一種多酶體系的仿生固定化方法

2023-04-25 17:33:21

專利名稱：一種多酶體系的仿生固定化方法
技術領域：
本發明屬於固定化酶領域，特別是ー種固定化多酶體系的エ藝方法。
背景技術：
多酶體系是指由不同的酶聯合組成的一個結構和功能的整體，能夠進行連續的反應催化，自然界中生物體的物質代謝就是由各種各樣的多酶體系維繫的，多酶體系是高效而精確的系統，常由兩個或兩個以上的酶組成ー個複合體。複合體中第一個酶催化的產物作為底物直接被第二個酶催化，第二個酶催化的產物又為複合體下一個酶的底物，如此進行連續的催化反應，使催化效率顯著提高並有機協調著一系列酶反應之間的平衡。多酶體系在催化過程中表現出的高效率和高度協調性，為後續人工構建多酶反應體系、優化改造生物催化過程提供了借鑑。
多酶體系共固定和共反應已成為ー個活躍的研究領域，近年來已引起了國內外眾多酶工程專家的極大興趣。固定化多酶和普通固定化酶相比，具有以下優點不同酶的催化特性被有機結合起來，使得單ー酶的應用範圍擴大；催化反應中，前一種酶的產物作為底物被後一種酶催化，反應過程中由於非攪拌層的存在，使得中間產物到本體溶液的擴散受阻，造成非攪拌層內底物有效濃度較高，反應速度加快，提高了固定化酶的催化效率；反應中，由於產物抑制的減少，逆反應速率大大降低，使反應更徹底。隨著對多酶體系認識和不斷深入的研究，多酶體系固定化成為了研究固定化技術的熱點。多酶體系的固定化技術大致可分為兩種，一種是以單酶固定化為基礎的混合固定化酶技木，即將不同的酶分別固定在不同載體上；第二種是多酶體系共固定技術，指多酶體系中所有的酶固定在同一種載體上。混合固定化技術中酶在反應時要克服不同載體的傳質屏障，所以反應受到很大的限制。多酶共固定化技術能將不同酶的特點充分發揮並相互結合起來，有效地解決了混合固定化技術中多酶間載體的傳質問題，其固定方法有、交聯法、包理法等。包理法是指酶分子被裹在凝膠的細格子中或被半透性的聚合物膜包圍而成為格子型和微膠囊型兩種。優點是製備エ藝簡單，操作條件溫和；包埋在聚合物中的酶不易漏出；對外界環境的緩衝作用大，可有效防止酶體的機械損傷；穩定性強，產物容易分離。關於多酶體系的固定化技術的文獻報導包括文獻I :Langmuir，2000，16(24)9595-9603利用靜電作用，在帶負電的模板上層層組裝帶正電的聚電解質和帶負電的酶分子，將多酶體系中不同的酶分別固定於各層之間。文獻2 :Radiation Physics andChemistry, 2005, 73 :91-99用聚こ烯亞胺的氨基覆蓋多孔こ醛酸瓊脂表面的醛基做成惰性載體，並以此為載體共價共固定化環己酮單加氧酶和葡萄糖-6_磷酸脫氫酶。文獻3 :Advanced. Materials, 2007,19(20) :3142-3145 採用共沉澱的方法將ー種酶固定在 CaCO3內，再利用靜電作用層層組裝帶負電的PSS和帶正電的PAH，得到微球，將其與CaCl2混合用共沉澱法再固定另ー種酶，再層層組裝形成聚電質外殼，最後去除模板可得到的固定化酶不同酶分別固定於各層中。文獻4 :Chemistry-AEuropean Journal, 2009,15 (5)1104-1107以PS-PIAT嵌段共聚物為載體，將葡萄糖氧化物酶包埋於微囊內，脂肪酶固定子雙親分子形成的微囊壁中，最後通用疊氮反應將辣根過氧化物酶接於微囊表面。文獻5 :Chemistry-A European Journal, 2009,15 (46) : 12600-12603 辣根過氧化物酶經過 PS (聚苯こ烯)或PMMA (聚甲基丙稀酸甲酷)修飾，合成酶親水頭，PS或PMMA為疏水尾的雙親性高分子，以此兩親高分子做載體固定化葡萄糖氧化酶，實現雙酶共固定。文獻6 Carbon,2009,47 :957-966以經過甲苯胺藍修飾的多層碳納米管為載體，實現了對葡萄糖氧化酶和辣根過氧化物酶的共固定，並驗證了固定化酶和電極之間的電子轉移，製得了測量低濃度葡萄糖的生物傳感器。文獻 7 Bioorganic&Medicinal Chemistry, 2011,19, 5071-5078 先通過對漆酶和辣根過氧化物酶的交聯聚合再經過高分子電解質層層包覆實現了對這兩種酶的共沉澱，並在木質素的氧化級聯反應中得到應用。以上相關文獻考察了多酶體系通過不同方法製備的固定化酶，所用固定化方法涉及到吸附、交聯和共價結合，這些方法的局限在幹吸附法游離酶用量大，且酶與載體結合 率較低，所得的固定化酶穩定性較弱；共價結合與交聯法由於固定化過程中載體與酶的結合依靠化學反應實現，對酶的活性影響較大，因此探求ー種固定化效率高、對酶活性影響小的方法很重要。目前為止，文獻中還未見採用仿生矽化包埋方法進行的多酶體系共固定的相關報導。

發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供ー種操作簡單、成本低廉的固定化多酶體系的方法，它是以TMOS為前軀體溶液，在PDADMA (聚ニ甲基ニ烯丙基銨)的誘導下實現多酶體系共固定的方法，該方法所用載體價廉易得，成本較低而且固定化效率較高。本發明解決該技術問題所採用的技術方案是一種通過仿生矽化方法固定化多酶體系的方法，包括以下步驟是I)前驅體溶液的製備在室溫下將TMOS (正矽酸甲酷)加入到lmmol/L的HCl溶液中，TMOS完全溶解、澄清後再加入pH=5-9磷酸緩衝液，混勻；其物料配比為體積比TM0S HCl溶液磷酸緩衝液=0. 6 :4. 4 :5。2)固定化酶的製備將多酶(葡萄糖氧化酶和a -澱粉酶)溶液與PDADMA (6mg/mL)溶液均勻混合，其配比為體積比多酶(葡萄糖氧化酶和a -澱粉酶)溶液PDADMA溶液=1: 1，得到含酶溶液A ;在30°C恆溫條件下，取上步預處理過的前驅體溶液加入到溶液A中，其配比為前驅體溶液酶溶液A體積比=1:10，立即振蕩，室溫靜置10-30min，離心分離5min後，用pH=7的磷酸緩衝液清洗，剩餘固體真空冷凍乾燥24h即得仿生矽化的多酶；所述的多酶溶液，是指每lmL、pH值為7的磷酸鹽緩衝液中溶有0. 2-0. 4mg葡萄糖氧化酶和4mg a-澱粉酶的溶液。本發明的有益效果是I.本發明製備固定化酶的方法，受生物體內生物矽化現象的啟發，採用了仿生矽化技術進行了多酶固定化，製備エ藝簡單，條件溫和，對酶活性損失小，酶活回收率可達85. 12% ；2.載體為TM0S，廉價易得。
具體實施方式
本發明所用的TMOS購自於天津市化學試劑研究所。本發明所用的葡萄糖氧化酶和a -澱粉酶均購於sigma公司。本發明所述的磷酸鹽緩衝溶液為Na2HPO4-NaH2PO4緩衝溶液。實例I :實驗所用不同pH值的緩衝液配 制方法如下母液I :稱取NaH2P04_2H20固體0. lmol，溶於IOOOmL蒸餾水中得到0. lmol/L的NaH2PCM溶液；母液2 :稱取Na2HP04_12H20固體0. lmol，溶於IOOOmL蒸餾水中得到0. lmol/L的Na2HPO4溶液，不同pH的緩衝溶液由母液I與母液2按ー定比例混合併用pH計校正後得到。在室溫下將0. 6mL的TMOS (分析純)加入到4. 4mLlmmol/L的HCl溶液中，輕輕晃動使TMOS完全溶解，溶液變的澄清後再加入5mL磷酸緩衝液(pH=5)，混勻，得到預處理過的前驅體溶液。將ImL比例為0. 2:4混合的多酶溶液(是指lmL、pH值為7的磷酸鹽緩衝液中溶有質量分別為葡萄糖氧化酶0. 2mg和a -澱粉酶4mg)與ImLPDADMA (6mg/mL)均勻混合，得到含酶溶液A。在30°C恆溫條件下，取200 u L上步預處理過的前驅體溶液加入到溶液A中，立即振蕩混勻，室溫靜置lOmin，離心(5000rpm，5min)，用pH=7的磷酸緩衝液徹底清洗3次，剰餘固體真空冷凍乾燥24h即得仿生矽化的多酶。實驗中採用過氧化氫的釋放速率來表示酶活，而過氧化氫的含量通過辣根過氧化物酶/4-氨基安替吡啉/苯酚催化體系，由分光光度法，在波長500nm處測得，得到酶活回收率為75. 58%。實例2 在室溫下將0. 6mL的TMOS (分析純)加入到4. 4mLlmmol/L的HCl溶液中，輕輕晃動使TMOS完全溶解，溶液變的澄清後再加入5mL磷酸緩衝液(pH=7)，混勻。將ImL比例為0. 3:4混合的多酶溶液(是指lmL、pH值為7的磷酸鹽緩衝液中溶有葡萄糖氧化酶和a -澱粉酶的質量分別為0. 3mg和4mg)與ImLPDADMA (6mg/mL)溶液均勻混合，得到含酶溶液A。在30°C恆溫條件下，取200y L上步預處理過的前驅體溶液加入到溶液A中，立即振蕩混勻，室溫靜置20min，離心(5000rpm，5min),用pH=7的磷酸緩衝液徹底清洗3次，剩餘固體真空冷凍乾燥24h即得仿生矽化的多酶。實驗中採用過氧化氫的釋放速率來表示酶活，而過氧化氫的含量通過辣根過氧化物酶/4-氨基安替吡啉/苯酚催化體系，由分光光度法，在波長500nm處測得，得到酶活回收率為80. 27%。實例3 在室溫下將0. 6mL的TMOS (分析純)加入到4. 4mLlmmol/L的HCl溶液中，輕輕晃動使TMOS完全溶解，溶液變的澄清後再加入5mL磷酸緩衝液(pH=7)，混勻。將ImL比例為0. 4:4混合的多酶溶液(是指lmL、pH值為7的磷酸鹽緩衝液中溶有葡萄糖氧化酶和a -澱粉酶的質量分別為0. 4mg和4mg)溶液與ImLPDADMA (6mg/mL)均勻混合，得到含酶溶液A。在30°C恆溫條件下，取200y L上步預處理過的前驅體溶液加入到溶液A中，立即振蕩混勻，室溫靜置30min，離心(5000rpm，5min),用pH=7的磷酸緩衝液徹底清洗3次，剩餘固體真空冷凍乾燥24h即得仿生矽化的多酶。實驗中採用過氧化氫的釋放速率來表示酶活，而過氧化氫的含量通過辣根過氧化物酶/4-氨基安替吡啉/苯酚催化體系，由分光光度法，在波長500nm處測得，得到酶活回收率為85. 12%。實例4
在室溫下將0. 6mL的TMOS (分析純)加入到4. 4mLlmmol/L的HCl溶液中，輕輕晃動使TMOS完全溶解，溶液變的澄清後再加入5mL磷酸緩衝液(pH=9)，混勻。將ImL比例為0. 35:4混合的多酶溶液(是指lmL、pH值為7的磷酸鹽緩衝液中溶有葡萄糖氧化酶和a -澱粉酶的質量分別為0. 35mg和4mg)溶液與ImLPDADMA (6mg/mL)均勻混合，得到含酶溶液A。在30°C恆溫條件下，取200 y L上步預處理過的前驅體溶液加入到溶液A中，立即振蕩混勻，室溫靜置30min,離心(5000rpm,5min),用pH=7的磷酸緩衝液徹底清洗3次，剩餘固體真空冷凍乾燥24h即得仿生矽化的多酶。實驗中採用過氧化氫的釋放速率來表示酶活，而過氧化氫的含量通過辣根過氧化物酶/4-氨基安替吡啉/苯酚催化體系，由分光光度法，在波長500nm處測得，得到酶活回收率為84. 57%。·
權利要求
1.一種多酶體系的仿生固定化方法，其特徵為包括以下步驟 1)前驅體溶液的製備在室溫下將TMOS(正矽酸甲酯)加入到I mmol/L的HCl溶液中，TMOS完全溶解、澄清後再加入pH=5-9磷酸緩衝液，混勻；其物料配比為體積比TMOS HCl溶液磷酸緩衝液=0. 6 :4. 4 5 ； 2)固定化酶的製備將多酶(葡萄糖氧化酶和α-澱粉酶)溶液與PDADMA (6 mg/mL)溶液均勻混合，其配比為體積比多酶(葡萄糖氧化酶和α -澱粉酶)溶液=PDADMA溶液=1:1，得到含酶溶液A ;在30 °C恆溫條件下，取上步預處理過的前驅體溶液加入到溶液A中，其配比為前驅體溶液酶溶液A體積比=1:10，立即振蕩，室溫靜置10-30 min，離心分離5 min後，用PH=7的磷酸緩衝液清洗，剩餘固體真空冷凍乾燥24 h即得仿生矽化的多酶。
2.如權利要求I所述的多酶體系的仿生固定化方法，其特徵為所述的多酶溶液是指每I mL、pH值為7的磷酸鹽緩衝液中溶有O. 2-0. 4 mg葡萄糖氧化酶和4 mg α -澱粉酶的溶液。
全文摘要
本發明是一種固定化多酶體系的工藝方法。該方法包括以下步驟是1)前驅體溶液的製備在室溫下將TMOS(正矽酸甲酯)加入到1mmol/L的HCl溶液中，TMOS完全溶解、澄清後再加入pH=5-9磷酸緩衝液，混勻；2)固定化酶的製備將多酶溶液與PDADMA溶液均勻混合，得到含酶溶液A；在30℃恆溫條件下，取上步預處理過的前驅體溶液加入到溶液A中，立即振蕩，室溫靜置、離心分離後，用磷酸緩衝液清洗，剩餘固體真空冷凍乾燥24h即得仿生矽化的多酶。本發明製備固定化酶的方法，製備工藝簡單，條件溫和，對酶活性損失小，酶活回收率可達85.12%；載體為TMOS，廉價易得。
文檔編號C12N11/08GK102851273SQ20121039038
公開日2013年1月2日 申請日期2012年10月16日 優先權日2012年10月16日
發明者高靜, 王洪武, 姜豔軍 申請人:河北工業大學