檢測單增李斯特菌的側向流免疫層析測定產品及製備方法

2023-04-25 13:05:41

檢測單增李斯特菌的側向流免疫層析測定產品及製備方法
【專利摘要】一種檢測單增李斯特菌的側向流免疫層析測定產品及製備方法，該產品包括相互連接的樣品墊、吸水墊和具有相互分離的檢測線和質控線的包被膜，所述包被膜位於所述樣品墊和所述吸水墊之間，所述樣品墊上負載有磁性納米粒子標記單增李斯特菌抗體，所述檢測線包被有單增李斯特菌包被抗體，所述質控線包被有與所述磁性納米粒子標記單增李斯特菌抗體特異結合的第二抗體；所述磁性納米粒子標記單增李斯特菌抗體為將待標記單增李斯特菌抗體和羧基修飾的磁性納米粒子以肽鍵共價結合形成的聚合體。該測定產品用來檢測單增李斯特菌，靈敏度高、特異性強、快速、簡便，可實現客觀化測定。
【專利說明】檢測單增李斯特菌的側向流免疫層析測定產品及製備方法

【技術領域】
[0001] 本發明涉及側向流免疫層析測定產品及其製備方法，特別是檢測單增李斯特菌 (單核細胞增生性李斯特氏菌）的側向流免疫層析測定產品及製備方法。

【背景技術】
[0002] 側向流免疫層析測定（LFIA, Lateralflow immunoassay)是20世紀末期出現的新 型免疫檢測方法，具有簡便快速的特點，在多種病毒檢測如HIV、己肝病毒W及激素檢測方 面有廣泛應用。其通過結合免疫標記技術和膜層析技術，在極短時間內，無需特殊條件，即 可做出結果判斷，已經成為一種重要的便捷免疫檢測方法。
[0003] 單核細胞增生性李斯特氏菌（Listeria mono巧togenes)又稱單增李斯特菌。李 斯特菌是一類普遍存在於環境中的細菌，而單增李斯特菌則是李斯特菌中唯一的一種人畜 共患病致病菌，也是常見的食源性致病菌之一，它能引起腸胃炎症、腦膜炎、敗血病、流產等 臨床症狀，對新生兒、孕婦、老年人及免疫力低下人群的危害尤為嚴重，致死率高達20%。單 核增生李斯特氏菌廣泛存在於各種食物中，並能在食品加工後的冷凍及真空包裝等條件下 存活，是食品安全的一大隱患。有關單增李斯特菌的食物汙染事件在國外時有報導，包括 2008年發生在加拿大的肉類感染單增李斯特菌事件W及2011年在美國發生的毒香瓜事件 都導致了多人死亡；儘管在國內至今沒有報導單增李斯特菌相關的集體中毒事件，但據質 檢部口檢查報告顯示，在多種進口肉類中，單增李斯特菌的檢出率是相對較高的，因此，建 立快速、有效及結果可靠的檢測方法，對於保障消費者健康具有重要意義。
[0004] 目前，檢測單核增生李斯特氏菌的傳統方法是通過對樣品進行二次增菌，利用選 擇性分離培養基和顯色培養基進行分離與鑑定。選擇性分離培養基如PALCAM、0XA，或顯色 培養基如CHROMagar李斯特培養基，它們主要通過成分中的某種物質與細菌的代謝產物發 生化學反應並產生顏色變化，從而區分不同的菌株。選擇性培養基常用於區分不同種屬的 細菌，但難W鑑別屬內的不同菌株；顯色培養基具有高特異性的特點，但由於其價格昂貴， 檢測周期長等缺點，實際應用範圍不廣。除了常規的檢測方法W外，隨著分子檢測技術和免 疫學檢測技術的日漸成熟，W核酸擴增檢測技術和酶聯免疫法檢測為代表的檢測方法因具 有特異性強及檢測速度快特點，正逐漸取代原有的檢測方法。但大部分由於需要較高的技 術和條件W及檢測速度相對較慢，限制了在口岸檢疫中的現場使用。


【發明內容】

[0005] 本發明所要解決的技術問題是提供一種檢測單增李斯特菌的側向流免疫層析測 定產品及製備方法，該測定產品檢測單增李斯特菌靈敏可靠、結果便於保存及量化分析、操 作簡便快速。
[0006] 本發明所提供的側向流免疫層析測定產品，包括樣品墊、吸水墊和具有相互分離 的檢測線和質控線的包被膜，所述包被膜連接於所述樣品墊和所述吸水墊之間，所述樣品 墊上負載有磁性納米粒子標記單增李斯特菌抗體，所述檢測線包被有單增李斯特菌包被抗 體，所述質控線包被有與所述磁性納米粒子標記單增李斯特菌抗體特異結合的第二抗體； 所述磁性納米粒子標記單增李斯特菌抗體為將待標記單增李斯特菌抗體和駿基修飾的磁 性納米粒子W膚鍵共價結合形成的聚合體。
[0007] 上述側向流免疫層析測定產品中，所述檢測線與所述樣品墊的距離小於所述質控 線與所述樣品墊的距離。
[0008] 所述單增李斯特菌包被抗體可為單增李斯特菌單克隆抗體或單增李斯特菌多克 隆抗體；所述待標記單增李斯特菌抗體可為單增李斯特菌單克隆抗體或單增李斯特菌多克 隆抗體。
[0009] 上述側向流免疫層析測定產品中，所述待標記單增李斯特菌抗體的親和常數為 i〇8m-i、i〇6?i〇8m-i或1〇7?i〇8m-i ;所述單增李斯特菌包被抗體的親和常數為i〇8m-i、i〇6? 1〇8m-i或1〇7?1〇8m-i ;所述駿基修飾的磁性納米粒子的平均直徑為100nm、80-200nm或 60-300nm;所述駿基修飾的磁性納米粒子的直徑變異係數（CV)可為15%、10% -20%或 10% -30% ;所述駿基修飾的磁性納米粒子的飽和磁化強度可為40emu/g。
[0010] 其中，所述待標記單增李斯特菌抗體的親和常數具體可為IO8M4,所述單增李斯特 菌包被抗體的親和常數具體可為IO 6?IO8M4,所述駿基修飾的磁性納米粒子的平均直徑可 為lOOnm，所述駿基修飾的磁性納米粒子的直徑變異係數（CV)可為15%，所述駿基修飾的 磁性納米粒子的飽和磁化強度可為40emu/g。
[0011] 所述駿基修飾的磁性納米粒子具體可為駿基修飾的磁性化3化納米粒子。
[0012] 在本發明的一個實施例中，所述待標記單增李斯特菌抗體是購自Abnnova公司 的編號為MAB0532抗單增李斯特菌的鼠單克隆抗體。所述單增李斯特菌包被抗體是購自 Abnnova公司的編號為MAB0529抗單增李斯特菌的鼠單克隆抗體。所述磁性納米粒子是購 自深圳市泰勒斯科技有限公司，產品目錄號為MP-2的聚馬來酸十六醇醋（PMAH)修飾的磁 性化3化水溶性納米晶，所述磁性納米粒子為駿基修飾的磁性納米粒子，所述駿基修飾的磁 性納米粒子平均直徑為lOOnm，直徑變異係數（CV)為15%，所述駿基修飾的磁性納米粒子 的飽和磁化強度為40emu/g。與所述磁性納米粒子標記單增李斯特菌抗體特異結合的第二 抗體為羊抗鼠IgG抗體。
[0013] 本發明中，所述待標記單增李斯特菌抗體和所述單增李斯特菌包被抗體親和常數 均是指對單增李斯特菌的親和常數。
[0014] 上述側向流免疫層析測定產品中，所述磁性納米粒子標記單增李斯特菌抗體按照 包括如下步驟的方法製備：將所述駿基修飾的磁性納米粒子活化後與所述待標記單增李斯 特菌抗體W 50 ;3的質量比進行反應得到W膚鍵共價結合形成的磁性納米粒子與單增李斯 特菌抗體的偶聯物。
[0015] 所述磁性納米粒子標記單增李斯特菌抗體的製備方法中，所述駿基修飾的磁性納 米粒子用1-己基-(3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺和N-輕基下二醜亞胺進行活化；所述活 化中，所述駿基修飾的磁性納米粒子活化所用1-己基-(3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺和 N-輕基下二醜亞胺的濃度分別為5mM和IOmM ;所述活化的溫度為37C，時間為0.化。
[0016] 在本發明的一個實施例中，按照如下方法對駿基修飾的磁性納米粒子進行活化： 將2. 5mg的上述駿基修飾的磁性納米粒子與Smmoll-己基-(3-二甲基氨基丙基）碳二亞 胺（邸C)和IOmmol N服(N-輕基下二醜亞胺）在MES緩衝液化lM、pH4. 7)中在37°C反應 0. 5h，得到活化後駿基修飾的磁性納米粒子。
[0017] 所述磁性納米粒子標記單增李斯特菌抗體的製備方法中，所述將駿基修飾的磁性 納米粒子活化後與所述待標記單增李斯特菌抗體W 50 ;3的質量比進行反應是在37C在濃 度為50mM抑為8. 5的測砂緩衝液中反應3. 5小時。所述SOmMpH為8. 5的測砂緩衝液可 按照如下方法配製；將1. 9g NaaBA. 10&0溶於IOOml水中，調抑至8. 5得到50mM抑為 8. 5的測砂緩衝液。
[0018] 所述磁性納米粒子標記單增李斯特菌抗體的製備方法中還包括將所述磁性納米 粒子與單增李斯特菌抗體的偶聯物用BSA溶液封閉後得到所述磁性納米粒子標記單增李 斯特菌抗體的步驟，所述BSA溶液的濃度為5 % (質量百分濃度），所述封閉的溫度為37C， 時間為0.化。
[0019] 所述磁性納米粒子標記單增李斯特菌抗體的製備方法中，還包括將用BSA溶液封 閉後得到的所述磁性納米粒子標記單增李斯特菌抗體用0. 02M抑為7. 4的PBS緩衝液進 行洗塗和息浮的步驟。
[0020] 所述側向流免疫層析測定產品還可包括背板和/或保護膜，可W試紙、卡等形式 存在。
[0021] 上述側向流免疫層析測定產品可按照下述方法製備。
[0022] 製備上述側向流免疫層析測定產品的方法包括：
[0023] I、分別製備上述側向流免疫層析測定產品中所述樣品墊和所述包被膜；
[0024] II、將步驟I得到的所述樣品墊、所述包被膜和吸水墊相互連接，得到所述包被膜 位於所述樣品墊和所述吸水墊之間的側向流免疫層析測定產品。
[00巧]其中，所述包被膜的製作方法包括：將所述單增李斯特菌包被抗體W為2mg/ml的 濃度包被於硝酸纖維素膜得到所述檢測線，將所述側向流免疫層析測定產品中所述第二抗 體W Img/ml的濃度包被於所述硝酸纖維素膜上與所述檢測線相互分離的區域，得到所述 質控線，具有所述檢測線和所述質控線的所述硝酸纖維素膜即為所述包被膜。
[0026] 上述包被膜的製作方法中，所述檢測線和所述質控線的包被均是採用BioDot的 XYZ3050噴膜系統中的BioJet Quanti3000噴頭將2mg/ml所述單增李斯特菌包被抗體溶液 和Img/ml所述第二抗體溶液噴塗至所述硝酸纖維素膜，完成所述檢測線和所述質控線的 包被。其中，2mg/ml所述單增李斯特菌包被抗體溶液和Img/ml所述第二抗體溶液的溶劑均 可為抑為7. 4的0. 02M PBS緩衝液。所述抑為7. 4的0. 02M PBS緩衝液可按照如下方法 配製；稱取2. 3g化2冊〇4、0. 524g NaH2P〇4. &0、8. 77g化Cl溶於水，用水定容至1L，調抑至 7. 4,得到抑為7. 4的0. 02M PBS緩衝液。
[0027] 其中，所述樣品墊的製作方法包括：將所述磁性納米粒子標記單增李斯特菌抗體 W 0. 5mg/ml的濃度包被於玻璃纖維素膜得到所述樣品墊。
[0028] 所述樣品墊的製作方法中，所述玻璃纖維素膜在包被所述磁性納米粒子標記單增 李斯特菌抗體前，進行如下預處理：將所述玻璃纖維素膜在膜處理緩衝液中在37C浸泡1 小時，得到經過預處理的玻璃纖維素膜；所述膜處理緩衝液按照如下方法配製：將Triton X-100、BSA、藏糖溶於上述抑為7. 4的0. 02M PBS緩衝液使Triton X-IOO的質量百分含量 為0. 2%、BSA的質量百分含量為1 %、藏糖的質量百分含量為1 %，調抑至7. 4,得到膜處理 緩衝液。所述將所述的磁性納米粒子標記單增李斯特菌抗體W 0. 5mg/ml的濃度包被於玻 璃纖維素膜是將所述磁性納米粒子標記單增李斯特菌抗體用所述膜處理緩衝液配成所述 磁性納米粒子標記單增李斯特菌抗體含量為0. 5mg/ml的液體，將所述液體噴塗於將所述 經過預處理的玻璃纖維素膜，經乾燥後得到所述樣品墊。其中，所述噴塗可採用BioDot的 XYZ3050噴膜系統中的AirJet Quanti3000噴頭進行。
[0029] 本發明的側向流免疫層析測定產品可用於檢測食物樣品中是否含有單增李斯特 困。
[0030] 本發明的側向流免疫層析測定產品與磁性複合粒子標記的免疫層析檢測技術相 關，是採用磁性複合粒子作為標記材料，進行快速免疫層析測定的一類方法，該技術整合了 磁性納米材料化學合成、標記技術、測流免疫層析技術等相關領域的研究。本發明的側向流 免疫層析測定產品基於側流免疫層析的原理，加入待測樣品後，樣品中的單增李斯特菌與 磁性納米粒子標記單增李斯特菌抗體結合後層析到檢測線（T線）處，在T線處與噴塗的單 增李斯特菌包被抗體形成包被抗體-抗原-磁標記抗體免疫複合物，多餘的磁性納米粒子 標記單增李斯特菌抗體則在質控線（C線）處與抗鼠IgG形成的磁標免疫複合物。用磁性 試紙判讀儀測定T線處磁性微球的磁強強度，通過與設定的闊值比對而確定其陽性或陰性 結果，C線測定結果則作為該測定方法的質控內標。
[0031] 本發明的有益效果：
[0032] 本發明的側向流免疫層析測定產品能夠實現對單增李斯特菌的快速和高靈敏測 定，具有如下優點：靈敏度高、特異性強、快速、簡便，可實現客觀化測定。本發明的側向流免 疫層析測定產品對單增李斯特菌的靈敏度達10 4CFU/mL。本發明可有效滿足有關於單增李 斯特菌的衛生檢疫需要，對於相關疫情的監控和防範具有重要意義。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0033] 圖1為檢測單增李斯特菌的側向流免疫層析測定產品結構示意圖；
[0034] 圖2為聚馬來酸十六醇醋（PMH)修飾的水溶性納米晶電鏡圖；
[0035] 圖3為側向流免疫層析測定試紙檢測值與濃度標準曲線圖。

【具體實施方式】
[0036] W下結合附圖對本發明的實施例作詳細說明。應該強調的是，下述說明僅僅是示 例性的，而不是為了限制本發明的範圍及其應用。
[0037] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0038] 下述實施例中所用的磁性納米粒子是購自深圳市泰勒斯科技有限公司，產品目錄 號為MP-2的聚馬來酸十六醇醋（PMAH)修飾的磁性化化水溶性納米晶（圖2)，其核也為 化3化納米顆粒，固含量為3〇mg/ml，為駿基修飾的磁性納米粒子，該駿基修飾的磁性納米粒 子平均直徑為lOOnm，直徑變異係數（CV)為15% ;該駿基修飾的磁性納米粒子的飽和磁化 強度為40emu/g。
[0039] 下述實施例中所用的待標記單增李斯特菌抗體是購自Abnnova公司的編號為 MB0532抗單增李斯特菌的鼠單克隆抗體。
[0040] 下述實施例中的單增李斯特菌包被抗體是購自Abnnova公司的編號為MAB0529抗 單增李斯特菌的鼠單克隆抗體。
[004。 下述實施例中用於製作樣品墊的玻璃纖維素膜購自Whatman公司、商品目錄號為 Standardly。
[004引下述實施例中用於製作包被膜的硝酸纖維素膜購自Whatman公司、商品目錄號為 Immunopore? FP。
[0043] 下述實施例中的抑為7.4的0.02M PBS緩衝液按照如下方法配巧Ij ;稱取 2. 3肖化2冊〇4、0. 524g NaH2P〇4. &0、8. 77g化Cl溶於純水，用純水定容至1L，調抑至7. 4,得 到抑為7. 4的0. 02M PBS緩衝液。
[0044] 下述實施例中的膜處理緩衝液按照如下方法配製：將Triton X-100、BSA、藏糖溶 於上述抑為7. 4的0. 02M PBS緩衝液使Triton X-IOO的質量百分含量為0. 2 %、BSA的質 量百分含量為1 %、藏糖的質量百分含量為1 %，調抑至7. 4,得到膜處理緩衝液。
[0045] 下述實施例中的50mM抑為8. 5的測砂緩衝液按照如下方法配巧Ij ;稱取 1. 9gNa2B4〇7. 10&0溶於IOOml純水，調抑至8. 5得到50mM抑為8. 5的測砂緩衝液。
[0046] 如圖1所示，根據本發明的實施例，側向流免疫層析測定產品包括樣品墊2、吸水 墊5和具有相互分離的檢測線3和質控線4的包被膜6,樣品墊2、吸水墊5和包被膜6都 安置在一背板7上。其中，所述包被膜6連接在所述樣品墊2和所述吸水墊5之間，所述 檢測線3與所述樣品墊2的距離小於所述質控線4與所述樣品墊2的距離。所述樣品墊 2上負載有磁性納米粒子標記單增李斯特菌抗體，所述檢測線3包被有單增李斯特菌包被 抗體，所述質控線4包被有與所述磁性納米粒子標記單增李斯特菌抗體特異結合的第二抗 體；所述磁性納米粒子標記單增李斯特菌抗體為將待標記單增李斯特菌抗體和駿基修飾的 磁性納米粒子W膚鍵共價結合形成的聚合體。
[0047] 在較優選實施例中，產品的厚度在5. 0 + 0. Imm的範圍（即4. 9-5. Imm)。在較優 選實施例中，吸水墊5的長度在25. 0 + 0. Imm的範圍、包被膜6的長度在35. 0 + 0. Imm的範 圍，樣品墊2的長度在25. 0 + 0. Imm的範圍，檢測線3與質控線4的距離在5. 0 + 0. Imm的 範圍。經研究發現，上述優化的尺寸結構設計，可W使測定產品在滿足檢測的較高準確性的 基礎上獲得較好的檢測效率，並有效節省產品的材料。
[0048] 根據本發明的實施例，側向流免疫層析測定產品的製備方法包括W下步驟：
[0049] (一）駿基修飾的磁性納米粒子標記探針的製備
[0050] 採用適合的駿基修飾的磁性納米粒子，活化其表面的駿基後，採用化學偶聯的方 式將單增李斯特菌抗體定向連接到該駿基修飾的磁性納米粒子表面。
[005。（二）巧Ij試區T線和C線處抗原/抗體的包被
[0052] 採用噴膜儀器，於測試區的T線處噴塗單增李斯特菌包被抗體，於C線處噴塗抗鼠 IgG抗體。
[0053] ( H )樣品墊處標記探針的包被
[0054] 採用噴塗儀器，於樣品墊特定位置處噴塗磁性微球標記的抗單增李斯特菌抗體 (磁性納米粒子標記單增李斯特菌抗體）。
[0055] (四）反應板的組裝成型
[0056] 按照反應板的結構圖（見圖1)要求，於塑料支撐背板7中間粘貼作為測試區的硝 酸纖維素（NC)膜，於NC膜的T線端粘貼樣品墊2, C線端粘貼吸水墊5。在其上面粘貼透 明保護膜。採用試紙分切機，將整塊反應板分切為一定寬帶的紙條，用裝有乾燥劑的專口的 鉛鉛袋進行包裝。
[0057] (五）抗原-抗體磁標免疫複合物的形成
[0058] 於上述組裝成型的反應板的加樣孔處加入待測樣品1，樣品1中的單增李斯特菌 與磁標記的單增李斯特菌抗體（磁性納米粒子標記單增李斯特菌抗體）結合後層析到T線 處噴塗的單增李斯特菌包被抗體，在T線處形成包被抗體-抗原-磁標記抗體免疫複合物， 多餘的磁標單增李斯特菌抗體（磁性納米粒子標記單增李斯特菌抗體）則在C線處與抗鼠 IgG形成的磁標免疫複合物。
[0059] (六）磁標免疫複合物磁場強度檢測
[0060] 用磁性試紙判讀儀測定T線處磁性微球的磁場強度，通過與設定的闊值比對而確 定其陽性或陰性結果，C線測定結果則作為該測定方法的質控內標。
[0061] 所述的磁標免疫複合物的磁場強度，是指在T線和C線處分別滯留下的結合磁珠 的數量用美國如antum Dot的磁共振檢測儀MR測定後所得到的數值。通過雙抗體夾也免 疫反應的條件，研究發現，經大量測定不同臨床血清樣本可確定出各不同正常樣本的測定 均值，W此作為臨界值（cutoff)來確定T線檢測樣本的陽性或陰性結果。C線測定結果則 作為該測定方法的質控內標。
[0062] 實施例1、檢測單增李斯特菌的側向流免疫層析測定試紙的製備
[0063] (一）磁性納米粒子標記單增李斯特菌抗體的製備
[0064] W飽和磁化強度為40emu/g、平均直徑為lOOnm、直徑變異係數（CV)為15%的聚馬 來酸十六醇醋（PMAH)修飾的磁性化3〇4水溶性納米晶（購自深圳市泰勒斯科技有限公司， 產品目錄號為MP-2)作為駿基修飾的磁性納米粒子，W對單增李斯特菌親和常數為 的抗單增李斯特菌的鼠單克隆抗體（購自Abnnova公司，編號為MAB0532)作為待標記單增 李斯特菌抗體，按照下述方法製備磁性納米粒子標記單增李斯特菌抗體：
[006引取2. Smg的上述駿基修飾的磁性納米粒子用MES緩衝液化1M、pH4. 7)洗塗並用 0.4T的磁架分離富集後，用Iml MES緩衝液（0. 1M、pH4. 7)重息，加入1-己基-(3-二甲 基氨基丙基）碳二亞胺巧DC)至終濃度為5mM、加入N服(N-輕基了二醜亞胺）至終濃度為 IOmM,在37C，反應半小時得到活化後駿基修飾的磁性納米粒子。
[0066] 用50mM P服.5的測砂緩衝液洗塗該活化後駿基修飾的磁性納米粒子，取0. 15mg 上述待標記單增李斯特菌抗體和2. 5mg上述活化後駿基修飾的磁性納米粒子混合到50mM P服.5的測砂緩衝液中充分混勻。37C下反應3. 5小時，讓抗體和磁性粒子形成穩定的膚 鍵共價結合得到磁性納米粒子與單增李斯特菌抗體的偶聯物。反應結束後，加入終濃度為 5% (質量百分含量）的BSA溶液對磁性納米粒子與單增李斯特菌抗體的偶聯物上剩餘活 性駿基位點進行封閉，反應在37C下進行0. 5小時。完成後，用抑7. 4的0. 02M PBS緩衝液 洗塗、重息得到25mg/ml磁性納米粒子標記單增李斯特菌抗體液體，4C保存待用。
[0067] (二）檢測單增李斯特菌的側向流免疫層析測定試紙的製備
[0068] W對單增李斯特菌親和常數為IO8M^的Abnnova公司的編號為MAB0529抗單增李 斯特菌的鼠單克隆抗體，作為單增李斯特菌包被抗體，W羊抗鼠IgG抗體作為與所述磁性 納米粒子標記單增李斯特菌抗體特異結合的第二抗體製備包被膜，具體方法如下：
[0069] 採用抑7. 4的0. 02M PBS緩衝液，將羊抗鼠IgG抗體（長沙博優生物科技有限公 司，ABGAM-0500)配製為濃度Img/ml溶液，將單增李斯特菌包被抗體（油cam公司，油36055) 的濃度配製為濃度2mg/ml溶液，選用BioDot的XYZ3050噴膜系統中的BioJet Quanti3000 噴頭將羊抗鼠IgG抗體噴至硝酸纖維素膜（NC膜）的質控線（Control Line, C線）位置， 將單增李斯特菌包被抗體噴至檢測線（Test Line, T線）位置，於相對溼度為10% W下的 乾燥車間進行抽溼4小時後乾燥待用，得到具有檢測線和質控線的包被膜。
[0070] 用上述膜處理緩衝液浸泡玻璃纖維紙1小時，浸泡的溫度為37C，於同樣的抽溼 條件進行抽溼4小時後，用上述膜處理緩衝液稀釋步驟（一）磁性納米粒子標記單增李斯 特菌抗體液體至磁性納米粒子標記單增李斯特菌抗體含量為0. 5mg/ml後，採用BioDot的 XYZ3050噴膜系統中的AirJet Quanti3000噴頭將其噴塗至上述處理過的玻璃纖維素膜上 製備形成樣品墊，於同樣的抽溼條件進行乾燥。在10萬級潔淨和乾燥的車間中把上述乾燥 好的具有檢測線和質控線的包被膜、上述樣品墊、吸水紙（作為吸水墊）、背板和保護膜按 圖1所示進行搭配組裝後，採用BioDot的CM4000裁切系統將貼好的紙板裁切為5mm/條的 寬度，得到檢測單增李斯特菌的側向流免疫層析測定試紙，裝入檢測用夾片待用。該試紙的 結構示意圖如圖1所示。
[0071] 實施例2、檢測單增李斯特菌的側向流免疫層析測定試紙的靈敏度檢測
[0072] W甲酵滅活的單增李斯特菌作為待測樣品來測定實施例1的檢測單增李斯特菌 的側向流免疫層析測定試紙的靈敏度。
[0073] 將單增李斯特菌標準株（NICPBP54002)從-2(TC冰箱取出，W L邸培養基活化 後，0. 3%甲酵滅活12h後用生理鹽水配製成系列濃度（1爐、108、107、106、10 5、104、103、102、 lOCFU/mL)的稀釋液，分別加入由實施例1得到的檢測單增李斯特菌的側向流免疫層析測 定試紙中，並採用磁共振檢測儀MAR(Ma即a BioSciences, 8094-101-01&8094-101-02)讀取 RMU (相對磁場強度）。檢測步驟；檢測前先將待檢測樣品恢復室溫（25C)，用精確移液器 取待檢測樣品50 y 1垂直緩慢滴入實施例1得到的檢測甲酵滅活單增李斯特菌的側向流免 疫層析測定試紙的樣品墊，然後滴入IOOul上述抑為7. 4的0. 02M PBS緩衝液，20分鐘後 用MAR進行測試。該甲酵滅活單增李斯特菌中，CFU/mL的定義為每毫升菌落含量。
[0074] 其檢測結果如下表1所示。從檢測結果中可W得出實施例1的檢測單增李斯特菌 的側向流免疫層析測定試紙的靈敏度為104CFU/mL (取T/C值0. 015為CUT-OFF,大於等於 0. 015為陽性結果，小於0. 015為陰性結果；T/C值為Test-RMU/CtlRMU)。
[0075] 甲酵滅活單增李斯特菌磁性試紙檢測值與濃度曲線圖如圖3所示。
[0076] 表1甲酵滅活單增李斯特菌不同濃度稀釋液的磁性試紙檢測值
[0077]

【權利要求】
1. 一種檢測單增李斯特菌的側向流免疫層析測定產品，其特徵在於，包括樣品墊、吸水 墊和具有相互分離的檢測線和質控線的包被膜，所述包被膜連接於所述樣品墊和所述吸水 墊之間，所述樣品墊上負載有磁性納米粒子標記單增李斯特菌抗體，所述檢測線包被有單 增李斯特菌包被抗體，所述質控線包被有與所述磁性納米粒子標記單增李斯特菌抗體特異 結合的第二抗體；所述磁性納米粒子標記單增李斯特菌抗體為將待標記單增李斯特菌抗體 和羧基修飾的磁性納米粒子以肽鍵共價結合形成的聚合體。
2. 根據權利要求1所述的側向流免疫層析測定產品，其特徵在於，所述羧基修飾的磁 性納米粒子的平均直徑為100nm、80-200nm或60-300nm ;所述羧基修飾的磁性納米粒子的 直徑變異係數為15%、10% -20%或10% -30%;所述羧基修飾的磁性納米粒子的飽和磁化 強度為40emu/g。
3. 根據權利要求1或2所述的側向流免疫層析測定產品，其特徵在於，所述磁性納米粒 子標記單增李斯特菌抗體按照包括如下步驟的方法製備：將所述羧基修飾的磁性納米粒子 活化後與所述待標記單增李斯特菌抗體以50 :3的質量比進行反應得到以肽鍵共價結合形 成的磁性納米粒子與單增李斯特菌抗體的偶聯物。
4. 根據權利要求3所述的側向流免疫層析測定產品，其特徵在於，所述磁性納米粒子 標記單增李斯特菌抗體的製備方法中，所述羧基修飾的磁性納米粒子用1-乙基-(3-二甲 基氨基丙基）碳二亞胺和N-羥基丁二醯亞胺進行活化；所述活化中，所述羧基修飾的磁性 納米粒子活化所用1-乙基-(3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺和N-羥基丁二醯亞胺的濃度 分別為5mM和10mM ;所述活化的溫度為37°C，時間為0. 5h。
5. 根據權利要求3或4所述的側向流免疫層析測定產品，其特徵在於，所述磁性納米粒 子標記單增李斯特菌抗體的製備方法中，所述將羧基修飾的磁性納米粒子活化後與所述待 標記單增李斯特菌抗體以50 :3的質量比進行反應是在37°C在濃度為50mM pH為8. 5的硼 砂緩衝液中反應3. 5小時。
6. 根據權利要求3、4或5所述的側向流免疫層析測定產品，其特徵在於，所述磁性納米 粒子標記單增李斯特菌抗體的製備方法中還包括將所述磁性納米粒子與單增李斯特菌抗 體的偶聯物用BSA溶液封閉後得到所述磁性納米粒子標記單增李斯特菌抗體的步驟，所述 BSA溶液的質量百分濃度為5%，所述封閉的溫度為37°C，時間為0. 5h。
7. 根據權利要求1-6中任一所述的側向流免疫層析測定產品，其特徵在於，所述檢測 線與所述樣品墊的距離小於所述質控線與所述樣品墊的距離。
8. -種製備權利要求1-6中任一所述的側向流免疫層析測定產品的方法，其特徵在 於，包括： I、 分別製備權利要求1-6中任一所述的側向流免疫層析測定產品中所述樣品墊和所 述包被膜； II、 將步驟I得到的所述樣品墊、所述包被膜和吸水墊相互連接，得到所述包被膜位於 所述樣品墊和所述吸水墊之間的側向流免疫層析測定產品。
9. 根據權利要求8所述的方法，其特徵在於，所述包被膜的製作方法包括：將所述單增 李斯特菌包被抗體以為2mg/ml的濃度包被於硝酸纖維素膜得到所述檢測線，將權利要求 1-6中任一所述的側向流免疫層析測定產品中所述第二抗體以lmg/ml的濃度包被於所述 硝酸纖維素膜上與所述檢測線相互分離的區域，得到所述質控線，具有所述檢測線和所述 質控線的所述硝酸纖維素膜即為所述包被膜。
10.根據權利要求8或9所述的方法，其特徵在於，所述樣品墊的製作方法包括：將權 利要求1-6中任一所述的磁性納米粒子標記單增李斯特菌抗體以0. 5mg/ml的濃度包被於 玻璃纖維素膜得到所述樣品墊。
【文檔編號】G01N33/577GK104237518SQ201410174902
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2014年4月25日 優先權日:2014年4月25日
【發明者】史蕾, 向軍儉, 馬嵐, 趙芳, 吳峰, 聞一鳴, 冬冰 申請人:深圳國際旅行衛生保健中心