生產紫色桿菌素的方法及重組菌的製作方法

2023-05-10 17:00:41 1

專利名稱：：生產紫色桿菌素的方法及重組菌的製作方法
技術領域：
：本發明涉及生產紫色桿菌素的方法及重組菌。
背景技術：
：紫色桿菌素(violacein)、脫氧紫色桿菌素是微生物的代謝產物，它屬於吲哚衍生物，由兩個色氨酸分子氧化縮合而成。自從19世紀末紫色桿菌素被發現以來，人們對其生物功能進行了大量的探索，發現它具有如下功能(1)廣譜抗菌性1945年Lichstein等用51株細菌(包括21個種)對紫色桿菌素粗提物進行抗菌實驗，發現紫色桿菌對革蘭氏陽性細菌有顯著的抑制作用，對革蘭氏陰性細菌有較小的抑制性。隨後，1983年Duran等用純化後的紫色桿菌素進行抗菌試驗，純的紫色桿菌素與紫色桿菌素+10%脫氧紫色桿菌素的混合物抗菌效果一樣。紫色桿菌素還可以抑制植物真菌病原菌如/fose2乃'/^3"ecsfcrix，可以抑制桑樹根腐病。在體外紫色桿菌素還具有抗分枝桿菌如ifycWacfei^w/Tz^Zerci/7osisH37Ra的活性，其最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)分別為64ug/mL和128ug/mL，與對肺結核進行化學療法中使用吡嗪醯胺(Pyrazinamide)的濃度相當(deSouza，1999)。(2)抗原生動物活性紫色桿菌素具有殺錐蟲(Caldas，1978;Dur6nefs丄，1994;Hauneta丄，1992)和抗利什曼原蟲(Leishmania)的活性(Leon"a丄，2001)。(3)抗病毒性紫色桿菌素和10%脫氧紫色桿菌素的混合物對侵染Hela細胞的單純性皰疹病毒(HerpesSimplexVirus,HSV)、脊髓灰質炎病毒(Polioviruses)有抵抗活性(Andrighetti-Frohner"<3丄，2003;Duran"s丄，2001;MayG.s丄，1991)，當紫色桿菌素混合物濃度為0.25ug/mL和0.063ug/mL日寸，可以分別抑制62%的單純性皰疹病毒和56%的脊髓灰質炎病毒。(4)抗腫瘤細胞紫色桿菌素對成纖維細胞(V79)系有很高的細胞毒素活性(BlosserWW.，2000;Hauneta丄，1992)。紫色桿菌素對白血病細胞(leukemiacells)、淋巴瘤(lymphoma)、肺、結腸(Dur6n，1997;Meloeta丄，2000)以及由愛滋病毒(AIDS)引起的淋巴瘤(Durdin，1996)都有很好的細胞毒性作用。(5)其它功能紫色桿菌素抗可見光輻射(Antonio"W.，2004)，可代替人工色素作為染料，對天然原料(如絲綢、棉、毛)及合成原料(如尼龍)都有很好的著色效果(Shirata,2000)。目前，已發現可以合成紫色桿菌素的微生物有67royzwZ^"en'M7K^^ace柳、C/7〃pa.a^7e(Moss1978)、/aotA/oo^acfer/i/yzJiK/o^/歷(Sneath1956)、fe/Yyz7a/2ss7t^eoK2'o^9ces(McCarthySA1985)、屍sewo^s2ter。v7。/351t"/_z'c<3^(Egan,Jamesetal.2002)。紫色桿菌素的生物合成途徑基本清楚，其生物合成受一個操縱元的控制，長約7.3kb，包括5個基因，分別是VioA、VioB、VioC、VioD和VioE。
發明內容本發明的目的是提供一種生產紫色桿菌素的方法及重組菌。本發明所提供的重組菌，是將紫色桿菌素合成相關基因簇導入大腸桿菌或惡臭假單孢菌中獲得的重組菌；所述紫色桿菌素合成相關基因簇編碼其胺基酸序列為序列表中序列2、序列3、序列4、序列5和序列6的五種蛋白。所述的紫色桿菌素合成相關基因簇分離自一株產紫色桿菌素的菌株杜擀氏菌屬(A^朋e27a)B2CGMCCNq2056，該菌株合成紫色桿菌素能力較強。其紫色桿菌素合成相關基因簇是一個新的基因。其中，所述紫色桿菌素合成相關基因簇具體為如下1)或2)或3)的DNA分子1)其核苷酸序列是序列表中序列l;2)在嚴格條件下可與序列表中序列1限定的DNA序列雜交且編碼紫色桿菌素合成相關蛋白的DNA分子；3)與l)的DNA分子具有90X以上的同源性，且編碼紫色桿菌素合成相關蛋白的DNA分子。所述步驟3)中的DNA分子，與l)的DNA分子最好有95X以上的同源性。上述嚴格條件可為在6XSSC，0.5。/oSDS的溶液中，在68"C下雜交,然後用2XSSC，0.1%SDS和1XSSC,0.1%SDS各洗膜一次。所述大腸桿菌具體可為Acoh'BL21(DE3)或Acoh'BL21-CodonPlus(DE3)-RIL或AcWiRosetta-gami或DH10B或DH5a。所述惡臭假單孢菌可以為惡臭假單孢菌屬的各種常見菌株如惡臭假單孢菌DSM1693、惡臭假單孢菌ATCC17485或惡臭假單孢菌NCIMB10432。本發明的重組菌可用來生產脫氧紫色桿菌素。本發明的另一個目的是提供一種生產紫色桿菌素的方法。本發明所提供的生產紫色桿菌素的方法，是以L-色氨酸為底物利用所述的重組菌發酵生產紫色桿菌素。其中，將紫色桿菌素合成相關基因簇導入大腸桿菌Ah'BL21-CodonPlus(DE3)-RIL得到的重組菌發酵生產紫色桿菌素，所述L-色氨酸的濃度為O.4g-l.2/L;所述重組菌的初始細胞濃度為0D6。cp0.4-1.2;培養溫度為15-20°C;培養時間為30-40h。所述發酵培養中，發酵培養基還含IPTG，所述IPTG的濃度為0.7-1.3mmol/L。當所述L-色氨酸的濃度為O.4g/L，所述重組菌的初始細胞濃度為006。。=0.6，所述IPTG的濃度為1.3mmol/L，所述培養溫度為25t:，所述培養時間為30h時，最適宜紫色桿菌素的合成。將紫色桿菌素合成相關基因簇導入惡臭假單孢菌NCIMB10432得到的重組菌發酵生產紫色桿菌素，所述L-色氨酸的濃度為O.4g-0.8/L;所述重組菌的初始細胞濃度為0D,二0.8-1.2;培養溫度為15-37°C;培養時間為30-40h。所述發酵培養中，發酵培養基還含正己垸，所述正己垸的濃度為l-2mL/L。所述培養基中還可含有碳原子數為7-12的正垸烴，碳原子數為7-12的正垸烴可替代正己烷。當所述L-色氨酸的濃度為O.4g/L，所述重組菌的初始細胞濃度為0D,二1.0，所述正己烷的濃度為lmL/L，所述培養溫度為20。C，所述培養時間為30h時，最適宜紫色桿菌素的合成。將紫色桿菌素合成相關基因簇導入惡臭假單孢菌NCIMB10432得到的重組菌發酵生產紫色桿菌素，所述發酵生產中，發酵培養基主要由如下物質組成NaH2P042H201.0-2.0g/L、Na2HP0412H203.0—4.0g/L、NH4C10.5-1,0g/L、K2HP043H207.0-8.0g/L、lOOraMMgS047H2010-15mL/L、甘油3-4mL/L和酵母提取物0.5-1.5g/L;所述發酵培養基中添加的L-色氨酸，所述L-色氨酸的濃度為0.4g/L;所述重組菌的初始細胞濃度為006。。=1.0;所述正己烷的濃度為0.5mL/L;培養溫度為20。C，培養時間為30h時，合成的紫色桿菌素的量最高。本發明將合成紫色桿菌素能力較強杜擀氏菌屬("塔朋e^3柳)B2CGMCC他2056的紫色桿菌素合成相關基因簇導入多個大腸桿菌菌株和惡臭假單孢菌中，使紫色桿菌素合成相關基因簇實現異源表達，構建了多個能合成紫色桿菌素的重組菌。利用本發明構建的重組菌生產紫色桿菌素，其產率很高，以L-色氨酸為底物，在普通的LB培養基中培養，紫色桿菌素的產量平均即可達到0.809g/L和0.827g/L。利用本發明構建的重組惡臭假單孢菌，以L-色氨酸為底物，在E2液體培養基中發酵生產紫色桿菌素，其產量可達到1.5g/L，為工業生產紫色桿菌素奠定了基礎。圖1為PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳結果。圖2為重組菌合成的紫色桿菌素的定量結果。圖3為溫度對紫色桿菌素的合成影響。圖4為細胞濃度對Ecoh'BL21-CodonPlus(DE3)-RIL-pET32aVio合成紫色桿菌素的影響。具體實施例方式實施例l、表達紫色桿菌素合成相關基因簇的重組菌1)紫色桿菌素合成相關基因簇的克隆將杜擀氏菌屬("收朋e^a邵.)B2CGMCC2056轉接入液體培養基(澱粉15g/L、硫酸亞鐵0.03g/L、硝酸鉀lg/L、磷酸氫二鉀0.7g/L、硫酸鎂0.5g/L、色氨酸0.5g/L，pH為7.0)，25°C，200rpm培養36小時，按上海生工基因組DNA提取試劑盒說明書提取杜擀氏菌B2CGMCC2056基因組DNA。根據紫色桿菌素合成相關基因簇序列設計引物vioA-for、Vio3054-rev、Vio3046-for和vioE—rev，引物vioA-for、Vio3054-rev、Vio3046—for和vioE-rev的核苷酸序列見表l，以杜擀氏菌B2CGMCC2056基因組DNA為模板，利用高保真PyrobestDNA聚合酶PCR擴增vio-U片段和vio-L片段，擴增vio-U片段所用引物為vioA-for和vio3054-rev;擴增vio-L片段所用引物為vio3046-for和vioE-rev，PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳結果如圖l所示，圖1中，"M"代表分子量標準，"U"代表vio-U片段，"L"代表vio-L片段。PCR產物經PCR純化試劑盒回收。AseI和vV"I雙酶切vio-U片段，7V"I和Wo[雙酶切vio-L片段，雙酶切後的片段用回收試劑盒回收。tableseeoriginaldocumentpage8用NdeI和XhoI雙酶切pET17b，與酶切後的vio-U和vio-L在16℃過夜連接，連接產物用熱激法轉化入E.DcoliDH5a中，轉化產物塗於含相應抗生素的LB平板上，挑取轉化子培養後採用鹼裂解法提取質粒，篩選含插入片段的陽性克隆，插入片段經雙向測序驗證，測序結果表明插入片段的核苷酸序列如序列表中序列1所示，序列表中的序列1自5'末端第1-1308位編碼序列表中序列2所示的蛋白；自5'末端第1305-4322位編碼序列表中序列3所示的蛋白；自5'末端第4323-5612位編碼序列表中序列4所示的蛋白；自5'末端第5612-6730位編碼序列表中序列5所示的蛋白；自5'末端第6740-7312位編碼序列表中序列6所示的蛋白。陽性克隆所含的重組表達載體命名為pET17bVio。同樣的方法，將pET32a與vio-U和vio-L連接獲得重組表達載體pET32aVio。用NdeI和SaI雙酶切雙酶切pC0M9(SmitsT.H.M.etal.，Newalkane-responsiveexpressionvectorsforE.coliandPseudomonas.Plasmid2001.46,16-24.)(清華大學)，與酶切後的vio-U和vio-L在16℃過夜連接，連接產物用熱激法轉化入E.coliDH5a中，轉化產物塗於含相應抗生素的LB平板上，挑取轉化子培養後採用鹼裂解法提取質粒，篩選含插入片段的陽性克隆，插入片段經雙向測序驗證，其核苷酸序列為序列表中的序列1，陽性克隆所含的重組表達載體命名為pC0M9Vio。同樣的方法，將pC0M10(SmitsT.H.M.etal.，Newalkane-responsiveexpressionvectorsforE.coliandPseudomonas.Plasmid2001.46，16-24.)(清華大學)與vio-U和vio-L連接獲得重組表達載體pC0M10Vio。2)構建表達紫色桿菌素合成相關基因簇的重組菌將重組表達載體pET17bVio和pET32aVio分別轉入E.coliBl21(DE3),e.COLIBL21-CodonPlus(DE3)-RIL、￡Rosetta-gami三個菌株中，得到重組菌Eco"'BL21(DE3)-pET17bVio、￡coh.BL21(DE3)-pET32aVio、Ec。h'BL21-CodonPlus(DE3)-RIL-pET17bVio、BL21-CodonPlus(DE3)-RIL-pET32aVio、￡Rosetta-g柳i-pET17bVio禾卩￡co7j'Rosetta-gami-pET32aVio。將pET17b和pET32a分別轉入￡co"'BL21(DE3)、￡BL21-CodonPlus(DE3)-RIL、Eco"'Rosetta-gami三個菌株中，獲得的重組菌￡co7/BL21(DE3)-pET17b、￡coh'BL21-CodonPlus(DE3)-RIL-pET17b、￡coh'Rosetta-gami-pET17b、ABL21(DE3)-pET32a、￡coh'BL21-CodonPlus(DE3)-RIL-pET32a和￡co2iRosetta-gami-pET32a作為對照。將重組表達載體pC0M9Vio和pC0M10Vio分別轉入DH10B、DH5a和惡臭假單孢菌6^ewa^歷OTas;wz^Vs9mt-2NCIMB10432三個菌株中，獲得重組菌DH10B-pC0M9Vio、DH10B-pC0M10Vio、DH5a-pC0M9Vio、DH5a-pC0M10Vio、屍5"ewV咖o朋5"/wfjV<3~pC0M9Vio禾口屍sew(/。膨/351/wtifl^pC0M10Vio。將pC0M9和pC0M10分別轉入DH10B、DH5a和/^ewJo/zo朋5;wz^Vamt-2NCIMB10432三個菌株中，獲得重組菌DH10B-pC0M9、DH10B-pC0M10、DH5a-pC0M9、DH5重組菌EcaZiBL21(DE3)-pET17bVio、￡BL21(DE3)—pET32aVio、￡coh'BL21-CodonPlus(DE3)-RIL-pET17bVio、BL21-CodonPlus(DE3)-RIL-pET32aVio、f.Rosetta-gami-pET17bVio、￡coh.Rosetta-gami-pET32aVio、DH10B-pC0M9Vio、DH10B-pC0M10Vio、DH5a-pC0M9Vio、DH5a-pC0M10Vio、pw"cfe"pC0M9Vio禾口/^ewo^o77o"as/wz^V^pC0M10Vio以及7寸照菌株￡coh'BL21(DE3)-pET17b、￡co"'BL21-CodonPlus(DE3)-RIL-pET17b、￡co"'Rosetta-gami-pET17b、￡co7iBL21(DE3)-pET32a、EBL21-CodonPlus(DE3)-RIL-pET32a、￡coh'Rosetta-gami-pET32a、DH10B-pC0M9、DH10B-pC0M10、DH5a-pC0M9、DH5a-pC0M10、屍se"d/o/zoi3^s/wfidtpC0M9禾卩屍sew/湖o朋sp"io^pC0M10的單菌落分別接種至3mL含相應的抗生素的LB液體培養基，37°C，200rpm振蕩培養過夜。次日按lml/100ml的接種量，接種至新鮮含相應的抗生素的LB培養基中37。C繼續培養2-3h至0D咖為0.6時加誘導劑，重組菌Acoh.BL21(DE3)-pET17bVio、￡coh'BL21(DE3)-pET32aVio、￡c。h'BL21-CodonPlus(DE3)-RIL-pET17bVio、BL21-CodonPlus(DE3)-RIL-pET32aVio、￡co/iRosetta-gami-pET17bVio禾口f.co/iRosetta-garai-pET32aVio以及對照菌^co乃'BL21(DE3)-pET17b、￡coh'BL21-CodonPlus(DE3)-RIL-pET17b、￡coh'Rosetta-gami-pET17b、￡coh'BL21(DE3)-pET32a、￡BL21-CodonPlus(DE3)-RIL-pET32a和￡coh'Rosetta-gami-pET32a中加入IPTG進行誘導，IPTG濃度為lmmol/L。重組菌DH10B-pC0M9Vio、DH10B-pC0M10Vio、DH5a-pC0M9Vio、DH5a-pC0M10Vio、屍se油應as/由會pC0M9Vio禾口屍se油層asp〃"o^pC0M10Vio以及對照菌DH10B-pC0M9、DH10B-pC0M10、DH5a-pC0M9、DH5a—pC0M10、/^ew/awcwas/w^z-fl^a"pC0M9禾口屍sew(/o/zcwa5"pwtids^pCOMlO力口入正己院進行誘導，正己垸濃度為0.05ml/100ml。2(TC誘導培養20h，離心分別收集菌體，菌體中加入無水乙醇5mL，用漩渦混合器將其混勻，然後在200W超聲波清洗器中振蕩0.5h，將振蕩液9000Xg離心5min，保留乙醇溶液。重組菌￡c。A'BL21(DE3)-pET17bVio、Acoh'BL21(DE3)—pET32aVio、￡BL21-CodonPlus(DE3)-RIL-pET17bVio、BL21-CodonPlus(DE3)-RIL-pET32aVio、￡co7iRosetta—gami—pET17bVio、Aco/iRosetta—gami—pET32aVio、DH10B-pC0M9Vio、腿0B-pC0M10Vio、DH5a-pC0M9Vio、DH5a-pC0M10Vio、屍5"e〃a^/zOTa5"/〃"G^^pC0M9Vio禾口/^e"a^/z70/7as/〃tjV<3~pC0M10Vio的乙醇溶液中者卩有藍紫色物質，而對照菌的乙醇溶液中都不含有藍紫色物質。分別將含有藍紫色物質的乙醇溶液減壓蒸餾得到色素，將該色素分別溶於甲醇溶液中，進行高效液相色譜分析，使用Agilent-1100高效液相色譜儀，色譜柱為AgilentEclipseXDB-C18,150mmX4mra，5ixm;柱溫30°C;洗脫劑為70ml/100ml的甲醇水溶液；流速1.0mL/min;檢測波長570nm。高效液相色譜檢測結果表明，所有重組菌合成的色素都包含兩種物質，分別與杜擀氏菌屬"wg朋e^3B2CGMCC2056合成的紫色桿菌素和脫氧紫色桿菌素洗脫時間時間一致(分別為3.0min和4.9min)。紫色桿菌素含量是通過測定藍紫色物質(色素)的乙醇溶液在最大吸收波長的吸光度值來衡量，DuganellaspB2所產紫色桿菌素測定波長為575nm,以無水乙醇作空白對照，通過吸光度值——色素濃度標準曲線得到相對應的色素濃度值，實驗重複3次，實驗結果以三次實驗的平均值表示。紫色桿菌素含量的測定結果如圖2所示，表明各個重組菌中都有紫色桿菌素合成，紫色桿菌素的合成量不同，重組載體pET17bVio和pET32aVio在宿主￡coh'BL21-CodonPlus(DE3)-RIL中紫色桿菌素合成量較高，分別達0.11g/L和0.27g/L;載體pC0M9Vio和pC0M10Vio在宿主Pseudomonasputida中紫色桿菌素合成量較高。圖2中，"1"代表E.coliRosetta-gami-pET17bVio，"2"代表E.coliBL21(DE3)-pET17bVio，"3"代表E.coliBL21-CodonPlus(DE3)-RIL-pET17bVio，"4"代表E.coliRosetta-gami-pET32aVio,"5"代表E.coliBL21(DE3)-pET32aVio，"6"代表E.coliBL21-CodonPlus(DE3)-RIL-pET32aVio,"7"代表DH10B-pC0M9Vio，"8"代表Pseudomonasputida-pC0M9Vio，"9"代表DH5a-pC0M9Vio，"10"代表Pseudomonasputida-pC0M10Vio，"11"代表DH10B-pC0M10Vio，"12"代表DH5a-pC0M10Vio。實施例2、表達紫色桿菌素合成相關基因簇的重組菌高效生產紫色桿菌素1)高效生產紫色桿菌素的條件優化將E.coliBL21-CodonPlus(DE3)-RIL-pET32aVio和Pseudomonasputida-COMlOVio分別接種至含相應的抗生素的LB液體培養基，37°C，200rpm振蕩培養過夜。次日按lml/100ml的接種量，接種至新鮮含相應的抗生素的LB培養基中37℃繼續培養2-3h至0D600為0.6時加誘導劑，E.coliBL21-CodonPlus(DE3)-RIL-pET32aVio加入IPTG作為誘導劑，IPTG濃度為lmmol/L;Pseudomonasputida-C0M10Vio加入正己烷進行誘導，正己烷濃度為0.05ml/100ml。分別在15°C、20°C、25°C、30°C和37°C誘導培養20h後，離心收集菌體，提取紫色桿菌素，定量分析誘導溫度對紫色桿菌素合成的影響。紫色桿菌素含量的測定方法同實施例1。誘導溫度對E.coliBL21-CodonPlus(DE3)-RIL-pET32aVio和Pseudomonasputida-pC0M10Vio合成紫色桿菌素的影響如圖3所示，表明誘導培養溫度為15-20°C比較適宜E.coliBL21-CodonPlus(DE3)-RIL-pET32aVio中紫色桿菌素的合成，在20°C紫色桿菌素的合成量最高。誘導培養溫度為15-3720°C比較適宜Pseudomonasputida-pC0M10Vio中紫色桿菌素的合成，在20°C紫色桿菌素的合成量最高。圖3a為溫度對BL21-CodonPlus(DE3)-RIL-pET32aVio合成紫色桿菌素的影響，圖3b為溫度對Pseudomonasputida-pC0M10Vio合成紫色桿菌素的影響。將E.coliBL21-CodonPlus(DE3)-RIL-pET32aVio按照上述方法培養到0D600分別為0.4、0.6、1.0和1.2時在培養液中加入IPTG使其終濃度為lmmol/L，20°C誘導培養20h後，離心收集菌體，離心收集菌體，提取紫色桿菌素，對紫色桿菌素進行定量分析。加入誘導劑時菌體濃度對AcoWBL21-CodonPlus(DE3)-RIL-pET32aVio合成紫色桿菌素的影響如圖4所示，表明菌體A"^'BL21-CodonPlus(DE3)-RIL-pET32aVio的0D柳)為0.4-1.2時加入誘導劑都有利於紫色桿菌素的大量合成，其中在OD,為0.6時達到最高。以L-色氨酸、誘導劑(IPTG)的量、誘導時間3個因素為試驗因素，以紫色桿菌素產量為指標，Acoh'BL21-CodonPlus(DE3)-RIL-pET32aVio合成紫色桿菌素的能力進行3因子3水平的正交試驗，ABL21-CodonPlus(DE3)-RIL-pET32aVio合成紫色桿菌素能力的結果見表2。表2正交試驗結果與分析(BL2卜CodonPlus(DE3)-RIL-pET32aVio)tableseeoriginaldocumentpage12實驗結果表明，在LB培養基中添加L-色氨酸0.4g-L2/L，誘導劑(IPTG)的量0.7-1.3mmol/L，誘導時間為30-40h，￡co/iBL21-CodonPlus(DE3)-RIL-pET32aVio合成紫色桿菌素的含量均很高。￡coh'BL21-CodonPlus(DE3)-RIL-pET32aVio在含相應的抗生素的LB培養基(LB培養基中添加L-色氨酸，L-色氨酸的終濃度為0.4g/U培養到菌體的0De。。為0.6時加入誘導劑IPTG，IPTG的終濃度為1.3mmol/L，25。C誘導培養30h。實驗重複3次。紫色桿菌素含量的測定結果如表3所示。表3.驗證結果tableseeoriginaldocumentpage13上述結果表明，培養基中L-色氨酸的濃度為0.4g/L時，ABL21-CodonPlus(DE3)-RIL-pET32aVio菌體的OD,為0.6時加入誘導劑IPTG，IPTG的終濃度為1.3mmol/L，25。C誘導培養30h，￡co7iBL21-CodonPlus(DE3)-RIL-pET32aVio合成紫色桿菌素平均可達0.809g/L，最高可達0.866g/L。以L-色氨酸、加誘導劑時細胞濃度(0D6。。)、誘導劑(正己烷)的量、誘導時間4因素為試驗因素，以紫色桿菌素產量為指標，對/^ewcfo/z7o/2aspw^z'o^pCOM10Vio產紫色桿菌素能力進行4因子3水平的正交試驗。/^ewo^/z朋ss;w"^"pC0M10Vio合成紫色桿菌素能力的結果見表4。表4正交試驗結果與分析tableseeoriginaldocumentpage13實驗結果表明，在LB培養基中添加L-色氨酸0.4-0.8g/L，誘導劑(正己烷)的量1-2mL/L，添加誘導劑時/^ewcto膨朋s;w^Va"pC0M10Vio的細胞濃度(OD,)為0.8-1.2，誘導時間為30-40h，/^ew/，朋as;wz^o^pC0M10Vio合成紫色桿菌素的含量均很高。Z^ewob/i7o/^s/w^fl^pC0M10Vio在含相應的抗生素的LB培養基(LB培養基中添加L-色氨酸，L-色氨酸的終濃度為0.4g/L)培養到菌體的0Ds。。為1.0加入誘導劑正己烷，正己烷的終濃度為lraL/L，20。C誘導培養30h。實驗重複3次。紫色桿菌素含量的測定結果如表5所示。表5.驗證結果tableseeoriginaldocumentpage14上述結果表明，培養基中L-色氨酸的濃度為0.4g/L，/^ew^^朋a5",f/o^pC0M10Vio菌體的0D6。。為1.O加入誘導劑正己烷，正己烷的終濃度為1mL/L，2(TC誘導培養30h，屍sei/ob/zro/7aspw^Va"pC0M10Vio合成紫色桿菌素平均可達0.827g/L，最高可達0.861g/L。將屍sei/flb/77o朋sp〃"^a^pC0M10Vio轉接入E2液體培養基(NaH2P04.2H201.3g/L，Na2HP0412H203.0g/L,NH4C10.9g/L，K2HP043H207.5g/L，lOOmMMgS047H2010mL/L，甘油3mL/L，酵母提取物1.0g/L，調節pH為7.0)，E2液體培養基中添加L-色氨酸，L-色氨酸的終濃度為O.4g/L，3(TC，200rpm振蕩培養過夜。次日按10ml/100ml的接種量，接種至新鮮含相應的抗生素的E2培養基(加入L-色氨酸的濃度為0.4g/L)中30。C繼續培養3-4h至OD,為l.O時加入正己垸(0.5ral/100ml)進行誘導，2(TC誘導培養30h，離心收集菌體，提取色素，色素經高效液相色譜鑑定為紫色桿菌素和脫氧紫色桿菌素。對紫色桿菌素進行定量分析，實驗重複3次。實驗結果表明，屍sew/咖o/asp""^"pC0M10Vio在E2培養基中，色素產量較高，最終產量達1.5g/L(三次重複平均值)。<110〉清華大學生產紫色桿菌素的方法及重組菌<130〉CGGNARW81772<160〉6〈210〉1〈211〉7312DNA<213〉杜擀氏菌屬("〃g朋e〗Zg)B2CGMCC2056〈400〉1attctgacatttgcatagttggcgcaggcatagggggcctcagttgtgcg60acccagttgatcaacgccgccgccggc^gtcagggtgttcgacatggst:120acgacggtgggcgggcgcatccagtcgcat肌agteiggLcgaggagga犯tcgccgaactc180ggcgccgcccgctactcgccgcaactccatccgcatttcgagcaactcatgcagg肌tgc240gggctggcgcatgcgacctaccctttcacccaggtggtgtcgctcgatcaggcgcaggag300a^ctg^ggcaactctgctgagcctgagtgcgatgctgaaaaaacatccgaacgattcc360ttccttgaattcgtcagccagtacctgggcgccgccgaagcgacccgcatgatc肌ggcg420accggttacgacgccttgctgctgccggtggtctcggcagcgatggcctacgacatcatc480a^^gcaccaagctttaccg已aa^cgccgccaacgsgtggcgctatgcc540accgacggctacagcgagctgCtgCgtC￡Lgttgcagcgccaggcccaggacgccggcgtg600g肌ttccggctggggcatcgcttgctgtcggttgaaa^gtccggcaccgaccatgtcctc660gccttccgcc咖tgggcgatactC3g￡Ltgcaccgggcgcgccatgtgatcacgaccctc720ccgccgaccgccatgaagcgcctgaacatggattttccggccgccttxagtxccttccag780tacgattccctgcctttgttca^ggattcctgaccttcgaaacagcctggtgggacgcg840ctcgggctgaccgaca33gtgctgatggccgataatcctcttcggaaaatctacttcaag■ggcgacaaatacctggtgttctacaccgac3gCgCC3gCgccacctattggCggg敏3C960ctggagca^gggga卿cgtttacctggaccgggtxcgcc卿agtgctg1020ccgctg犯cggtcagccgctgccgcagatcaaggcgcatttttacaagcactggccgcat1080ggcgtcgagttcagcctggagccgg卿ccg3gC3tCC3gcaaccctgctccaccgcgac1140ggcatcatctcctgcixggacgcgtatacctcgcattgcggctggatggaaggcagcUg1200atcagcgccgggcacgctacccgcctgttgctggaacggctcagccatccgccagc3ca31260tccgggcacgactttaccctcgccacctctcttactgagcgcgcatgagcattctcgact1320ttccccgctttcattttcgggggtttgcccgcgctaatgtgcccactgccaaccgcaata1380cgcacggccatgagccgccccggcgggc^gcaac^tcaactatctgcgaca^ccaccctcaccgagcctgccatatcagtccagttttccggccagcattccagtatgcacctggccgggtttgctgctgggtgtcggtccga^c3gcaacggtgccacgccatcatgggcatgtccagaccatctgtacggtacaaagaggatggcgaacctgaccctggcagcagttccgaacaggtatcccttcatcgcgcctgatgcacgcgtga犯gcggccgcccgagtggatacctgtacgcgccgctggctgcggagcgcgtca^c^tgt犯c鄉cgcg3tgtgCtggCcgatcgccacacgccgacgggcgcctatccacttcgtcactatcgatatcgccgt:cgg肌gccggatccgcttttcgtggcgaggacgcgcaccacggtccatttacgcggttcagcgcccgsgcgcagccgtggcg卿gcgcgccttggctgttcaatcggcatcggcgccgcgccaggaatatgccgtcctacccatcggc肌gctgtgtcttcgatcgcgcsggcgtctgg犯gcgccgcttgcgcgatcgtcggccacgggccgccatcggcgcgcgattacgccgtcggacaaggtggc卿tgactgtcgctgcaagtccacgcgccgagctgcgcgtatgccgccggscgagtggcgccctggctgatggcgccagcgcttccagattcgtgcttctatgcgcggc犯acgccgcctatcagcg犯c鄉gcgcgacg犯tgttccatgagcg3gggC3tctga^3cgcc3ctggtcggcgaaccgcgccaggccagttcagatWcgggcgggcattttcctcgatccgcC犯gELggCgCatgtcgacgcctgtggcgccagcagcctggacggccatccgcgctgggcgatcgcccgcagtgccgctgcC3gtggg3Cgcccaaccggcggcgagctgggtgcgcgtggcgttcaggcg鄉gtgctgctttctctaccgtgttcagcctgcgatccgcccgaaatcgccttcctcaaga^犯ggcg3attcccaactctggagctggctcg肌8tcgctcggcg，ggcctggacacgtttcgagtgcgatccgccggcggcgagcctgga^g"tt3g卿gggtggcggtatcgattcagcgaggcgg3tC3CCggccaagctggcgatgggtcgacgctcagcggaggcgcattctcgacgatgaatttcctcttttgccgacgacgcagaaaccgcgacgagctggccggtactcgttcaccacgcaagcttgctxccgcaacatccacccggc犯gccgactg^cgacagc3cggcgcatcccgccalcggccgacccgcatccgacgactgagcacgtgattggCgg3CC3SLg^LCCgggagcctgttcctcggtcgcacctcgacctggaatgcgcagggcctgcggcaccccatg犯gacgttctacgccggaatttgcggcccgactaaggccgtggcaccacctgttgcgaccgcgacggtgg犯tccgcgggcgaagcttgctcccggccggctaccgtccagctgCCtgtgggg3ca^c33cccccaagcaagccggtacgctggattcggccgtC肌tCCgg3Cggatgtgctgcgattcgccgggccacctatggtg卿gtggcgcgaggccgctgggcgatgctgtacctccacggcctcgggtgctgcagggactttccgggcgctg冗ggctgggagttcatgctgggcgcatctggscgagctactacctgcaagtgccaagagctatgaaatacctggcatgtcatcactgtcgctcagtgaaactgcgaggaccggaatgattcaccggcgccccgcttcgacccttcttcccacgcgatctgcccCCtC3犯g3gcagcgcgctggccccatttcccattcgacc1440aggttcgatg1500aatttttgcg1560cgcgatggcg1620cattacaacg1680gccgagccgg1740acgcccaaca1800gtcggcagcg1860tccaggctgt1920acaccgctgc1980gggctgacgg2040gtgttctacg2100ccggccggcc2160catgcggacc2220ggcgccgtgt2280ctcatgctgc2340gactactggc2400ggttcgctca2460tccgacagca2520cagacgatca2580gcgcaggcgc2640ggctatgcgg2700gaggcacagg2760gacataccgg2820gagctggtct2880gaaacctatt2940taceitgccga3000acccaggtcg3060ggctgcaagg3120atgctgcagt3180gtcgaggccg3240cgccgcaaca3300tacctgatgg3360gcgctgggag3420tmccgagc3480cccggtaaat3540gatctgttcg3600ctcaccaacc3660"ttcgcgctcg3720gccgtgtcgc3780atttccagcgcggccgtgccccgatcccaacgctgatggctgaatgcctcacatgccgtcccgccatcagtggcgcagtatggagttcttgaatgcacaatggcgcagcgagtcagcca^gcatca^ggccggtcgtcggtcgaaggcttacgccgtcatac犯ga^tctgatcatcggggcgcttxcaacgccgcggggccagtttgctgccctacactcagccgctatcgcgctgccatgtcctgct3calggcgcttgggcctggtatatggcgatcccgctacacagaagctgtaacgtttggtaagccggactgtgcggaaa肌gccgcgccatattcctggaagacgctgtgcggccggcatcatacgacctgsctggccgcggttcgaccaggctgcgcgccggcgctgaaaggcccgttcggcaccacttccatcgacatccggcgtaccccagtgactaccgcgcgcagctaatcagca^aatCELtcatccggax^tg3gcgccgatccgagtgctggcgcatggcatttgtttcccttggcacaaagtgcgtgctgatcggccgacggcgttcg犯caaactgggcttccggccgcgcacggcacgccccttcggcatctagcaacgacgatcggcgatggaagacgtccttgtcggagcgccaactacccgctacatgcttcacatcgca^acttggastctttgcaa^cccgccaatcgaerttc犯gcggcgttggtcacggtcagttgtcgtggtgtC3ggttgM"ta^tgaacctggctggccggccaatccggtacctgatgcagcgcgcaaaagcatgaccggttgggcgc肌cgagcctgggatctggaggccgctgaccgattgtgggcggcggtccacgttagtcaactcgcgCCggC3tC3"tcggtcggcgtcgctggaccaactattactc鄉gcccgggcccactccgtccttcttcccgc肌ggatcgccaccatccagcctggccactgccaccggctcatcaatggcggcgcatgtacgtcttcatttacggggcga^tgctgaicacaagaaatgttxcctacgagggta^ctaagaagt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560MetSerGlulieGlyAspAlaArgArgGlyGinSerArgLysGinLys65707580ValAlaTyrAlaArgGluAlaGluProAlaGlyValLysLeuTyrGlu859095ArgAlaLeuAlaAspGluValThrProPheHisGluLeuPheLeuPro100105110GinAlalieLeulieAspGlyGluAlaArgHisAspGlyArgHisThr115120125ValLeuGlyGinAlaAlaAspAlaTrpValValGluArgProGlyLys130135140AlaAlaSerValPheTyrLeuGinAlaGlyGlyAsnHisLeuLeuArg145150155160MetValThrGlyAsnAspAlaGinHisGinSerValArgAspPhePro165170175AsnPheLeuAlaGlyAsplieAlaAlaSerValPheValSerGlu180185190權利要求1、一種重組菌，是將紫色桿菌素合成相關基因簇導入大腸桿菌或惡臭假單孢菌中獲得的重組菌；所述紫色桿菌素合成相關基因簇編碼其胺基酸序列為序列表中序列2、序列3、序列4、序列5和序列6的五種蛋白。2、根據權利要求1所述的重組菌，其特徵在於所述紫色桿菌素合成相關基因簇為如下l)或2)或3)的DNA分子1)其核苷酸序列是序列表中序列1;2)在嚴格條件下可與序列表中序列1限定的DNA序列雜交且編碼紫色桿菌素合成相關蛋白的DNA分子；3)與l)的DNA分子具有90X以上的同源性，且編碼紫色桿菌素合成相關蛋白的DNA分子。3、根據權利要求1或2所述的重組菌，其特徵在於所述大腸桿菌為E.coliBL2l(DE3)或E.coliBL2l-CodonPlus(DE3)-RIL或E.coliRosetta-gami或DH10B或DH54、根據權利要求1或2所述的重組菌，其特徵在於所述惡臭假單孢菌為惡臭假單孢菌NCIMB10432。5、一種生產紫色桿菌素的方法，是以L-色氨酸為底物利用權利要求1至4中任一所述的重組菌發酵生產紫色桿菌素。6、根據權利要求5所述的方法，其特徵在於將紫色桿菌素合成相關基因簇導入大腸桿菌￡co"'BL21-CodonPlus(DE3)-RIL得到的重組菌發酵生產紫色桿菌素，所述L-色氨酸的濃度為0.4g-l.2/L;所述重組菌的初始細胞濃度為0D6。。=0.4-1.2;培養溫度為15-20°C;培養時間為30-40h。7、根據權利要求5所述的方法，其特徵在於將紫色桿菌素合成相關基因簇導入惡臭假單孢菌NCIMB10432得到的重組菌發酵生產紫色桿菌素，所述L-色氨酸的濃度為0.4g-0.8/L;所述重組菌的初始細胞濃度為OD6。。=0.8-1.2;培養溫度為15-37°C;培養時間為30-40h。8、根據權利要求7所述的方法，其特徵在於所述發酵培養中，發酵培養基包含NaH2P042H201.0-2.0g/L、Na2HP0412H203.0-4.0g/L、NH4C10.5-1.0g/L、K2HP043H207.0-8.0g/L、lOOmMMgS047H2010-15mL/L、甘油3-4mL/L和酵母提取物O.5-1.5g/L。9、根據權利要求7或8所述的方法，其特徵在於所述發酵培養中，發酵培養基還含有正己烷；所述正己烷的濃度為1-2mL/L。10、根據權利要求6所述的方法，其特徵在於所述發酵培養中，發酵培養基還含有IPTG;所述IPTG的濃度為0.7-1.3mmol/L。全文摘要本發明公開了生產紫色桿菌素的方法及重組菌。本發明的重組菌，是將紫色桿菌素合成相關基因簇導入大腸桿菌或惡臭假單孢菌中獲得的重組菌；所述紫色桿菌素合成相關基因簇編碼其胺基酸序列為序列表中序列2、序列3、序列4、序列5和序列6的五種蛋白。本發明生產紫色桿菌素的方法，是以L-色氨酸為底物利用所述的重組菌發酵生產紫色桿菌素。本發明方法生產紫色桿菌素的產率高，可用於工業化生產。文檔編號C12N1/21GK101386834SQ20081022522公開日2009年3月18日申請日期2008年10月28日優先權日2008年10月28日發明者翀張,王海勝,蔣培霞,邢新會申請人:清華大學