亞硝基化合物及其作為自旋捕集劑的用途的製作方法

2023-05-11 06:02:41 1

專利名稱：亞硝基化合物及其作為自旋捕集劑的用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及新的亞硝基化合物及其作為自旋捕集劑的用途。
Jansen等人，JACS(1968)905909-10創建了該技術。此後，已經有許多關於適合的自旋捕集劑的合成研究。最常使用的自旋捕集劑是在與自由基的反應中形成氮氧化物(nitroxide)的那些。
可商購的自旋捕集劑是3，5-二溴-4-亞硝基苯磺酸酯的鈉鹽(DBNBS)。參見Kaur等人，JCS Chem.Comm.(1981)142-3。DBNBS是水溶性芳香族C-亞硝基自旋捕集劑，已經報導了其捕獲了亞硫酸根陰離子(SO3-)、超氧化物、烷基、一氧化氮和亞硒酸陰離子基團。還報導了當將DBNBS氧化成能通過ESR光譜學檢測的基團陽離子DBNBS+時，DBNBS就能在尿毒症病人的血漿中檢測到氧化類物質。參見Roselaar等人，國際腎學雜誌(KidneyInternational)(1995)48199-206，和WO-A-92/18874。
Reist等人，FEBS Lett.(1998.423231-4)，公開了亞硫酸鹽對肺是有毒的，並且能引起變態反應如哮喘症中的支氣管縮窄。Reist等人，腎病學雜誌(J.Nephrology)(1998)712431-8報導了亞硫酸鹽同過硝酸鹽結合對神經元細胞的毒性作用。因此，對於亞硫酸鹽來說，有效的自旋捕集劑具有很大潛在的價值。
Matsuo等人，游離基生物與醫學(Free Radical Biology and Medicine)(1998)25929-35，報導了對於B型肝炎表面(HBs)抗原檢測非常靈敏的『ELISA-ESR』方法，該方法使用4-亞肼基甲基-1-羥基-2，2，5，5-四甲基-3-咪唑啉-3-氧化物(HHTIO)作為自旋捕集劑。在該方法中，用第一HBs抗體包被玻璃珠，並且用辣根過氧化物酶(HRP)標記第二HBs抗體。在HBs抗原的存在下，HRP標記的抗體將同抗原連接，抗原同玻璃珠連接。在洗滌之後，將抗原-抗體複合物加入到含有對乙醯氨基苯酚(p-AP)、過氧化氫和HHTIO的溶液中。在過氧化氫的存在下，通過HRP作用將p-AP轉化為苯氧基，用HHTIO捕集苯氧基以形成穩定的能通過ESR光譜學檢測的氮氧基(nitroxide radical)。
DCNBS至少有幾個優於DBNBS的優點。這些優點包括改進了自旋捕集劑在含水系統中的溶解性和較狹窄的ESR信號(其將導致較大的信/噪比)。
已經使用DCNBS成功地檢測了腎衰竭患者的滲析液中的氧化劑(氧化劑將DCNBS氧化為其基團陽離子DCNBS+，接著通過ESR光譜學進行檢測)。
DCNBS將捕獲一氧化氮。並且其還是對烷基自由基、過氧化物和亞硒酸根陰離子(SeO3-)來說的潛在的自旋捕集劑。
就亞硫酸根陰離子(SO3-)來說，發現DCNBS是比DBNBS具有更大靈敏度的自旋捕集劑。同樣DMNBS優於DBNBS或其同位素類似物(15N和d2)或DCNBS。對SO3-加合物來說，用DMNBS獲得的ESR信號比用DBNBS獲得的多20倍。
因此，DMNBS作為亞硫酸根陰離子的自旋捕集劑具有巨大的潛能。此外，DMNBS可用作通過ESR檢測ELISAs中抗體-過氧化物酶複合物存在的檢測器分子。
DCNBS和DMNBS可以如DBNBS一樣以相同的方式配製和使用。下面描述它們的合成和應用。
例如，可以用本發明的化合物分析任何適合的存在亞硫酸鹽陰離子、一氧化氮、烷基自由基或過氧化物的樣品。還可用本發明的化合物分析尿毒症患者滲析液中的氧化劑。並且參見英國專利申請No.0024938.3。
在本發明的分析中，可以通過ESR光譜學檢測基團。
在本發明特別的實施方案中，在上述的ELISA-ESR分析中，可以用DMNBS代替HHTIO。基於同樣的原理，通過HRP的作用(圖2)，由亞硫酸鹽、過氧化氫和DMNBS的反應混合物可形成DMNBS-SO3-加合物。許多HRP標記的抗體是普遍有效的。初步的結果暗示了DMNBS分析優於HHTIO分析，這表明本發明的化合物可用作通過ESR檢測ELISAs中抗體-過氧化物酶複合物存在的檢測器分子。
下面的實施例闡明了本發明化合物的製備。接下來的測試闡明了其應用。
在SO3-體系中，通過DBNBS和DCNBS測量基團形成的程度。當DBNBS同辣根過氧化物酶/過氧化氫/亞硫酸鹽反應時，在上面指定的ESR條件下能觀測到成對的三重峰。三重峰是由於在DBNBS分子中苯環4位的氮超精細分裂，成對是由於在苯環2和6位的氫超精細分裂。當用DCNBS代替DBNBS時，較小的氯原子代替了大的溴原子，這將引起信號線寬度從0.087到0.085mT的下降。
在SO3-體系中，DBNBS在17.72mM、DCNBS在20-25mM達到了最佳濃度。因此在這些濃度處比較自旋捕集劑的靈敏度。各自的信號/標記比率為3.33和10.62，這表明DCNBS比DBNBS的靈敏度大3倍。
當以捕獲亞硫酸根陰離子(SO3-)(由HRP，過氧化氫，SO32-產生)的方式來比較水溶性的自旋捕集劑DMNBS，DCNBS，DBNBS，DBNBS-d2，DBNBS-15N和DBNBS-d2-15N時，發現DMNBS獲得最大的ESR信號。發現該信號的高度比DBNBS獲得的大20倍。而且還發現比用同位素標記的DBNBS類似物DBNBS-d2-15N多3倍。因此DMNBS是對亞硫酸根陰離子特別有用的自旋捕集劑。
一氧化氮的反應用氮氣將

圖1所示的儀器衝洗15分鐘。然後將含有去離子水(4毫升)的vacutainer同系統連接，再用氮氣衝洗15分鐘，以除去在系統中存在的任何氧氣，因而阻止了二氧化氮的形成。使NO氣體經系統鼓泡通過去離子水45分鐘。通過鼓泡通過兩瓶2M氫氧化鈉除去在加壓的一氧化氮容器中存在的少量的二氧化氮。然後，將氣體鼓泡通過含有去離子水的洗瓶以除去任何鹼性的氣溶膠汙物。在去離子水步驟之後，將過量的一氧化氮鼓泡通過含有1M高錳酸鉀/1M氫氧化鈉的洗瓶，以阻止過量的一氧化氮從通風櫥中逸出。在得到的一氧化氮飽和的水中，一氧化氮的濃度為2.0mM。自旋捕集劑溶液將DBNBS、DCNBS和DMNBS樣品稱重放入vacutainer，蒸發。Tris-HCl緩衝液，0.01M，pH7.4，通過用氮氣鼓泡15分鐘去氧。通過氣體密封的注射器將去氧的緩衝液加入自旋捕集劑中，得到最後的自旋捕集劑的濃度為0.30M。將該自旋捕集劑溶液簡單地用氮氣衝洗，然後備用。時程將一氧化氮飽和的水(1毫升)加入每個1毫升自旋捕集劑溶液(DBNBS、DCNBS和DMNBS)中。自旋捕集劑的最終濃度為0.15M，一氧化氮為1mM。通過將1毫升去氧水加入自旋捕集劑溶液中得到平行空白液。在每一個時間點，從待測溶液中取出樣品，用ESR光譜分析該樣本和空白液，該空白液作為光譜的基準物。
時程試驗表明在使用的條件下，DBNBS(0.15M)同一氧化氮(1.0mM)的反應很慢。發現DBNBS同一氧化氮的反應在約50小時達到最大。發現DMNBS同一氧化氮的反應在24-28小時達到最大。發現DCNBS同一氧化氮的反應進行的最快，在20-24小時達到最大。自旋捕集劑的劑量反應如上製備自旋捕集劑溶液，獲得反應混合物中最終濃度為0.05，0.1，0.15，0.2和0.25M和平行空白液。將一氧化氮飽和的溶液(0.5毫升，最終濃度1mM)加入測試溶液中，將去氧水(0.5毫升)加入空白液中。在用ESR光譜學分析之前，將具有DBNBS的反應混合物溫育26小時，而具有DCNBS的反應混合物溫育22小時。分別將空白液作為其平行測試光譜的基準物。靈敏性研究在濃度為0.15M的DBNBS處得到DBNBS同一氧化氮反應的最大信號強度。就DCNBS同一氧化氮反應來說，在0.05-0.40M的DCNBS處觀測到平頂。因此被選擇用來評價DBNBS和DCNBS同一氧化氮反應的靈敏度的濃度是0.15M。
在一氧化氮飽和的水中，一氧化氮的濃度是2.0mM。用去氧水稀釋該一氧化氮溶液，得到反應混合物中最終濃度為0，0.25，0.5，1，2.5，5，10，50和100μM。將一氧化氮溶液加入DBNBS和DCNBS中，得到最終自旋捕集劑的濃度為0.15M。通過向自旋捕集劑溶液中加入0.5毫升去氧水，得到空白液(或零點)。將含有DBNBS的反應混合物溫育50小時，含有DCNBS的溫育20小時。從每一個光譜計算信/噪比。溶液的取出和加入都是使用氣體密封的注射器進行。
從曲線的直線部分從0-10μM計算檢測界限(信/噪比等於3)和定量界限(信/噪比等於10)。發現對於DCNBS，測量界限和定量界限各自為4.06μM和17.30μM。發現對於DBNBS，測量界限是0.23μM，定量界限是0.92μM。因此就一氧化氮來說，發現DBNBS是比DCNBS更加靈敏的自旋捕集劑，而發現DCNBS同一氧化氮的反應比DBNBS更快。氧化劑反應該研究使用來自腎衰竭患者的在不臥床連續腹膜透析(CAPD)中的滲析液。當更換滲析液袋時收集滲析液。
將10mM的DBNBS和DCNBS的溶液(5、8、12、25和30微升，最終濃度為0.5、0.8、1.2、2.5和3.0mM)加入到60微升的滲析液中。體積方面的區別在於PBS。將反應混合物徹底混合，在室溫下溫育25分鐘後進行ESR光譜學分析。
當DBNBS和DCNBS同氧化劑反應時，獲得典型的三線ESR信號。當DCNBS代替DBNBS時，觀測到峰寬從0.495下降為0.306mT。在ESR光譜學中，峰寬的降低一般被認為是有利的，因為其可以導致靈敏度增加。
為了比較DBNBS和DCNBS的靈敏度，應當使用過量的自旋捕集劑。劑量反應實驗表明在氧化劑系統中，DBNBS在最終額定濃度大約為1.2mM時達到過量，而DCNBS在最終額定濃度大約為2.5mM時達到過量。因此DBNBS和DCNBS的靈敏度各自在1.2mM和2.5mM時進行比較。發現它們獲得了幾乎一致的結果，即各自的信號/標誌比(signal/marker ratios)為0.516和0.521。DCNBS具有的優點是其比DBNBS更易溶，所以DCNBS不會遇到渾濁問題。因此對於分析尿毒症患者滲析液中的氧化劑來說，DCNBS是優選的自旋捕集劑。
權利要求
1.一種下式的化合物或者其鹽，其中X是Cl或CH3。
2. 3，5-二氯-4-亞硝基苯磺酸酯或者其鹽。
3.根據權利要求2的化合物，所述化合物為3，5-二氯-4-亞硝基苯磺酸酯的鈉鹽。
4. 3，5-二甲基-4-亞硝基苯磺酸酯或者其鹽。
5.根據前述權利要求任何一項的化合物，所述化合物被同位素標記。
6.根據權利要求5的化合物，其中同位素是2H或者15N。
7.根據前述權利要求任何一項的化合物作為自旋捕集劑的用途。
8.根據權利要求7的用途，用於分析亞硫酸根陰離子、尿毒症患者滲析液中的氧化劑、一氧化氮、烷基自由基或過氧化物。
9.根據權利要求7的用途，用於分析酶聯免疫吸附試驗中抗體-過氧化物酶配合物的存在。
10.根據權利要求7-9任何一項的用途，在分析中，其中通過電子自旋共振光譜學來檢測基團。
全文摘要
一種右式的化合物或者其鹽,其中X是Cl或CH
文檔編號C12Q1/28GK1362405SQ0114544
公開日2002年8月7日 申請日期2001年12月12日 優先權日2000年12月12日
發明者L·漢密爾頓, P·G·溫亞德 申請人:蘭道克斯實驗有限公司