他克莫司粗品的純化方法

2023-05-11 01:16:06 3

專利名稱：他克莫司粗品的純化方法
他克莫司粗品的純化方法
技術領域：
本發明涉及一種醫藥生物技術領域的純化方法，尤其涉及一種他克莫司粗品的純化方法。
背景技術：
他克莫司是一種新型強效的大環內酯類免疫抑制劑，最早由日本藤澤藥品工業公司探索研究所於1984年自日本筑波山土壤中分離到的筑波黴菌的發酵液中提取得到；1989年他克莫司首次應用於臨床肝臟移植；1991年日本開發的名為普樂可復(Prograf)他克莫司膠囊劑和注射劑正式上市，用於原發性肝移植和腎移植的排斥反應治療，後又被批准用於骨髓移植。目前他克莫司製劑已在日本、美國、英國、德國、加拿大、丹麥、法國、義大利、西班牙、愛爾蘭等80多個國家上市，廣泛應用於肝臟、胰腺、腎臟、心臟和肺等實體器官移植後的抗排異治療。1999年他克莫司軟膏投放日本市場，用於治療成人的特應性皮炎。 此外，他克莫司對牛皮癬、銀屑病、魚鱗病、糖尿病、白塞氏病、變應性皮炎、類風溼性關節炎以及多發性硬化病等自身免疫病有療效。主要地，由於他克莫司來源於發酵產品，發酵過程同時也產生了多個他克莫司類似物，包括二氫他克莫司和子囊黴素等雜質；這些雜質和他克莫司結構極為相似，物理化學性質相近，通過常規的純化技術難於獲得較高純度的原料藥，從而難以滿足市場需要。現有關於他克莫司分離純化的文獻中雖然均揭露了用吸附樹脂或改性矽膠來精製他克莫司，但存在著純化收率低、工業化成本高的問題。次要地，高速逆流色譜技術(high-speedcounter-current chromatography,HSCCC)是基於流體動力學原理開發的一種新興無固體載體的高效液-液分配色譜技術，已成功應用於多種天然中藥和活性成分分離，並開始在微生物發酵藥物分離過程中應用。隨著高速逆流色譜技術的發展，製備型逆流色譜儀已開始得到應用，但如何節約溶劑並進行連續生產並未見相關報導。

發明內容本發明所要解決的技術問題在於提供一種他克莫司粗品的純化方法，不僅能夠獲得高純度的他克莫司，且具有較高的純化收率，從而可降低工業化的成本。本發明是通過以下技術方案解決上述技術問題的一種他克莫司粗品的純化方法，該純化方法包含如下具體步驟(I)用第一混合有機溶劑溶解他克莫司粗品以獲得濃度為5_40g/L他克莫司粗品溶液，之後將該他克莫司粗品溶液進行超聲振蕩，超聲頻率40KHz，超聲時間30-60min ;所述第一混合有機溶劑由甲基叔丁基醚、甲醇和水按100 110:340 380:275 305的體積比混合而成；(2)將步驟(I)超聲結束後的他克莫司粗品溶液進行快速濾紙抽濾，抽濾所得的濾液即樣品溶液採用製備型高速逆流色譜儀進行連續純化並收集含他克莫司的主峰；
( 3 )合併步驟(2 )收集所得的收集液，之後依次進行減壓濃縮、有機溶劑萃取、濃縮萃取液並重結晶以獲得產品；進一步地，所述步驟(2)中製備型高速逆流色譜儀的色譜條件為製備型高速逆流色譜儀上海同田生物技術有限公司生產的TBE-5000A型製備型高速逆流色譜儀；溶劑體系單獨配置流動相與固定相；其中流動相為所述第一混合有機溶劑；固定相為第二混合有機溶劑，且該第二混合有機溶劑由體積比為13 16:11 13. 5:0. 9 1.1的正己烷、甲基叔丁基醚和甲醇組成；進樣方式連續進樣； 主機轉速450_500rpm；流動相流速20_25ml/min；檢測波長254nm;製備溫度20-25°C ;在線檢測軟體N2000色譜工作站。進一步地，所述步驟(2)中採用製備型高速逆流色譜儀純化的過程為將所述固定相以75-100ml/min的流速裝滿色譜分離柱，然後開啟速度控制器使逆流色譜儀按順時針方向旋轉，當主機轉速達到450-500rpm時，以20_25ml/min流速泵進該流動相,待流動相流出且兩相溶劑體系在色譜柱內達到平衡時，取所述樣品溶液進樣200ml，然後分段收集含他克莫司的主峰。進一步地，所述第二混合有機溶劑的製備過程為將正己烷、甲基叔丁基醚和甲醇按體積比13 16:11 13. 5:0. 9 I. I混合攪拌20_30min，之後採用40KHz頻率的超聲波脫氣20-30min即可。進一步地，所述步驟(3)中的有機溶劑為乙酸乙酯或乙酸丁酯。進一步地，所述步驟(3)中重結晶的具體操作為在濃縮後的萃取液中加入熱乙醚，攪拌溶解後置於0-5°C結晶，結晶獲得的晶體採用冷乙醚洗晶，之後將晶體進行50-60°C真空乾燥，得到產品。本發明他克莫司粗品的純化方法的有益效果在於I、通過本發明純化方法的操作步驟，不僅能夠獲得高純度的他克莫司，且具有較高的純化收率,從而可降低工業化的成本；2、改變了常規高速逆流色譜單次進樣的缺點，採用連續進樣的方式，使得一次逆流可以分離的樣品量得以大大提升；3、另外，在連續的逆流生產過程需要大量的流動相，只需要少量固定相，本發明通過改變常規高速逆流色譜利用萃取分層同時配製流動相和固定相的方式，而採用了根據需要單獨配製固定相和流動相，不僅節省了大量溶劑，且因溶劑無需靜置，從而節省了時間。
具體實施方式
本發明他克莫司粗品的純化方法，該純化方法包含如下具體步驟(1)用第一混合有機溶劑溶解他克莫司粗品以獲得濃度為5-40g/L他克莫司粗品溶液，之後將該他克莫司粗品溶液進行超聲振蕩，超聲頻率40KHz，超聲時間30-60min ;第一混合有機溶劑由甲基叔丁基醚、甲醇和水按100 110:340 380:275 305的體積比混合而成；(2)將步驟
(I)超聲結束後的他克莫司粗品溶液進行快速濾紙抽濾，抽濾所得的濾液即樣品溶液，之後將固定相以75-100ml/min的流速裝滿色譜分離柱，然後開啟速度控制器使逆流色譜儀按順時針方向旋轉，當主機轉速達到450-500rpm時，以20_25ml/min流速泵進流動相,待流動相流出且兩相溶劑體系在色譜柱內達到平衡時，取所述樣品溶液進樣200ml，分段收集含他克莫司的主峰；(3)合併步驟(2)收集所得的收集液並進行減壓濃縮，將獲得的濃縮液採用乙酸乙酯或乙酸丁酯萃取，之後將萃取液進行濃縮，接著在濃縮後的萃取液中加入熱乙醚，攪拌溶解後置於0-5°C結晶，結晶獲得的晶體採用冷乙醚洗晶，之後將晶體進行50-60°C真空乾燥，得到產品。其中，步驟(2)中製備型高速逆流色譜儀的色譜條件為製備型高速逆流色譜儀上海同田生物技術有限公司生產的TBE-5000A型製備型高速逆流色譜儀；
溶劑體系單獨配置流動相與固定相；其中流動相為第一混合有機溶劑；固定相為第二混合有機溶劑，且該第二混合有機溶劑由體積比為13 16:11 13. 5:0. 9 I. I的正己烷、甲基叔丁基醚和甲醇組成；進樣方式連續進樣；主機轉速450-500rpm；流動相流速20_25ml/min；檢測波長254nm；製備溫度20-25°C ；在線檢測軟體N2000色譜工作站。且第二混合有機溶劑的製備過程為將正己烷、甲基叔丁基醚和甲醇按體積比13 16:11 13. 5:0. 9 I. I混合攪拌20_30min，之後採用40KHz頻率的超聲波脫氣20-30min 即可。為了對本發明純化方法進行進一步地闡述說明，申請人給出了以下幾個實施例，且在各實施例中所採用的儀器和試劑TBE-5000A型製備型高速逆流色譜儀(上海同田生物技術有限公司);8823B紫外檢測器(北京賓達英創科技有限公司)；N2000色譜工作站(浙江智達信息工程有限公司);HX-2050恆溫循環器(北京博醫康實驗儀器有限公司);LC-2010A高效液相色譜儀(日本島津公司)；BUCHI旋轉蒸發儀(瑞士步琪有限公司)；所有應用於HSCCC的有機溶劑均為化學純；應用於HPLC的有機溶劑為色譜純。實施例I :稱取IOOg他克莫司粗品並溶解於3400ml由體積比為105:356:290的甲基叔丁基醚、甲醇和水混合而成的第一混合有機溶劑中，之後進行超聲振蕩40分鐘，超聲頻率40KHz ;超聲結束後的溶液採用快速濾紙抽濾；配製流動相即該第一混合有機溶劑81L ;配製固定相6000ml，具體地，將正己烷、甲基叔丁基醚和甲醇按體積比14. 4:12. 4:1混合攪拌25min，之後採用40KHz頻率的超聲波脫氣25min即可。將固定相以80ml/min的流速裝滿色譜分離柱，然後開啟HX-2050恆溫循環器調節溫度為22°C，開啟速度控制器，使逆流色譜儀按順時針方向旋轉，當主機轉速達到480rpm時，以22ml/min流速泵進流動相，待流動相流出，兩相溶劑體系在色譜柱內達到平衡時，取樣品溶液通過六通閥進樣200ml，開啟8823B紫外檢測器，然後根據N2000色譜工作站色譜圖分段收集含他克莫司的主峰，且每4min收集一瓶；當含他克莫司的主峰出完後，再次進樣，連續進樣17次(每次進樣200ml)，且對每次進樣後的含他克莫司的主峰均每4min收集一瓶。合併收集到的收集液，並採用BUCHI旋轉蒸發儀減壓濃縮，濃縮所得的濃縮液採用乙酸丁酯萃取兩次，之後所得乙酸丁酯萃取液用BUCHI旋轉蒸發儀濃縮至粘稠狀，接著將濃縮後的乙酸丁酯萃取液倒入燒杯，並往燒杯內加入熱乙醚，攪拌溶解後置於:TC結晶並過濾，過濾得到的晶體用冷乙醚洗晶，然後將晶體進行55°C真空乾燥，得到粉末即產品，最後產品經LC-2010A高效液相色譜儀檢測得知，產品中他克莫司含量達到99. 2% (即產品純度高達99. 2%)、子囊黴素含量O. 18%、二氫他克莫司含量O. 17%、收率為62. 5%。實施例2 稱取18g他克莫司粗品並溶解於3600ml由體積比為100:340:275的甲基叔丁 基醚、甲醇和水混合而成的第一混合有機溶劑中，之後進行超聲振蕩30分鐘，超聲頻率40KHz ;超聲結束後的溶液採用快速濾紙抽濾；配製流動相即該第一混合有機溶劑85L ;配製固定相6000ml，具體地，將正己烷、甲基叔丁基醚和甲醇按體積比13:11:0. 9混合攪拌30min，之後採用40KHz頻率的超聲波脫氣30min即可。將固定相以75ml/min的流速裝滿色譜分離柱，然後開啟HX-2050恆溫循環器調節溫度為25°C，開啟速度控制器，使逆流色譜儀按順時針方向旋轉，當主機轉速達到450rpm時，以25ml/min流速泵進流動相，待流動相流出，兩相溶劑體系在色譜柱內達到平衡時，取樣品溶液通過六通閥進樣200ml，開啟8823B紫外檢測器，然後根據N2000色譜工作站色譜圖分段收集含他克莫司的主峰，且每5min收集一瓶；當含他克莫司的主峰出完後，再次進樣，連續進樣18次(每次進樣200ml)，且對每次進樣後的含他克莫司的主峰均每5min收集一瓶。合併收集到的收集液，並採用BUCHI旋轉蒸發儀減壓濃縮，濃縮所得的濃縮液採用乙酸丁酯萃取兩次，之後所得乙酸丁酯萃取液用BUCHI旋轉蒸發儀濃縮至粘稠狀，接著將濃縮後的乙酸丁酯萃取液倒入燒杯，並往燒杯內加入熱乙醚，攪拌溶解後置於5°C結晶並過濾，過濾得到的晶體用冷乙醚洗晶，然後將晶體進行50°C真空乾燥，得到粉末即產品，最後產品經LC-2010A高效液相色譜儀檢測得知，產品中他克莫司含量達到99. 8% (即產品純度高達99. 8%)、子囊黴素含量O. 08%、二氫他克莫司含量O. 06%、收率為77. 4%。實施例3 稱取120g他克莫司粗品並溶解於3000ml由體積比為110:380:305的甲基叔丁基醚、甲醇和水混合而成的第一混合有機溶劑中，之後進行超聲振蕩60分鐘，超聲頻率40KHz ;超聲結束後的溶液採用快速濾紙抽濾；配製流動相即該第一混合有機溶劑75L ;配製固定相6000ml，具體地，將正己烷、甲基叔丁基醚和甲醇按體積比16:13. 5:1. I混合攪拌20min，之後採用40KHz頻率的超聲波脫氣20min即可。將固定相以lOOml/min的流速裝滿色譜分離柱，然後開啟HX-2050恆溫循環器調節溫度為20°C，開啟速度控制器，使逆流色譜儀按順時針方向旋轉，當主機轉速達到500rpm時，以20ml/min流速泵進流動相，待流動相流出，兩相溶劑體系在色譜柱內達到平衡時，取樣品溶液通過六通閥進樣200ml，開啟8823B紫外檢測器，然後根據N2000色譜工作站色譜圖分段收集含他克莫司的主峰，且每3min收集一瓶；當含他克莫司的主峰出完後，再次進樣，連續進樣15次,且對每次進樣後的含他克莫司的主峰均每3min收集一瓶。合併收集到的收集液，並採用BUCHI旋轉蒸發儀減壓濃縮，濃縮所得的濃縮液採用乙酸乙酯萃取兩次，之後所得乙酸乙酯萃取液用BUCHI旋轉蒸發儀濃縮至粘稠狀，接著將濃縮後的乙酸乙酯萃取液倒入燒杯，並往燒杯內加入熱乙醚， 攪拌溶解後置於O V結晶並過濾，過濾得到的晶體用冷乙醚洗晶，然後將晶體進行60°C真空乾燥，得到粉末即產品，最後產品經LC-2010A高效液相色譜儀檢測得知，產品中他克莫司含量達到99. 3% (即產品純度高達99. 3%)、子囊黴素含量O. 19%、二氫他克莫司含量O. 16%、收率為61. 1%。綜上，通過本發明純化方法的操作步驟，不僅能夠獲得純度高達99.0%以上的他克莫司產品，且具有較高的純化收率，從而可降低工業化的成本；採用連續進樣的方式，使得一次逆流可以分離的樣品量提升至IOOg ;另外，在連續的逆流生產過程需要大量的流動相，只需要少量固定相，本發明採用了根據需要單獨配製固定相和流動相，不僅節省了大量溶劑，且因溶劑無需靜置，從而節省了時間。
權利要求
1.一種他克莫司粗品的純化方法，其特徵在於該純化方法包含如下具體步驟 (O用第一混合有機溶劑溶解他克莫司粗品以獲得濃度為5-40g/L他克莫司粗品溶液，之後將該他克莫司粗品溶液進行超聲振蕩，超聲頻率40KHz，超聲時間30-60min ;所述第一混合有機溶劑由甲基叔丁基醚、甲醇和水按100 110:340 380:275 305的體積比混合而成； (2)將步驟(I)超聲結束後的他克莫司粗品溶液進行快速濾紙抽濾，抽濾所得的濾液即樣品溶液採用製備型高速逆流色譜儀進行連續純化並收集含他克莫司的主峰； (3 )合併步驟(2 )收集所得的收集液，之後依次進行減壓濃縮、有機溶劑萃取、濃縮萃取液並重結晶以獲得產品。
2.根據權利要求I所述的他克莫司粗品的純化方法，其特徵在於所述步驟(2)中製備型高速逆流色譜儀的色譜條件為 製備型高速逆流色譜儀上海同田生物技術有限公司生產的TBE-5000A型製備型高速逆流色譜儀； 溶劑體系單獨配置流動相與固定相；其中流動相為所述第一混合有機溶劑；固定相為第二混合有機溶劑，且該第二混合有機溶劑由體積比為13 16:11 13. 5:0. 9 I. I的正己烷、甲基叔丁基醚和甲醇組成； 進樣方式連續進樣； 主機轉速450-500rpm ； 流動相流速20-25ml/min ； 檢測波長254nm ； 製備溫度20-25 °C ； 在線檢測軟體N2000色譜工作站。
3.根據權利要求I或2所述的他克莫司粗品的純化方法，其特徵在於所述步驟(2)中採用製備型高速逆流色譜儀純化的過程為將所述固定相以75-100ml/min的流速裝滿色譜分離柱，然後開啟速度控制器使逆流色譜儀按順時針方向旋轉，當主機轉速達到450-500rpm時，以20_25ml/min流速泵進該流動相，待流動相流出且兩相溶劑體系在色譜柱內達到平衡時，取所述樣品溶液進樣200ml，然後分段收集含他克莫司的主峰。
4.根據權利要求2所述的他克莫司粗品的純化方法，其特徵在於所述第二混合有機溶劑的製備過程為將正己烷、甲基叔丁基醚和甲醇按體積比13 16:11 13. 5:0. 9 I.I混合攪拌20-30min，之後採用40KHz頻率的超聲波脫氣20_30min即可。
5.根據權利要求I所述的他克莫司粗品的純化方法，其特徵在於所述步驟(3)中的有機溶劑為乙酸乙酯或乙酸丁酯。
6.根據權利要求I所述的他克莫司粗品的純化方法，其特徵在於所述步驟(3)中重結晶的具體操作為在濃縮後的萃取液中加入熱乙醚，攪拌溶解後置於0-5°C結晶，結晶獲得的晶體採用冷乙醚洗晶，之後將晶體進行50-60°C真空乾燥，得到產品。
全文摘要
本發明提供一種他克莫司粗品的純化方法，將他克莫司粗品經第一有機溶劑溶解並超聲振蕩後，採用快速濾紙抽濾，之後把抽濾所得的濾液即樣品溶液通過製備型高速逆流色譜儀進行連續純化並收集含他克莫司的主峰，然後合併收集到的收集液，接著依次進行減壓濃縮、有機溶劑萃取、濃縮萃取液並重結晶以獲得產品。本發明不僅能夠獲得高純度的他克莫司，且具有較高的純化收率，從而可降低工業化的成本。
文檔編號C07D498/18GK102863458SQ20121035357
公開日2013年1月9日 申請日期2012年9月20日 優先權日2012年9月20日
發明者溫耀明, 鄭衛, 肖麗華, 樂佔線, 莊鴻 申請人:福建省微生物研究所