一種從酵母細胞中製備還原型穀胱甘肽的方法與流程

2023-04-25 22:48:32 4

本發明涉及高純度還原型穀胱甘肽純化方法以及從酵母細胞中製備高純度還原型穀胱甘肽的工藝。屬於生物工程和藥物化合物領域。

背景技術：

還原型穀胱甘肽(Glutathione,GSH)作為一種重要的藥物試劑，在臨床上主要用於化療、低氧血症、肝臟疾病、有機磷、胺基或硝基化合物中毒的治療和輔助治療；同時穀胱甘肽的抗氧化性能又使得它在食品和化妝品加工業中作為添加劑而受到青睞。市場上用於銷售的產品主要包括：保肝護肝藥穀胱甘肽片(阿拓莫蘭)，治療中毒性肝損傷藥物雙益健(注射用還原型穀胱甘肽)，穀胱甘肽全身美白乳，穀胱甘肽祛斑精華等醫藥產品及化妝品。2015年，GSH國內外市場每年以10％的速度遞增。日本Kyowa(協和發酵工業株式會社)和Ajinomoto(味之素株式會社)等公司早在20世紀80年代就實現了商業化酵母發酵生產穀胱甘肽的產業化，現已成為全世界穀胱甘肽的主要生產和供應商，同時形成了技術壁壘。國內山東金城醫藥化工股份有限公司引進日本穀胱甘肽純化技術，成為國內首家從酵母中生產穀胱甘肽的公司。

穀胱甘肽來源於動物、植物、微生物及化學合成。其中以酵母、小麥胚芽中的含量最為豐富。穀胱甘肽的純化方法主要包括離子交換法、電滲析法和雙水相法等，諸如此類方法多受限於穀胱甘肽的結構不穩定性，導致純化倍數低、工藝流程繁雜、生產成本高。因此，開發低成本、可工業化的還原型穀胱甘肽純化工藝，對穀胱甘肽在食藥領域相關產品的研製尤為重要。同時為制定《富營養素酵母》國家標準編制提供理論和實踐參考。

技術實現要素：

本發明的目的在於，提供一種從酵母細胞中製備高純度還原型穀胱甘肽的方法，該方法能夠高效、低成本的應用在酵母細胞生產穀胱甘肽的工業化，為食藥領域提供高純度還原型穀胱甘肽原料。同時為制定《富營養素酵母》國家標準編制提供理論和實踐參考。

本發明的目的是這樣實現的：一種從酵母細胞中製備高純度還原型穀胱甘肽的方法，包括以下步驟：

(1)富含還原型穀胱甘肽酵母細胞的製備：以酵母細胞發酵法生產還原型穀胱甘肽，以酵母細胞乾重計算，GSH含量為1-5％，富含還原型穀胱甘肽酵母細胞，包括：酵母乳、酵母乾粉、酵母抽提物等形式。

(2)酵母細胞熱提取：取一定質量的酵母細胞，以5-15倍，優選為10倍體積的去離子水懸浮。調節pH值為2.0，在80-100℃，優選為85-90℃下，攪拌0-30分鐘，優選為5-15分鐘。完成後迅速置於冰水中冷卻至20℃以下，3000-10000rpm/min，優選為7500rpm/min下離心10-30分鐘，優選為15分鐘。除去沉澱物，留存輕相。

(3)GSH-Cu絡合物的製備：利用HPLC技術檢測步驟2)輕相中GSH的含量。在10-100rpm/min，優選為50rpm/min攪拌狀態下，用NaOH調節輕相pH值為5.0-7.0，優選為6.0。根據輕相中GSH的摩爾質量，按照1:1-1:20，優選為1:2-1:15的配比，添加CuSO4。維持攪拌15-60分鐘，優選為30分鐘。3000-10000rpm/min，優選為7500rpm/min下離心20-40分鐘，優選為30分鐘。留存重相。

(4)洗滌：取一定質量的GSH-Cu絡合物，以100-200倍，優選為150倍體積的純化水懸浮，維持攪拌20-40分鐘，優選為30分鐘。3000-10000rpm/min，優選為7500rpm/min下離心20-40分鐘，優選為30分鐘。留存重相。

(5)解絡合：取一定質量的GSH-Cu絡合物，以2-10倍，優選為4倍體積的純化水懸浮，維持攪拌。通入H2S氣體維持5分鐘。3000-10000rpm/min，優選為7500rpm/min下離心10-30分鐘，優選為15分鐘。除去沉澱物，留存輕相。通入的H2S氣體包括：純淨H2S氣體，或富含高濃度H2S成分的工業甲烷廢氣，或在酸性條件下易產生H2S的無機和有機鹽，如(NH4)2S，Na2S等。

(6)脫色：步驟(5)中輕相用鹽酸調節pH值為2.0，按照5‰的比例加入活性炭，維持攪拌反應時間20-60分鐘，優選為30分鐘。反應完成後，用0.25μm濾膜過濾除去活性炭，留存濾液。

(7)濃縮：步驟(6)中濾液，通過減壓濃縮，得到含有500-1000g/L穀胱甘肽濃度的穀胱甘肽溶液，優選濃度為800g/L。

(8)重結晶：維持攪拌，在步驟(7)中含穀胱甘肽溶液中，加入等量體積的50-80％(v/v)濃度的乙醇水溶液，優選70％的乙醇水溶液，在-4-20℃，優選為4℃，添加穀胱甘肽結晶作為晶種。晶種的添加量為20-200mg/L，優選為50mg/L。繼續攪拌30分鐘後，停止攪拌，維持溫度6-20小時，優選為12小時。得結晶漿液，過濾得高純度還原型穀胱甘肽物質，還原型穀胱甘肽純度>98％。

本發明將製備出來的還原型穀胱甘肽用於醫藥試劑、食品和化妝品添加劑。

附圖說明

圖1是GSH-金屬絡合物的篩選結果。

圖2是酵母細胞90℃下熱水(pH 2.0)浸提15分鐘後水相HPLC圖譜。

圖3是酵母浸提液經Cu2+絡合後輕相HPLC圖譜。

圖4是GSH-Cu絡合物水洗後輕相HPLC圖譜。

圖5是絡合物解絡合後輕相HPLC圖譜。

圖6是絡合物解絡合後輕相經凍幹後所得成分1H NMR圖譜(400MHz,D2O)。

圖7是絡合物解絡合後輕相經凍幹後所得成分13C NMR圖譜(400MHz,D2O)。

圖8是重結晶後所得成分1H NMR圖譜(400MHz,D2O)。

圖9是重結晶後所得成分13C NMR圖譜(400MHz,D2O)。

圖10是還原型GSH粗產品與重結晶產品外觀，其中，左上角是純度>98％的重結晶產品，右方是純度>90％的粗產品。

具體實施方式

實施例1

(1)酵母細胞中GSH的提取

稱取酵母乳100.0g，加純水900mL，用鹽酸調節pH值為2.0，90℃水浴浸提15min，再攪拌5min，迅速至於冰浴中冷卻至室溫。以7500r/min離心15min，留存上清液。

(2)GSH-Cu絡合物的製備

上述步驟中的酵母提取液400mL，用NaOH調節pH值為6.0，按GSH與CuSO4·5H2O摩爾質量比為1:15加入CuSO4·5H2O進行絡合，維持攪拌，以7500r/min離心30min，得沉澱約500mg。

(3)洗滌

將上述步驟中的沉澱水洗3次，以150倍體積的純化水懸浮，維持攪拌30分鐘後，7500rpm/min下離心30分鐘。留存重相。

(4)解絡合

將上述步驟中水洗後的沉澱，加入2L水懸浮，通入H2S氣體，維持攪拌5分鐘，7500rpm/min下離心15分鐘。除去沉澱物，留存輕相。利用分光光度計檢測OD600值為0.022。利用HPLC技術對水相進行定性、定量分析，還原型穀胱甘肽純度為90.5％。

(5)脫色

將上述步驟中輕相用鹽酸調節pH值為2.0，按照5‰的比例加入活性炭，維持攪拌反應時間30分鐘。反應完成後，用0.25μm濾膜過濾除去活性炭，留存濾液。利用分光光度計檢測OD600值為0.002，脫色效果顯著。還原型穀胱甘肽絕對含量未發生顯著變化，還原型穀胱甘肽純度為89.4％。

(6)濃縮

將上述步驟中的水相通過減壓濃縮，得到濃度為800g/L的穀胱甘肽溶液。

(7)重結晶

維持攪拌，在上述步驟中含穀胱甘肽溶液中，加入等量體積的70％(v/v)濃度的乙醇水溶液，在4℃，添加穀胱甘肽結晶作為晶種。晶種的添加量為50mg/L。繼續攪拌30分鐘後，停止攪拌，維持溫度12小時。得結晶漿液，過濾得高純度還原型穀胱甘肽物質。還原型穀胱甘肽純度為98.5％。

圖1是GSH-金屬絡合物的篩選結果。圖中顯示Cu2+與GSH形成白色絡合物沉澱，而KMnO4對GSH發生了氧化作用，生成褐色氧化產物。

圖4是GSH-Cu絡合物水洗後輕相HPLC圖譜。圖中顯示經過2次洗滌後絕大部分水溶性雜質被洗脫掉，且洗脫液中未檢出還原型GSH。

圖5是絡合物解絡合後輕相HPLC圖譜(還原型穀胱甘肽純度>90％，低峰線是還原型穀胱甘肽和氧化型穀胱甘肽標準品混合樣)。