57_9認為質譜診斷腫瘤甚至比MRI還好。質譜技術給生命科學帶來的促進作用舉世公認，近十年來，質譜在新生二篩查、基因突變檢測方面取得一系列重要進展，並出現了單核苷酸多態性(SNP)分析專業質譜儀器，顯示了質譜在臨床診斷方面的價值。基於血清多肽抗原的腫瘤早期診斷試劑盒是當前最受關注的腫瘤早期診斷技術之一。目前臨床領域中單一標誌物始終存在著特異性不強、陽性率較低等不足，特別是對早期腫瘤的檢測率不高，多標誌聯合檢測事在必行，但苦於沒有一個很好的手段實現同時檢測。2006年Jos印Villanueva等人對32例前列腺癌、21例乳腺癌和20例膀胱癌血清多肽研究，發現14個、10個和58個可分別作為前列腺癌、乳腺癌和膀胱癌的腫瘤標誌多肽， 預測準確率為100%。血清中存在的豐富的多肽為腫瘤預警和早期診斷提供了豐富的標誌物資源，這些多肽的聯合應用有可能為腫瘤等重大疾病的預警提供革新性突破。經研究發現，序列為 Asn-Leu-Gly-His-Gly-His-Lys-His-Glu-Arg-Asp-Gln-Gly-His-Gly-His-Gln 的多肽是癌症預警重要血清多肽標誌物之一，而肝硬化是肝癌的重要預警時期。因此對肝硬化的準確和快速的診斷有助於預防和早期治療肝癌。近幾年興起的血清多肽組學已成功應用於幾種癌的診斷研究，如乳腺癌，卵巢癌， 前列腺癌等，主要採用的是表面增強雷射解吸離子化(SELDI)技術和免疫磁珠技術，但該體系存在價格昂貴，不利推廣的缺點。
發明內容
本發明的目的在於提供保藏號為CGMCC No. 5269的單克隆抗體雜交瘤細胞株 AP0105在製備肝硬化競爭性酶聯免疫試劑盒中的應用。本發明中，抗人原發性肝癌多肽標誌物單克隆抗體雜交瘤細胞株AP0105，是以多肽標誌物抗原(序列為 Asn-Leu-Gly-His-Gly-His-Lys-His-Glu-Arg-Asp-Gln-Gly-His-Gly-His-Gln的多肽，命名為多肽5)與載體蛋白匙孔血藍蛋白(KLH)的偶聯物免疫原，免疫BALB/C小鼠，然後篩選出的雜交瘤細胞株。本發明提供的抗人原發性肝癌多肽標誌物單克隆抗體雜交瘤細胞株AP0105，已於2011年9月27號在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(地址北京市朝陽區大屯路甲3號，中國科學院微生物研究所，郵編 100101)保藏，保藏號為 CGMCC No. 5269。其中，所述的競爭性酶聯免疫試劑盒，其含有酶標的本發明所述的單克隆抗體，優選的，所述標記的酶可為辣根過氧化物酶。其中，所述的競爭性酶聯免疫試劑盒可進一步含有多肽標準品、包被液、5%脫脂奶粉、TMB顯色液、2M硫酸和96孔酶聯板，所述的多肽的序列為Asn-Leu-Gly-His-Gly-His -Lys-His-Glu-Arg-Asp-Gln-Gly-His-Gly-His_Gln。本發明所提供的單克隆抗體針對多肽標誌物抗原的特異性強；多肽標誌物抗原的檢測方法的操作步驟簡便快捷，利於臨床檢測；可進行高通量、低成本的酶聯檢測儀檢測。本發明將多肽抗體與ELSIA技術聯合，可以同時檢測多個生物標誌群，並可用於大規模的樣本檢測，是驗證血清標誌物和應用於臨床檢測的理想工具。
圖1為本發明的檢測肝硬化血清與正常血清的ROC曲線圖。
具體實施方式
以下實施例用於說明本發明，但不用來限制本發明的範圍。實施例1多肽標誌物抗原單克隆抗體的製備方法1)採用偶聯載體蛋白KLH的合成的多肽5作為免疫原免疫BALB/C小鼠；其全長序列為Asn-Leu-Gly-His-Gly-His-Lys-His-Glu-Arg-Asp-Gln-Gly-His-Gly-His_Gln。2)2周後檢測尾血滴度，達到1 1000以上後，取BALB/C小鼠脾細胞與SP2/0小鼠骨髓瘤細胞在PEG作用下進行融合；3)通過ELISA方法進行篩選，用有限稀釋法對分泌抗體陽性的雜交瘤細胞進行克隆純化；4)篩選出10株針對合成肽5的雜交瘤細胞，意外地發現其中一株敏感性較高(lng/well)，擴增細胞系，製備並純化單抗腹水，檢測單抗的效價(1 200000)、滴度 (0. 0005yg/ml)及亞型鑑定(IgG2b)等，得到抗多肽5的特異性單克隆抗體。將該雜交瘤細胞株命名為抗人原發性肝癌多肽標誌物單克隆抗體雜交瘤細胞株，並於2011年9月27 號在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心進行保藏，保藏號為CGMCC No. 5269。實施例2肝硬化競爭性酶聯免疫檢測試劑盒的組裝1) 1. 25 μ g/ml辣根過氧化物酶標記的實施例1的抗多肽5的特異性單克隆抗體；2)多肽標準品溶液1 μ g/ml合成肽5的包被溶液；3)包被液0. IM pH9. 6的碳酸鹽緩衝液；4) 5%脫脂奶粉5g/100ml脫脂奶粉；5) TMB顯色液購自北京康為世紀生物科技公司；6) 2M 硫酸；7)96孔酶聯板。實施例3多肽標誌物抗原的競爭性酶聯免疫檢測方法樣本臨床確診的肝硬化血清53份、正常血清60份。檢測過程1)取1 μ g/mL多肽標準品溶液100 μ L (包被液溶解)，置於96孔板中，4°C放置過夜；2)棄包被液，用0. 01M、ρΗ7· 4 PBST緩衝液200 μ L清洗6次，拍幹；3)加入200 μ L 5%的脫脂奶粉，37°C靜置封閉1. 5小時；4)棄封閉液，用0. 01M、ρΗ7· 4 PBST緩衝液200 μ L清洗6次，拍幹；5)待測樣品與0. 3ug/mL的HRP標記多肽抗體以體積比1 1在板外37°C結合1 小時；同時以PBS代替待測樣品作為陰性對照；6)加入100 μ L 5)中結合溶液，37°C靜置1小時；7)棄6)中溶液，用0. 01M、ρΗ7· 4 PBST緩衝液200 μ L清洗6次，拍幹；8)加入100 μ LTMB顯色液，37°C避光孵育15min顯色；9)加入50 μ L 2Μ硫酸，終止反應；10)用酶聯檢測儀測定波長450nm的光吸收值(0D值)。結果經統計，如圖1的ROC曲線顯示，肝硬化血清與正常血清兩組診斷陽性標準為 OD值<=0. 987，敏感度達到91.4%，特異度達到89.7%，說明用本發明提供的試劑盒進行酶聯免疫檢測，特異性很強、重複性好。
以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對於本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明技術原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護範圍。
權利要求
1.保藏號為CGMCCNo. 5269的單克隆抗體雜交瘤細胞株AP0105在製備肝硬化競爭性酶聯免疫試劑盒中的應用。
2.根據權利要求1所述的應用，其特徵在於，所述競爭性酶聯免疫試劑盒含有酶標的保藏號為CGMCC No. 5269的單克隆抗體雜交瘤細胞株分泌的單克隆抗體。
3.根據權利要求2所述應用，其特徵在於，所述酶為辣根過氧化物酶。
4.根據權利要求2或3所述的應用，其特徵在於，所述試劑盒還含有多肽標準品、包被液、5%脫脂奶粉、TMB顯色液、2M硫酸和96孔酶聯板，所述的多肽的序列為Asn-Leu-Gly-H is-Gly-His-Lys-His-Glu-Arg-Asp-Gln-Gly-His-Gly-His_Gln。
全文摘要
本發明公開了保藏號為CGMCC No.5269的單克隆抗體雜交瘤細胞株AP0105在製備肝硬化競爭性酶聯免疫試劑盒中的應用。本發明所提供的由所述雜交瘤細胞株分泌的單克隆抗體製備的競爭性酶聯免疫檢測試劑盒可特異性地檢測肝硬化，而且操作步驟簡便快捷，利於高通量地臨床檢測，而且檢測成本低。
文檔編號G01N33/577GK102401831SQ20111035948
公開日2012年4月4日 申請日期2011年11月14日 優先權日2011年11月14日
發明者付海媛, 侯利平, 原劍, 周曉明, 孫雲波, 張拓, 楊保安, 王東茂, 甄蓓, 肖漢族, 鄭俊傑, 魏開華, 黃亞娟 申請人:北京正旦國際科技有限責任公司, 湖南金健藥業有限責任公司